基于指紋圖譜結合化學計量法對何首烏不同炮制品多指標成分分析

張 濤，張 青，易海燕，萬 全，謝亞婷，黃 敏，康愛圓，陳明霞, 3*，陳華師，蔡仲希，張金蓮*

基于指紋圖譜結合化學計量法對何首烏不同炮制品多指標成分分析

張 濤1，張 青2，易海燕1，萬 全1，謝亞婷1，黃 敏1，康愛圓1，陳明霞2, 3*，陳華師2，蔡仲希2，張金蓮1*

1. 江西中醫藥大學藥學院，江西 南昌 330004 2. 建昌幫藥業有限公司，江西 撫州 344100 3. 北京斯利安藥業有限公司，北京 100176

建立3個主產地何首烏、炆何首烏、制何首烏共30批樣品的HPLC指紋圖譜及多成分含量測定方法，結合化學計量法對其進行質量評價。采用HPLC建立何首烏及其炮制品的指紋圖譜并進行6種成分的含量測定，通過層次聚類分析（clustering analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）評價不同批次何首烏的質量差異，找尋不同炮制品間質量差異性的主要成分。30批何首烏、炆何首烏、制何首烏的HPLC指紋圖譜中有20個共有峰，指認了6個共有峰，峰面積占比均在75%以上。沒食子酸（峰1）、二苯乙烯苷（峰8）、大黃素-8--葡萄糖苷（峰14）、大黃素甲醚-8--葡萄糖苷（峰16）、大黃素（峰19）、大黃素甲醚（峰20）質量分數分別在0.59～5.86、4.64～25.83、0.03～3.11、0.01～0.59、0.07～1.98、0.25～1.81 mg/g。方法學考察結果顯示，各成分在線性關系良好（≥0.999 7），平均回收率為97.80%～101.51%。指紋圖譜相似度結果顯示，何首烏及其2種炮制品各自10批的相似度均在0.99以上，但不同類型炮制品的相似度降低。HCA可將3者聚為3類，PCA結果提取了3個主成分，OPLS-DA能有效地將3種飲片明顯區分，并根據VIP＞1的原則篩選出了6種主要差異成分，共指認了大黃素甲醚-8--葡萄糖苷、大黃素-8--葡萄糖苷、沒食子酸、大黃素甲醚4種與何首烏炮制品質量相關性較強的化學成分。建立的何首烏及其炮制品HPLC指紋圖譜結合化學計量法的方法簡便準確，可為特色飲片炆何首烏的質量控制和品質評價提供參考依據。

何首烏；建昌幫炆法；藥典法；HPLC；指紋圖譜；多指標成分；化學模式識別；沒食子酸；二苯乙烯苷；大黃素-8--葡萄糖苷；大黃素甲醚-8--葡萄糖苷；大黃素；大黃素甲醚；聚類分析；主成分分析；正交偏最小二乘-判別分析；質量控制；品質評價

何首烏為蓼科何首烏屬植物何首烏Thunb.的干燥塊根，主產于廣東、貴州、云南等地，《本草求原》載“產德慶州者良”[1-3]。何首烏生品具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便等功效；炮制后性味、功效發生改變，可補肝腎，益精血，烏須發，強筋骨，化濁降脂，是古今醫家常用的滋補良藥。何首烏“生瀉熟補”，可見炮制對其化學成分和藥理作用產生顯著的影響，但研究發現不同炮制方法使得何首烏化學成分變化和藥效存在明顯的差異[4-5]。

炆何首烏是江西“建昌幫”特色飲片之一，與炆地黃、炆黃精、炆遠志收錄于《江西省中藥飲片炮制規范》2008年版[6]。《建昌幫中藥炮制全書》[7]記載：“何首烏經炆制、蒸制能消除滑腸致瀉作用、增強滋補之力，酒制能增強溫補之力”。但目前炆何首烏化學成分和藥理作用的相關研究甚少，炮制機制仍不明確。《中國藥典》2020年版以二苯乙烯苷和游離蒽醌為制何首烏的質控指標，而《江西省中藥飲片炮制規范》2008年版僅以二苯乙烯苷為質控指標，此要求不能較全面地體現特色飲片炆何首烏的有效性和專屬性。

中藥活性成分復雜多樣，單個指標無法體現藥物的整體質量。指紋圖譜可在整體上對中藥化學特征進行表征，結合化學計量法全面、系統的特點，而被廣泛用于中藥不同基原、不同炮制品及經典名方的質量評價研究[8-10]。前人已對不同產地的何首烏、制何首烏進行指紋圖譜和含量測定研究，但未見炆何首烏等不同炮制品指紋圖譜及多成分含量測定的比較研究[11-13]。故本研究在前期對炆何首烏等不同炮制品揮發性成分研究的基礎上[14]，通過HPLC指紋圖譜、有效成分的含量測定與層次聚類分析（clustering analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares- discriminant analysis，OPLS-DA）等化學計量模式識別法對3個主產地，共30批何首烏及其不同炮制品飲片進行質量分析研究，為多指標的復雜含量測定與指紋圖譜相結合的方法評價何首烏不同炮制品質量提供有效的參考，同時也為其他中藥的不同炮制品質量評價提供新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Milli QB型超純水凈化系統，美國Millipore公司；Waters 2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司，Empower色譜工作站；KQ5200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；AE240型十萬分之一電子天平，美國Mettle公司；OHAUS型萬分之一分析天平，奧豪斯國際貿易（上海）有限公司。

1.2 試劑

沒食子酸（批號CHB-M-037）、二苯乙烯苷（批號CHB210107）、大黃素（批號CHB201201）、大黃素甲醚（批號CHB201204）、大黃素-8--葡萄糖苷（批號CHB201203）、大黃素甲醚-8--葡萄糖苷（批號CHB201206）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司，質量分數均≥98%；水為屈臣氏蒸餾水；甲醇（批號63Y1706TE）、磷酸（批號H2020219）均為色譜純，均購自美國ACS恩科化學公司。

1.3 材料

何首烏飲片、黑豆均來源于江西省建昌幫藥業有限公司，經江西中醫藥大學中藥資源教研室鄧可眾教授鑒定，分別為蓼科何首烏屬植物何首烏Thunb.的干燥塊根、豆科植物大豆(L.) Merr.的干燥成熟種子。炆何首烏、制何首烏分別按照《江西省中藥飲片炮制規范》2008年版[2]和《中國藥典》2020年版[1]相應規定加工制作而成，樣品信息見表1。

表1 何首烏飲片產地及批號信息

2 方法與結果

2.1 炮制品的制備

2.1.1 炆何首烏 取凈何首烏塊，浸泡過夜至內無干心，與黑豆放入炆藥罐內，加入40～50 ℃溫水，上蓋，移至圍灶內，罐四周放置木炭和干糠（每100 kg何首烏，用木炭5 kg、干糠80 kg）點燃后炆24 h，至糠盡灰冷，取出；65 ℃烘箱干燥至七成干；再用剩余藥汁和黃酒拌勻，待吸盡后，蒸6 h，停火密閉1夜，取出，置烘箱干燥至干。每100 kg何首烏，用黑豆10 kg、黃酒20 kg。

2.1.2 制何首烏 取何首烏塊，照蒸法（《中國藥典》通則0213），加入黑豆汁拌勻吸盡后，連續蒸制使飲片內外均呈棕褐色，取出，置65 ℃烘箱干燥至干。每100 kg何首烏，用黑豆10 kg。黑豆汁制法：取黑豆10 kg，加水適量，煮約4 h，熬汁約15 kg，豆渣再加水煮約3 h，熬汁約10 kg，合并得黑豆汁約25 kg。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取何首烏及其炮制品過4號篩粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質量，水浴回流1 h，放冷，用甲醇補足減失的質量，取續濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得何首烏及其炮制品供試品溶液。另取“2.1.2”項下黑豆汁，取續濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得黑豆汁供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚、大黃素-8--葡萄糖苷、大黃素甲醚-8--葡萄糖苷對照品適量，用純甲醇溶解，制成含沒食子酸5.6 μg/mL、二苯乙烯苷168.1 μg/mL、大黃素-8--葡萄糖苷73.9 μg/mL、大黃素甲醚-8--葡萄糖苷56.4 μg/mL、大黃素41.8 μg/mL、大黃素甲醚132.6 μg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.3 色譜條件

Phenomenex C18色譜柱（250 mm×4.6 μm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～6 min，10%～18%甲醇；6～23 min，18%～48%甲醇；23～28 min，48%甲醇；28～44 min，48%～80%甲醇；44～46 min，80%～90%甲醇；46～60 min，90%甲醇；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長：280 nm（二苯乙烯苷、沒食子酸）、254 nm（大黃素、大黃素甲醚、大黃素-8--葡萄糖苷、大黃素甲醚-8--葡萄糖苷）。

2.4 指紋圖譜的構建

2.4.1 精密度試驗 取何首烏樣品（S1），按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續進樣6次，以8號峰（二苯乙烯苷）為參照峰，計算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示各共有峰相對保留時間的RSD＜0.93%，相對峰面積的RSD小于2.99%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 取何首烏樣品（S1），按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h按“2.3”項下色譜條件測定，以8號峰（二苯乙烯苷）為參照峰，結果顯示各共有峰相對保留時間的RSD＜0.48%，相對峰面積的RSD＜2.67%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗 取何首烏樣品（S1），按“2.2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液。按“2.3”項下色譜條件測定，以8號峰（二苯乙烯苷）為參照峰，結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD＜0.28%，相對峰面積的RSD＜2.37%，表明該方法重復性良好。

2.4.4 HPLC指紋圖譜的建立 將30批何首烏及其炮制品樣品，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3”項下的色譜條件測定。將30批何首烏及其炮制品指紋圖譜數據導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度軟件評價系統（2012版）》，以樣品S1為參照圖譜，采用中位數法，時間窗寬度為0.2 min，通過多點校正進行峰匹配，生成何首烏、炆何首烏、制何首烏的指紋圖譜，結果見圖1。結果30批樣品共得到20個共有峰，經過與混合對照品溶液的色譜圖比對，確定色譜峰1、8、14、16、19、20分別為沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素-8--葡萄糖苷、大黃素甲醚-8--葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚。此外，22號峰為炆何首烏獨有，24、27號峰為何首烏獨有，28號峰為制何首烏獨有；21、23號峰為炆何首烏和制何首烏共有，25、26號峰為何首烏和制何首烏共有。對照指紋圖譜、何首烏、炆何首烏、制何首烏及混合對照品溶液的色譜圖見圖2。

取黑豆樣品，按“2.1.2”項下方法制備黑豆汁，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣，將所得色譜圖與何首烏、炆何首烏、制何首烏相比較，結果發現4者有10個共有峰，見圖3。

圖1 30批何首烏、炆何首烏和制何首烏飲片HPLC指紋圖譜

2.5 相似度分析

將何首烏及其炮制品的色譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》，分別計算各自10批及總30批樣品的相似度，結果見表2。

結果可得，與對照指紋圖譜（R）相比，何首烏、炆何首烏、制何首烏各10批的指紋圖譜相似度均＞0.99，說明同一飲片不同批次間整體質量較穩定；在總30批中，何首烏、炆何首烏、制何首烏的相似度分別為0.893～0.925、0.799～0.892、0.976～0.993，可見不同類型炮制品的相似度降低。

2.6 HCA

以30批何首烏、炆何首烏和制何首烏20個共有峰峰面積為變量，運用SPSS 21.0統計軟件，采用組間聯接法及皮爾遜相關性作為分類依據進行HCA，聚類結果見圖4。當分類距離為5時，何首烏、炆何首烏和制何首烏各10批可自分為一類；當分類距離為10時，30批樣品聚為2類，20批何首烏和制何首烏聚為一類，10批炆何首烏聚為一類，與相似度結果可相互佐證。

1-沒食子酸 8-二苯乙烯苷 14-大黃素-8-O-葡萄糖苷 16-大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷 19-大黃素 20-大黃素甲醚

圖3 黑豆汁與何首烏及其炮制品HPLC圖譜

2.7 PCA

將3個產地共30批何首烏、炆何首烏、制何首烏飲片20個共有峰的相對峰面積導入SIMCA 14.1軟件進行無監督模式的PCA分析，觀察樣品間自然聚集，結果見圖5。根據PCA得分圖，30批何首烏、炆何首烏和制何首烏各自聚集，可分為3類，說明何首烏炮制前后成分發生明顯的改變且不同炮制方法對成分的影響顯著不同；何首烏與制何首烏的點較接近，與炆何首烏相聚較遠，與HCA結果一致。

2.8 OPLS-DA

在PCA的基礎上，將30批何首烏、炆何首烏、制何首烏飲片共有峰峰面積導入SIMCA 14.1軟件進行OPLS-DA，進一步分析不同產地何首烏及其炮制品飲片的差異性，樣本得分矩陣見圖6-A。該模型解釋率參數2為0.964，預測能力參數2為0.954，表明建立的數學模型穩定且預測能力較強。從OPLS-DA得分圖可得，何首烏、炆何首烏、制何首烏聚類效果較好，分為明顯的3類，與HCA和PCA結果一致。根據變量重要性投影（VIP）值＞1的原則，篩選差異組分，見圖6-B。結果共找到了6個成分，VIP值大小排序依次為15、16（大黃素甲醚-8--葡萄糖苷）、14（大黃素-8--葡萄糖苷）、17、1（沒食子酸）、20（大黃素甲醚）號峰是引起何首烏不同炮制品成分差異的主要標志性成分。

表2 30批何首烏、炆何首烏、制何首烏樣品圖譜相似度

圖4 不同產地何首烏及其炮制品指紋圖譜聚類分析樹狀圖

2.9 多成分含量測定

2.9.1 線性關系考察 取“2.2.2”項下各對照品溶液適量，按倍數用甲醇稀釋6次，得系列對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定，進樣量10 μL。以對照品質量濃度為橫坐標（），以對照品峰面積為縱坐標（）繪制標準曲線，進行線性回歸，得到6種成分的回歸方程及線性范圍分別為沒食子酸＝329 971－12 674，＝0.999 7，線性范圍0.090～0.403 μg/mL；二苯乙烯苷＝527 074－124 558，＝0.999 7，線性范圍1.424～6.408 μg/mL；大黃素- 8--葡萄糖苷＝64 764＋9284，＝0.999 7，線性范圍0.049～0.164 μg/mL；大黃素甲醚-8--葡萄糖苷＝57 128－1 792.7，＝0.999 7，線性范圍0.035～0.157 μg/mL；大黃素＝908 059－4 178.2，＝0.999 9，線性范圍0.210～0.994 μg/mL；大黃素甲醚＝377 077－23 826，＝0.999 8，線性范圍0.224～1.008 μg/mL。

圖5 不同產地何首烏及其炮制品指紋圖譜PCA得分圖

圖6 不同產地何首烏及其炮制品指紋圖譜OPLS-DA得分圖(A)和VIP圖(B)

2.9.2 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液10 μL，照上述“2.3”項下色譜條件進行分析，連續進樣6次，記錄各成分峰面積，結果沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素-8--葡萄糖苷、大黃素甲醚-8--葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚的RSD分別為2.11%、1.59%、0.23%、2.48%、0.15%、0.20%，表明儀器精密度良好。

2.9.3 穩定性試驗 取何首烏藥材（S1），按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，照上述“2.3”項下色譜條件進行分析，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄各成分峰面積，結果沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素-8--葡萄糖苷、大黃素甲醚-8--葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚的RSD分別為1.21%、0.40%、1.04%、2.36%、1.02%、1.87%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.9.4 重復性試驗 取何首烏藥材（S1），平行6份，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，照上述“2.3”項下色譜條件進行分析，記錄各成分峰面積，結果沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素-8--葡萄糖苷、大黃素甲醚-8--葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚的質量分數均值依次分別為0.78、17.14、2.20、0.45、0.17、0.32 mg/g，RSD分別為2.45%、0.28%、1.05%、1.89%、0.48%、1.49%，表明本方法重復性良好。

2.9.5 加樣回收率試驗 精密稱定已測定指標成分含量的何首烏藥材樣品粉末（S1），分別精密加入與樣品中待測成分已知含量相當的0.5、1.0、1.5倍混合對照品溶液，每個梯度平行3份，按“2.2.1”項下制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素-8--葡萄糖苷、大黃素甲醚-8--葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚峰面積，并計算平均加樣回收率分別為100.92%、98.94%、101.51%、97.80%、100.11%、98.63%，RSD分別為1.77%、2.20%、2.03%、3.05%、2.70%、1.62%。

2.9.6 樣品測定 取30批何首烏、炆何首烏、制何首烏藥材按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行測定，計算各成分含量（按干燥品計算），結果見表3。

2.9.7 成分分析 將何首烏、炆何首烏、制何首烏各10批的6個成分含量測定結果導入SPSS 21.0進行顯著性分析，3者各成分的含測結果平均值和顯著性見表4。

2.9.8 峰占比 將何首烏、炆何首烏、制何首烏各10批的6種成分峰面積相加，計算其所占總峰面積的比例，見表5。取6種成分在30批何首烏及其炮制品的峰面積均值，計算其所占總峰面積均值的比例，見表6。

表3 樣品含量測定結果(n = 3)

“?”表示低于定量限

“?”below the limit of quantitation

3 討論

3.1 樣品提取方法與色譜條件考察

在前期研究中，本實驗考察了以超純水及25%、50%、75%、100%甲醇作為提取溶劑，超聲、回流兩種提取方式，30、40、50、60 min提取時間，1∶50、1∶30、1∶10物料比，以出峰個數、峰形、分離度、峰面積為考察依據，結果發現采用100%甲醇，回流提取60 min，料液比為1∶50的提取方法較優。在此基礎上，考察了色譜條件，以甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相，25、30、35 ℃柱溫，0.8、1.0、1.2 mL/min體積流量，并對色譜進行全波長掃描，發現280 nm（二苯乙烯苷、沒食子酸）、254 nm（大黃素、大黃素甲醚、大黃素-8--葡萄糖苷、大黃素甲醚-8--葡萄糖）在甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相、30 ℃柱溫、1.0 mL/min體積流量下的色譜峰峰形較好，出峰穩定，吸收強度高。

表4 何首烏、炆何首烏、制何首烏含量平均值及顯著性(, n = 10)

Table 4 Average value and significance of content of PMR, BPMR, and PMRP (, n = 10)

表4 何首烏、炆何首烏、制何首烏含量平均值及顯著性(, n = 10)

樣品質量分數/(mg?g?1)沒食子酸二苯乙烯苷大黃素-8-O-葡萄糖苷大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷大黃素大黃素甲醚 何首烏0.79±0.1319.84±2.762.23±0.410.45±0.090.18±0.120.35±0.09 炆何首烏4.56±1.00**##6.99±1.67**##0.07±0.01**##0.01±0.00**##1.31±0.43**##1.24±0.36**## 制何首烏1.73±0.22**16.57±3.84*2.16±0.460.44±0.100.68±0.18**0.71±0.13**

與何首烏組比較：*＜0.05**＜0.01；與制何首烏組比較：##＜0.01

*＜0.05**＜0.01PMR group;##＜0.01PMRP group

表5 6種成分峰面積之和占比

表6 6種成分峰面積均值占比

3.2 指紋圖譜及模式識別分析

本實驗在指紋圖譜相似度評價的基礎上，采用HCA、PCA、OPLS-DA等化學計量法綜合評價何首烏及其2種炮制品的質量。在指紋圖譜相似度中，何首烏、炆何首烏、制何首烏各自10批的指紋圖譜相似度均＞0.99，說明同類飲片不同批次間成分群差異不顯著，相同炮制品的整體質量較穩定；在總30批中，何首烏、炆何首烏、制何首烏的相似度分別為0.893～0.925、0.799～0.892、0.976～0.993，可見不同類型炮制品的相似度降低。何首烏與制何首烏的圖譜比較接近，而與炆何首烏相差較大，說明何首烏經炆制后其化學成分發生更大的變化。HCA、PCA、OPLS-DA結果與相似度評價結果一致，進一步說明化學計量法用于評價藥材質量的穩定、可靠。

3.3 黑豆對何首烏不同炮制品的影響

黑豆作為何首烏的炮制輔料，應用歷史悠久，在炮制過程中主要有藥材與黑豆交叉鋪放和黑豆汁浸泡兩種應用形式。本研究發現黑豆汁與何首烏及其炮制品有10個共有峰，故輔料黑豆可能通過這10個成分而發揮對炮制品的作用，但其在炆何首烏與制何首烏中的峰面積具有差異性，這可能與輔料黑豆的應用形式有關。后續可采用正交或響應面實驗探討炮制方法、輔料對何首烏化學成分的具體影響。

3.4 指標成分的確定

根據VIP值＞1的原則，本研究發現了6個區分何首烏及其2種炮制品的標志性物質。通過與對照品比對，16、14、1、20號峰分別為大黃素甲醚- 8--葡萄糖苷、大黃素-8--葡萄糖苷、沒食子酸、大黃素甲醚。二苯乙烯苷既是何首烏中特有成分，又是其重要的藥效成分；現代研究表明二苯乙烯苷在神經保護、抗衰老、降血糖等方面有顯著的生物活性[15-17]。

大黃素是何首烏《中國藥典》指標成分之一，具有抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、烏發等藥理作用[18-20]。Ma等[21]通過UPLC-MS/MS技術對何首烏藥代動力學進行研究，發現二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚、大黃素-8--葡萄糖苷、大黃素甲醚-8--葡萄糖苷、沒食子酸等9種成分是何首烏的主要入血成分，其中二苯乙烯苷、大黃素在II期被初級代謝，其他則作為藥物原型代謝。本研究發現6者的峰面積在何首烏、炆何首烏、制何首烏各10批的峰占比均達到75%以上；此外，6種成分在總30批何首烏及其炮制品的峰面積均值占比為83.86%。故選擇這6種成分的含測結果可較為科學、全面地反映飲片質量。

3.5 含量測定分析

與何首烏、制何首烏相比，炆何首烏中沒食子酸、大黃素和大黃素甲醚含量顯著升高；而二苯乙烯苷、大黃素-8--葡萄糖苷、大黃素甲醚-8--葡萄糖苷含量顯著降低。通過查閱文獻可知，何首烏炮制后二苯乙烯苷含量下降與其在光和熱的條件下極不穩定，易分解為順式-二苯乙烯苷的特性有關[22]；結合型蒽醌下降、游離型蒽醌上升，是炮制的過程中結合型蒽醌發生水解生成游離型蒽醌所致[23]；沒食子酸含量上升，可能是可水解鞣質及含有沒食子酰基的苷類成分在高溫下分解的結果[24]。本研究的不足之處之一在于沒有驗證成分變化的具體原因，后續可增加相關實驗加以佐證。

3.6 基于“物-效-毒”的炮制機制分析

何首烏炮制品藥效、毒性作用與其炮制過程中成分變化密切相關。本研究結果顯示，何首烏炮制后結合蒽醌含量下降，游離蒽醌含量上升，且與制何首烏相比，炆何首烏的含量變化具有極顯著性（＜0.01）。研究發現苷類成分在口服后腸吸收之前受到腸內菌叢的首過作用而發生生物轉化生成相應苷元，從而影響化合物的腸吸收和生物學活性[25]。結合蒽醌具有致瀉活性，大黃素、大黃素甲醚等游離蒽醌與保肝作用密切相關[26]，本研究結果顯示與何首烏“生瀉熟補”藥效是一致的。

現代毒理學研究表明大黃素-8--β--葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-- β--葡萄糖苷等蒽醌苷類成分和鞣質是何首烏主要的肝毒性成分[27-30]；而二苯乙烯苷可能與鞣質、蒽醌類具有協同作用而對肝臟造成更加嚴重的損傷[31-32]。但研究表明長時間、大劑量服用何首烏制劑或相關單體才會造成肝損傷，如大黃素及大黃素甲醚-8--葡萄糖苷在濃度≥400 μmol/L時才可能對肝組織產生一定的損害作用[33]。故何首烏各主要成分的含量范圍及比例與其藥效和毒性密切相關，應設置適當的范圍，以保證藥效作用最大而毒性最低。

4 結論

中藥必須經過炮制后入藥是中醫用藥的特點之一，炮制工藝不同，療效也不同，關鍵在于炮制品的內在成分發生不同程度的改變。故規范何首烏的炮制方法，選擇合理的質控指標是推動何首烏及其飲片發展的關鍵因素。本研究通過何首烏及其炮制品的指紋圖譜與含量測定相結合的方法，并結合多元統計法對其信息作進一步綜合分析，清晰地表明了不同何首烏炮制品差異，實現了對何首烏炮制品的全面綜合質量評價。多指標的復雜含量測定與指紋圖譜相結合的方法為評價何首烏不同炮制品質量提供有效的參考，同時也為其他中藥的不同炮制品質量評價提供新思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis on multi-index components ofand its processed products based on fingerprints and chemometrics

ZHANG Tao1, ZHANG Qin2, YIHai-yan1, WAN Quan1,XIE Ya-ting1, HUANG Min1, KANG Ai-yuan1, CHEN Ming-xia2, 3, CHEN Hua-shi2, CAI Zhong-xi2, ZHANG Jin-lian1

1. College of Pharmacy, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 2. Jianchangbang Pharmaceutical Co., Ltd., Fuzhou 344100, China 3. Beijing Scrianen Pharmaceutical Co., Ltd., Beijing 100176, China

To establish fingerprints and multi-component content determination method of 30 batches of(PMR) from three main origins, braised(BPMR), and(PMRP) by HPLC, so as to evaluate its quality in combination with chemometrics method.The fingerprints of PMR and its processed products were established by HPLC and the content of six components was determined. Clustering analysis (HCA), principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares-discrimination analysis (OPLS-DA) were used to evaluate the quality difference of different batches of PMR, and find the main components of the quality difference between different processed products.There were 20 common peaks in the fingerprints of 30 batches of PMR, BPMR and PMRP, and six common peaks were identified, the peak area ratios were all above 75%. The mass fractions of gallic acid (peak 1), stilbene glycosides (peak 8), emodin-8--glucoside (peak 14), emodin methyl ether-8--glucoside (peak 16), emodin (peak 19), and emodin methyl ether (peak 20) ranged from 0.59—5.86, 4.64—25.83, 0.03—3.11, 0.01—0.59, 0.07—1.98 and 0.25—1.81 mg/g, respecitively. The results of methodological investigation showed that the components had a good linear relationship (≥ 0.999 7), and the average recoveries ranged from 97.80%—101.51%. The results of the similarity of fingerprints showed that the similarity of 10 batches of PMR, BPMR and PMRP were all above 0.99, while the similarity between different types of processed products decreased. HCA can cluster PMR and its two processed products into three categories, PCA results extract three main components, OPLS-DA can effectively distinguish the three kinds of decoction pieces, and six main kinds were screened out according to the principle of VIP greater than 1. Four chemical components with strong correlation with the quality of processed PMR were identified, including emodin methyl ether-8--glucoside, emodin-8--glucoside, gallic acid and emodin methyl ether.In this study, the HPLC fingerprint of PMR and its processed products combined with chemometric method is simple and accurate, which can provide a reference for the quality control and quality evaluation of the characteristic decoction pieces of BPMR.

; Jianchangbang braising method; pharmacopoeia method; HPLC; fingerprint; multi-index components; chemical pattern recognition; gallicacid; stilbene glycosides; emodin-8--glucoside; emodin methyl ether-8-- glucoside; emodin; emodin methyl ether; clustering analysis; principal component analysis; orthogonal partial least squares- discriminant analysis; quality control; quality evaluation

R283.6

A

0253 - 2670(2022)15 - 4653 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.008

2022-02-09

國家自然科學基金資助項目（82060724）；江西省重點研發計劃（20192BBG70073）；江西省衛生健康委員會科技計劃項目（202120015）；江西省中藥學一流學科專項（NO.JXSYLXK-ZHYAO039/141）；2022年國家級大學生創新創業訓練計劃項目（202210412288）；企業技術開發項目（2020）

張 濤，男，碩士研究生，研究方向為中藥學。E-mail: 1512337515@qq.com

通信作者：張金蓮，女，教授，博士生導師，主要從事中藥學及中藥炮制學的教學及科學研究。Tel: (0791)87118995 E-mail: jxjzzjl@163.com

陳明霞，女，高級工程師，主要從事中藥新藥及炮制技術研究工作。Tel: 18810958249 E-mail: chenmingxia2003@126.com

[責任編輯 鄭禮勝]