基于質量源于設計（QbD）理念的黃芪甲苷PLGA納米粒制備工藝研究

李姿銳，王一婷，蘭 帆，周素華，李 雅

基于質量源于設計（QbD）理念的黃芪甲苷PLGA納米粒制備工藝研究

李姿銳，王一婷，蘭 帆，周素華，李 雅*

湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208

基于質量源于設計（QbD）理念優化黃芪甲苷PLGA納米粒的處方配比及制備工藝。采用乳化溶劑揮發法制備黃芪甲苷納米粒。以黃芪甲苷納米粒的包封率、載藥量、粒徑大小以及PDI計算總評歸一值（OD值）為評價指標，首先應用Plackett-Burman實驗設計篩選出對黃芪甲苷納米粒性質影響顯著的工藝變量，然后對篩選出的變量應用星點設計-效應面法進一步優化，并對其進行表征評價，考察納米粒的體外釋藥行為。基于QbD理念，通過星點設計-效應面法對關鍵工藝參數（CPPs）進行優化，得到的最優處方總投藥量為5.03 mg、泊洛沙姆濃度為0.48%、W/O體積比為14.33∶1。經驗證黃芪甲苷納米粒的包封率為（68.86±2.90）%，載藥量為（4.78±0.45）%，粒徑為（112.87±4.69）nm，PDI為0.134±0.010，ζ電位（?29.77±1.40）mV，且納米粒呈圓球形，粒子均勻分散，未見粘連聚集，通過體外釋放實驗得知，納米粒體外釋藥規律符合Riger-Peppas釋藥方程模型。基于QbD理念，得到了優化模型的產品，符合預期的QTPP質量穩定、可控，精度高，預測效果較好，制備工藝穩定可行。

黃芪甲苷；納米粒；質量源于設計理念；Plackett-Burman；星點設計-效應面法；體外釋放

缺血性心臟病是一種具有高發病率和高致死率的疾病，病理學定義為心肌細胞因供求灌注失衡長期缺血而死亡，目前尚無有效的臨床治療方法[1-2]。從中草藥中分離高效低毒活性成分，用于心肌梗死防治，是中藥領域治療心血管疾病的一個研究熱點。其中黃芪甲苷是從豆科黃芪屬植物黃芪中分離得到的一種生物活性最好的皂苷類化合物。藥理學研究顯示，黃芪甲苷對心血管系統主要有治療心力衰竭、耐缺氧、保護缺血心肌損傷等藥理作用[3-4]。但黃芪甲苷存在水難溶性，相對分子質量相對較高，脂溶性低，滲透性較低，體內生物利用度低，心肌細胞對該活性成分攝取量也較低，使其使其在臨床應用中受限。因此，亟需構建一種新型的載藥系統，以提高黃芪甲苷的心肌細胞攝取量，并遞送到心肌細胞線粒體，這很大程度可提高其治療缺血性心臟病的療效。

在此基礎上，采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly[lactic-co-glycolic acid]，PLGA］為載體材料包載黃芪甲苷，PLGA通常由來源廣泛的乳酸和羥基乙酸開環縮聚得到，合成容易，性能穩定，且在體內自身的降解產物無刺激性、無毒害，因而該高分子材料表現出良好的生物可降解性和生物相容性。其還可通過增強藥物的細胞攝取能力，提高納米粒的抗心肌細胞缺血等作用。

質量源于設計（quality by design，QbD）是以預先設定的目標產品質量特性（quality target product profile，QTPP）為研發起點，如以緩控釋制劑的體外釋放度為質量控制指標，在了解關鍵物質屬性和關鍵工藝參數基礎上，建立質量風險管理，確立質量控制策略和藥品質量體系[5-8]。本實驗將黃芪甲苷PLGA納米粒的處方工藝優化與QbD理念相結合，從設計層次保證藥品質量，為抗心肌缺血的臨床治療思路提供新的選擇。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜，美國安捷倫公司；Hypersil BDS C18色譜柱（250 mm×4.6 nm，5 μm），大連依利特分析儀器有限公司；ZNCL-G智能數顯磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；SCIENTZ-10N普通型冷凍干燥機，新芝凍干設備有限公司；Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析儀，馬爾文儀器有限公司；Tecnai G2 Spirit TWIN透射電子顯微鏡（TEM），FEI公司；Nicolet-iS5傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）儀，美國Thermo Fisher公司。

1.2 材料

泊洛沙姆188，批號113H022，Solarbio公司；PLGA，濟南岱罡生物工程有限公司；丙酮，湖南匯虹試劑有限公司，批號20200917；原料藥黃芪甲苷，批號C15735034，質量分數98%，上海麥克林生化科技有限公司）；對照品黃芪甲苷，質量分數98.5%，批號AF20050252，成都埃法生物科技有限公司；HPLC用試劑均為色譜純。其余相應的試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 建立黃芪甲苷PLGA納米粒的QTPP與關鍵質量屬性（critical quality attributes，CQA）

通過相關研究文獻的調研[9-10]，結合前期藥理實驗，確定本制劑的劑型設計、規格、包裝形式等，建立了黃芪甲苷PLGA納米粒的QTPP，見表1。根據表1中黃芪甲苷PLGA納米粒的QTPP，結合前期預試驗的經驗，識別建立本制劑的CQA，結果見表2。

表1 黃芪甲苷PLGA納米粒QTPP

2.2 黃芪甲苷PLGA納米粒的制備

精密稱取處方量的黃芪甲苷和處方量的PLGA（75∶25）于西林瓶中，加入2 mL有機溶劑（丙酮-無水乙醇1∶1），超聲使PLGA完全溶解。制備0.4%泊洛沙姆188水溶液作為水相。將有機相和水相放入70 ℃水浴，有機相澄清后在1200 r/min、70 ℃下注入水相中，后調轉速600 r/min，待有機溶劑揮干，冷卻至室溫，過0.22 μm微孔濾膜，即得。同樣方法制備不含藥物的空白納米粒樣品。

2.3 黃芪甲苷PLGA納米粒中黃芪甲苷的測定

2.3.1 供試品溶液的配制 取按照“2.2”項下方法制備的黃芪甲苷納米粒混懸液于10 mL量瓶中，用乙腈超聲破乳后定容至刻度線，即得供試品溶液。

2.3.2 陰性對照溶液的配制 取按照“2.2”項下方法制備的空白納米粒1 mL于10 mL量瓶中，用乙腈超聲破乳后定容至刻度線，即得陰性溶液。

表2 黃芪甲苷PLGA納米粒CQA識別

2.3.3 對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品10.0 mg于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度線，即得質量濃度為1.0 mg/mL的對照品溶液。

2.3.4 色譜條件 色譜柱為Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 nm，5 μm）；以乙腈-水（35∶65）為流動相，進樣量20 μL；柱溫40 ℃；蒸發光散射檢測器檢測；ELSD參數：漂移管加熱溫度設為65 ℃，增益60，氣壓275.79 kPa（40 psi），動力級別60%。

2.3.5 專屬性考察 分別取黃芪甲苷PLGA納米粒供試品溶液、對照品溶液以及陰性溶液，過0.22 μm微孔濾膜，在“2.3.4”項色譜條件下進行HPLC測量。由圖1可知，黃芪甲苷混懸液與對照品溶液相比在相同的保留時間處出現色譜峰，空白納米粒樣品溶液未出現色譜峰，故認為空白納米粒對實驗無干擾作用。

2.3.6 線性關系考察 取“2.3.3”項下的黃芪甲苷對照品溶液，用甲醇配制成質量濃度分別為5、10、25、50、200、500 μg/mL的系列對照品溶液，以質量濃度的對數為橫坐標（），峰面積的對數（）為縱坐標作圖，繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程＝1.265 8＋1.712 9，＝0.999 5，結果表明黃芪甲苷在5～500 μg/mL呈良好的線性關系。

圖1 黃芪甲苷對照品(A)、黃芪甲苷PLGA納米混懸液(B)、空白納米粒(C) HPLC圖譜

2.3.7 精密度試驗 取低、中、高（5、50、500 μg/mL）3個質量濃度的黃芪甲苷對照品溶液，在“2.3.4”項色譜條件下進樣測定，每一質量濃度測定6次，記錄其峰面積，計算精密度。結果表明黃芪甲苷峰面積RSD值為1.32%，說明該方法的精密度良好。

2.3.8 穩定性試驗 取“2.3.1”項下供試品溶液，按照“2.3.4”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18、24 h進樣分析，計算得黃芪甲苷的峰面積RSD值為0.85%，說明所制備的納米粒穩定性良好。

2.3.9 重復性試驗 按“2.3.1”項方法制備供試品溶液6份，按“2.3.4”項下色譜條件進行，計算得黃芪甲苷質量分數的RSD值為1.57%，結果表明該方法重復性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗 精密量取1 mL“2.3.1”項下供試品溶液9份，分為3組，分別加入黃芪甲苷對照品溶液，得到加樣質量濃度分別為低、中、高（5、50、500 μg/mL）的溶液，按“2.3.4”項下色譜條件進行，計算回收率和RSD，測得加樣回收率分別為98.78%、98.82%、102.64%，RSD均小于2.0%，結果表明該方法符合測定要求。

2.4 黃芪甲苷PLGA納米粒的包封率和載藥量的測定

2.4.1 包封率的測定 量取5 mL體積的黃芪甲苷納米粒混懸液裝入透析袋中，將其浸入到80 mL 40%乙醇溶液的釋放介質中，在25 ℃，300 r/min恒溫攪拌。分別于透析15、30、45、60、75、90、120、150、180、240、300、360、420 min取透析介質60 mL，濃縮至5 mL，過0.45 μm微孔濾膜，進樣分析。由圖2可知，隨著透析時間延長，透析介質中游離黃芪甲苷的含量一直增加，60～90 min，透析出的黃芪甲苷呈現平衡趨勢，而后透析介質中游離黃芪甲苷驟然增多，說明外部的透析介質對透析袋內部納米粒的形態開始破壞，從而使得納米粒包封好的黃芪甲苷透析出來，因此最終確定透析時間為90 min。在“2.3.4”項色譜條件下進樣測定，計算游離藥量（游），并精密移取黃芪甲苷PLGA納米粒供試品3.0 mL，加入乙腈破乳，超聲，靜置過夜，計算總藥量（總）。

包封率＝(總－游)/總

2.4.2 載藥量的測定 精密移取3 mL黃芪甲苷PLGA納米粒置于已干燥至恒定質量的稱量瓶中，冷凍干燥［溫度?50 ℃，壓強133.3 mPa（1 mTorr）］48 h，得到凍干粉凈質量（凍干粉凈質量），將凍干粉按照“2.3.1”項下供試品溶液處理方法處理后進樣，測定凍干粉中的總藥量（凍干粉總藥量），計算載藥量。

圖2 透析平衡圖

載藥量＝凍干粉總藥量/凍干粉凈質量

2.5 Plackett-Burman實驗設計篩選變量

通過對黃芪甲苷PLGA納米粒處方及制備工藝的分析，以總投藥量（1）、PLGA與藥物質量濃度比（2）、泊洛沙姆質量分數（3）、制備溫度（4）、W/O體積比（5）、磁力攪拌速度（6）為考察對象，以包封率（1）、載藥量（2）、粒徑（3）以及PDI（4）為評價指標，利用Plackett-Burman實驗設計篩選出對黃芪甲苷納米粒性質影響較顯著的因素。因素水平、篩選試驗安排及結果見表3。由Pareto圖（圖3）可知，泊洛沙姆質量分數以及W/O體積比對黃芪甲苷PLGA納米粒粒徑有顯著影響（＜0.05）；總投藥量對黃芪甲苷納米粒的PDI有顯著影響（＜0.05）；泊洛沙姆質量分數對黃芪甲苷PLGA納米粒的載藥量有顯著影響（＜0.05）；而黃芪甲苷PLGA納米粒的包封率模型值大于0.05，說明模型無顯著性差異，故不進行分析。因此固定PLGA與藥物質量濃度比、制備溫度以及磁力攪拌速度不變，采用總投藥量為3～7 mg，泊洛沙姆質量分數0.3%～0.7%，以及W/O體積比8∶1～18∶1，應用星點設計-效應面法（central composite design-response surface methodology，CCD-RSM）進一步優化。

2.6 CCD-RSM優化黃芪甲苷PLGA納米粒處方

2.6.1 試驗設計 結合上述Plackett-Burman實驗結果，發現總投藥量（1），泊洛沙姆質量濃度（3），以及W/O體積比（5）對處方成型的影響較大，故選擇其作為考察因素進一步進行處方優化。設計5水平（?2、?1、0、+1、+2），以包封率、載藥量、PDI以及粒徑4個分指標的總評歸一值（overall desirability，OD）為總評價指標。計算公式為OD＝(12…d)1/k，為指標數。對取值越大越好的因素（包封率、載藥量）和取值越小越好的因素（粒徑、PDI）采用Hassan方法分別進行數字轉換求歸一值max和min[11-12]。具體因素水平及試驗結果見表4。

表3 Plackett-Burman實驗設計與效應值

圖3 黃芪甲苷PLGA納米粒粒徑(A)、PDI (B) 和載藥量(C) 的Pareto圖(α＝0.05)

max＝(Y－min)/(max－min)

min＝(max－Y)/(max－min)

表4 CCD-RSM試驗設計方案及響應值

2.6.2 模型擬合及方差分析 采用Design-Expert軟件，以OD值對1、3、5進行二次多項式回歸方程擬合。二次多項式回歸方程為OD值＝?3.10－0.121＋14.313＋0.065－0.6313＋0.0315＋0.1935－2.9912－13.3032－9.6552。方差分析結果（表5）表明，回歸模型＜0.05，失擬項水平不顯著（＞0.05），說明模型擬合良好；回歸方程擬合決定系數（2）為0.907 8，校正決定系數（2adj）為0.824 8，說明該模型可以解釋82.48%的響應值的變異，且方程擬合程度較好。另外，總投藥量（1）和W/O體積比（5）對OD值均具有顯著影響（＜0.05），各因素之間不存在交互作用。以OD值對交互因素的響應面3D效果圖見圖4。

2.6.3 響應面優化 利用Design-Expert軟件對上述所建立的數學模型進行綜合分析，最終確定了各因素的最佳取值：總投藥量為5.03 mg、泊洛沙姆質量分數為0.48%、W/O體積比為14.33∶1。對優化后的制劑處方進行驗證試驗，實測值和預測值較為吻合，相對偏差低于2.0%，說明預測結果準確可靠，見表6。黃芪甲苷粒徑分布與ζ電位圖見圖5，其ζ電位分布在?35～?15 mV，屬于納米給藥系統的穩定體系。

表5 CCD-RSM試驗設計回歸模型方差分析

圖4 各因素間交互作用的響應面圖

表6 驗證結果(n = 3)

2.7 黃芪甲苷PLGA納米粒的表征

2.7.1 納米粒穩定性考察 將制備的黃芪甲苷納米粒混懸液分別保存于4 ℃冰箱與室溫（溫度為20～25 ℃）條件下，分別在0～9 d定時取樣測定其平均粒徑及PDI大小變化，考察其穩定性。結果見表7。4 ℃時，平均粒徑和PDI變化不大；室溫時，平均粒徑和PDI有上升趨勢。因此，黃芪甲苷納米粒4 ℃儲存時質量穩定。

2.7.2 納米粒形態學觀察 稱取適量黃芪甲苷納米粒混懸液，滴至載玻片上，以2%磷鎢酸負染后轉移至專用銅網上，揮干，透射電鏡下觀察粒徑形態和大小并拍照，所得結果見圖6。結果可見納米粒呈完整圓球形，且均勻分散，未見粘連聚集現象。

圖5 黃芪甲苷PLGA納米粒的粒徑分布(A) 以及ζ電位 (B) 圖

表7 4 ℃和室溫下黃芪甲苷PLGA納米粒的穩定性(n = 3)

圖6 黃芪甲苷PLGA納米粒的TEM圖

2.7.3 黃芪甲苷的FT-IR分析 本實驗采用紅外光譜儀對各樣品的表面化學結構進行檢測。在室溫下，采用4000～400 cm?1范圍掃描，測定樣品的紅外吸收峰。FT-IR結果顯示（圖7），PLGA（50∶50）的C＝O酯鍵的伸縮振動峰出現在1 757.94 cm?1處，2 887.91 cm?1為PLGA的C-H鍵的伸縮振動峰；在黃芪甲苷原料藥的紅外譜圖中，3 383.65 cm?1處為-OH的伸縮振動峰，結合1 112.93、1 069.41、1 048.17 cm?1，為多糖類羥基特征峰；而黃芪甲苷的紅外光譜，與空白納米粒的紅外譜圖相比較沒有發生較大的變化，沒有紅外特征峰的出現，表明藥物被成功包裹到材料中。因此，黃芪甲苷對納米粒的微觀結構并不構成影響。

2.8 黃芪甲苷PLGA納米粒的體外釋放

約10 cm的透析袋，置于蒸餾水中，煮沸20 min，浸泡24 h，再用蒸餾水潤洗，備用。精密量取制得的黃芪甲苷納米粒適量放于透析袋中，將口封緊，再將其置于磁力攪拌器上，另取黃芪甲苷原料藥溶液放于透析袋中，設定轉速為100 r/min，溫度37 ℃，溶出介質為40%乙醇溶液80 mL，分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48 h時間點取樣，將不同時間取得的溶出液采用“2.3.2”項下色譜條件進行HPLC法測定黃芪甲苷的量，并計算各時間點黃芪甲苷的累積溶出量，結果見圖8和表8。結果表明，黃芪甲苷12 h時累積溶出為83.21%，而黃芪甲苷PLGA納米粒釋藥較慢，12 h時累積溶出57.59%，因此黃芪甲苷PLGA納米粒具有一定的緩釋效應。

圖7 空白納米粒(A)、黃芪甲苷PLGA納米粒(B)、黃芪甲苷原料藥(C)的FT-IR檢測圖譜

從表8擬合模型來看，2越接近1，表明擬合效果越好，結果表明黃芪甲苷PLGA納米粒在40%乙醇溶液中72 h內的累積釋放符合Ritger- Peppas模型，2＝0.959 6，說明納米粒釋放機制為骨架溶蝕；黃芪甲苷原料藥累積釋放符合一級模型，2＝0.981 3，說明原料藥的釋放為等比擴散為主。

3 討論

載體包封藥物的常規制備方法主要有納米粒沉淀法、乳化溶劑揮發法、高壓均質法、微乳法等。本實驗曾采用納米粒沉淀法和高壓均質法制備納米粒，結果大量的藥物以白色沉淀析出，納米粒粒徑較大，PDI較高。采用改良的乳化溶劑揮發法時，所制備的納米粒混懸液帶有淡藍色乳光，粒徑分布均勻，穩定性較好，而且納米粒的包封率和載藥量得到了提高，同時，該法操作簡單，重復性較好。

圖8 體外釋放曲線

表8 黃芪甲苷納米粒的釋藥動力學擬合方程及相關系數[13-14]

本實驗采用QbD理念，以治療缺血性心臟病的口服聚合物納米顆粒為預先設定的目標產品，設計其質量特性作為研究的基礎，在系統了解關鍵物料屬性和關鍵工藝參數的基礎上[15-17]，結合Plackett- Burman及星點設計-效應面法進行實驗設計，系統研究了納米粒處方及生產工藝中的各參數，確定了黃芪甲苷納米制劑最優處方組成及制備工藝。

星點設計-效應面優化法是當前常用的實驗優化方法，通過非線性數學模型繪制效應面并優選最佳條件，能夠保證試驗精度，分析各因素之間的相互作用，具有顯著減少實驗次數、精度高、預測性較好等特點，避免了從實驗室研究到工業生產過渡過程中生產工藝的單一性和不一致性[13,18-20]。星點設計時，當采用多指標優化實驗，各指標的優選條件可能會相互矛盾，即對某一指標有利的條件可能對其他指標不利，這時可采用綜合指標OD值來考察指標的綜合效果。本實驗采用星點設計3因素5水平制備黃芪甲苷納米粒，以OD值作為綜合指標優化黃芪甲苷納米粒的最佳配比，優化后的納米粒粒徑小、包封率載藥量高和穩定性均較好，為后期治療缺血性心臟病的制劑開發奠定了理論基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on preparation process of astragaloside IV PLGA nanoparticles based on quality by design (QbD)

LI Zi-rui, WANG Yi-ting, LAN Fan, ZHOU Su-hua, LI Ya

Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To optimize the formulation ratio and preparation process of astragaloside IV PLGA nanoparticles based on quality by design (QbD).Astragaloside IV nanoparticles were prepared by emulsification solvent evaporation method. Taking the encapsulation efficiency, drug loading, particle size and PDI calculated overall desirability (OD) of astragaloside IV nanoparticles as evaluation indicators. Plackett-Burman design was used to screen out the process variables that had a significant effect on the properties of astragaloside IV nanoparticles, and then the selected variables were further optimized by central composite design-response surface methodology, and were characterized and evaluated to investigate thedrug release behavior of nanoparticles.Based on QbD, the critical process parameters (CPPs) were optimized by central composite design-response surface methodology, and the optimal prescription dosage was 5.03 mg, the poloxamer concentration was 0.48, and the W/O volume ratio was 14.33:1. It was verified that the encapsulation efficiency of astragaloside IV nanoparticles was (68.86 ± 2.90)%, the drug loading was (4.78 ± 0.45)%, the particle size was (112.87 ± 4.69) nm, the PDI was 0.134 ± 0.010, the ζ was (?29.77 ± 1.40) mV, and the nanoparticles were spherical, the particles were uniformly dispersed, and there was no adhesion and aggregation. Release experimentshowed that the drug release rule of the nanoparticles conformed to the Riger-Peppas model.Based on QbD, the product of the optimized model is obtained, which meets the expected QTPP and has stable and controllable quality, high precision, good prediction effect, and stable and feasible preparation process.

astragaloside IV; nanoparticles; quality by design; Plackett-Burman; central composite design-response surface methodology;release

R283.6

A

0253 - 2670(2022)15 - 4678 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.011

2022-01-24

湖南省自然科學基金資助項目（2021JJ30495）；湖南省大學生創新創業訓練計劃項目（2603）；湖南中醫藥大學中藥學一流學科建設項目（4901-0200002006）

李姿銳（1998—），女，碩士生，研究方向為中藥藥劑學。E-mail: 309689146@qq.com

通信作者：李 雅（1973—），女，博士，教授，碩士生導師，主要從事中藥新藥研究與開發。E-mail: liya112@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]