中藥多糖對(duì)葛根素口服生物利用度及其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的影響

何佳瑩，袁芳英，劉 灣，程 勐, 2，劉 美，金 一，奉建芳, 3，涂亮星*

中藥多糖對(duì)葛根素口服生物利用度及其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的影響

何佳瑩1，袁芳英1，劉 灣1，程 勐1, 2，劉 美4，金 一1，奉建芳1, 3，涂亮星1* 

1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西 南昌 330000 2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006 3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200 4. 四川省食品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 611731

通過(guò)研究6種中藥多糖（人參多糖、白芨多糖、茶多糖、大豆多糖、枸杞多糖、葛根多糖）對(duì)葛根素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)變化，探討中藥多糖對(duì)葛根素口服吸收的影響，并采用犬腎MDCK細(xì)胞單層模型研究了中藥多糖的促口服吸收機(jī)制。大鼠ig葛根素及不同中藥多糖-葛根素混懸液后，于不同時(shí)間點(diǎn)采集血樣，經(jīng)適當(dāng)處理后，采用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定血漿中葛根素的質(zhì)量濃度，并以此計(jì)算和比較藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。采用MDCK細(xì)胞單層模型考察中藥多糖借助葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)提高葛根素跨膜吸收的能力。與中藥多糖聯(lián)合給藥后，葛根素的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)有不同程度的變化，主要呈現(xiàn)出促進(jìn)葛根素口服吸收的趨勢(shì)，其中以人參多糖的促吸收效果最為卓越，人參多糖可將葛根素的達(dá)峰濃度（max）及曲線下面積（AUC0～∞）分別提高1.77及3.14倍。CCK-8實(shí)驗(yàn)表明藥物質(zhì)量濃度為5～1000 μg/mL、人參多糖質(zhì)量濃度為20～10 000 μg/mL時(shí)，藥物及多糖無(wú)明顯細(xì)胞毒性。在50～1000 μg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，葛根素的表觀滲透系數(shù)（apparent permeability coefficient，app）無(wú)明顯變化；人參多糖可將葛根素的app顯著升高（＜0.05、0.01、0.001）；加入葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（根皮素、根皮苷）后，葛根素組的app無(wú)明顯變化，而人參多糖組的app顯著下降（＜0.001）。中藥多糖會(huì)通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑提高葛根素的口服吸收，提示利用中藥多糖作為遞藥系統(tǒng)修飾劑，或許可成為一種有潛力的提高難吸收藥物口服吸收的技術(shù)手段。

人參多糖；白芨多糖；茶多糖；大豆多糖；枸杞多糖；葛根多糖；葛根素；藥動(dòng)學(xué)；MDCK細(xì)胞單層；轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑

多糖也稱多聚糖，是10個(gè)以上單糖通過(guò)糖苷鍵聚合而成的生物大分子，存在于動(dòng)植物和微生物中。中藥多糖是用現(xiàn)代科技方法從中藥中提取的有效多糖[1]，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)[2]等生物活性。多糖為天然產(chǎn)物，具有較好的生物相容性[3-4]及免疫原性，且多糖分子含有大量的活性基團(tuán)，可以進(jìn)行化學(xué)修飾或結(jié)構(gòu)改造[5-7]。近年來(lái)，基于多糖直接構(gòu)建遞藥系統(tǒng)[8]或者以多糖作為靶向基團(tuán)提高納米顆粒遞藥精準(zhǔn)度[9]的研究常有報(bào)道，中藥多糖可作為遞藥載體遞送難溶性藥物，增加其生物利用度。同時(shí)也有研究證實(shí)中藥多糖可直接影響其他藥物的吸收，如天麻去除多糖后，其有效成分天麻素在體內(nèi)的含量明顯減少，天麻多糖可以提高天麻素生物利用度[10-11]；麥冬的多糖含量較高[12]，五味子與麥冬合用后五味子的入血成分顯著提高；大豆多糖能夠增強(qiáng)染料木黃酮的生物利用度。因此中藥多糖可以被設(shè)計(jì)為藥物載體應(yīng)用于新型遞藥系統(tǒng)中，也可以直接與藥物聯(lián)合給藥，提高藥物生物利用度[13]。目前有部分學(xué)者認(rèn)為中藥多糖可能通過(guò)抑制P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）外排[14-17]、調(diào)節(jié)腸道菌群[18-19]等途徑促進(jìn)藥物的口服吸收。考慮到胃腸道中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑可高效遞送糖類物質(zhì)，中藥多糖是否能借助葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑提高難溶性中藥活性成分的口服吸收目前尚無(wú)相關(guān)研究。

葛根素是從豆科植物野葛(Willd.) Ohwi中提取的一種異黃酮類衍生物，是中藥葛根的主要藥效物質(zhì)，具有抑制動(dòng)脈硬化、抗心肌缺血、抗心律失常等作用[20]。葛根素溶解性較差[21-22]，腸道滲透性低，被歸為生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（biopharmaceutics classification system，BCS）IV類藥物[23]。因此，盡管葛根素具有廣泛的藥理活性，但其臨床應(yīng)用受到限制，主要以iv為主。且由于體內(nèi)消除半衰期短，故需頻繁或大劑量給藥，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)，目前如何提高以葛根素為代表的難溶性藥物的口服生物利用度是目前藥劑研究中的重點(diǎn)方向。

本研究擬使用中藥多糖作為修飾劑，將6種中藥多糖與葛根素聯(lián)合給藥，探索中藥多糖對(duì)難吸收藥物葛根素在大鼠體內(nèi)口服吸收的影響；并使用犬腎MDCK細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)模型來(lái)探索葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑在其促葛根素口服吸收中的作用，驗(yàn)證其是否能夠成為一種有潛力的提高難吸收藥物口服生物利用度的技術(shù)手段，也為中藥多糖在遞藥系統(tǒng)中的應(yīng)用提供一種新的思路與方法。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠35只，7～8周齡，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004。大鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（55±5）%的江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)工程研究中心動(dòng)物房中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（贛）2018-0002。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

1.2 細(xì)胞

MDCK細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)提供。

1.3 藥品與試劑

葛根素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，批號(hào)20190105）購(gòu)自南京欣厚生物科技公司；葛根素對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.4%，批號(hào)110752-201816）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；人參多糖、茶多糖、白芨多糖、枸杞多糖、大豆多糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，批號(hào)分別為BCSW200928-3、BCSW200927-3、BCSW200805-2、BCSW200814-2、BCSW200901-1）購(gòu)自西安百川生物科技有限公司；葛根多糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%，批號(hào)20200617412）購(gòu)自武漢澤山成生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；枸櫞酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%，批號(hào)20200204）購(gòu)自成都華邑藥用輔料制造有限責(zé)任公司；對(duì)羥基苯甲酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%，批號(hào)H108509）、根皮苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，批號(hào)P139206）、根皮素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，批號(hào)P127748）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、非必需氨基酸、0.25%胰酶-0.02% EDTA、PBS溶液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；高氯酸、甲醇、乙醇均為分析純。

1.4 儀器

Transwell小室（孔徑0.4 μm，直徑12 mm，底面積1.12 cm2）、培養(yǎng)瓶購(gòu)自美國(guó)Costar公司；XW-80A型旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；高效液相色譜儀（HPLC，日本島津公司）；TGL-16C型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA124S型分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HZT-A3000型電子天平（美國(guó)HZ公司）；細(xì)胞電壓電阻儀（美國(guó)Millipore公司）。

2 方法

2.1 血漿樣品測(cè)定方法學(xué)建立

2.1.1 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取一定量對(duì)羥基苯甲酸，用甲醇配制成30 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.1.2 葛根素對(duì)照品溶液的配制 精密稱取葛根素對(duì)照品10.00 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解后，定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的葛根素儲(chǔ)備液。逐級(jí)稀釋得到質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10 μg/mL的系列葛根素對(duì)照品溶液。

2.1.3 質(zhì)控樣品的配制 向大鼠空白血漿中分別加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的葛根素對(duì)照品溶液，配制成不同質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 血漿樣品處理方法 精密吸取50 μL血漿置于1.5 mL EP管中，依次加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液、50 μL高氯酸甲醇溶液，渦旋3 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積并計(jì)算血藥濃度。

2.1.5 液相條件 Welch Ultimate XB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%枸櫞酸溶液（27∶73）；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm；體積流量為1 mL/min；進(jìn)樣體積為10 μL。

2.1.6 專屬性 分別處理空白血漿、空白血漿＋內(nèi)標(biāo)溶液、空白血漿＋內(nèi)標(biāo)溶液＋葛根素溶液、含藥血漿，處理后，注入液相系統(tǒng)，按“2.1.5”項(xiàng)下條件分析并記錄圖譜。

2.1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線 向大鼠空白血漿中分別加入不同質(zhì)量濃度的葛根素對(duì)照品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度各取3份，按照“2.1.4”項(xiàng)進(jìn)行處理，注入液相分析。此時(shí)，該標(biāo)準(zhǔn)溶液中葛根素的質(zhì)量濃度分別為0.023、0.045、0.114、0.227、0.454、1.136、2.273、4.545 μg/mL。數(shù)據(jù)處理時(shí)，以葛根素峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（）對(duì)質(zhì)量濃度（）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.8 精密度 分別取“2.1.3”項(xiàng)配制的質(zhì)控樣品，按照“2.1.4”項(xiàng)進(jìn)行處理，得到含葛根素質(zhì)量濃度分別為0.114、0.454、4.545 μg/mL的低、中、高質(zhì)量濃度溶液，在一天內(nèi)不同的時(shí)間進(jìn)樣5次，記為日內(nèi)精密度；每日配制樣品，共測(cè)定5 d，記為日間精密度。

2.1.9 提取回收率 分別取“2.1.3”項(xiàng)配制的質(zhì)控樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度各取3份，按照“2.1.4”項(xiàng)進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析，得樣品中葛根素的峰面積。取空白血漿，按“2.1.4”項(xiàng)方法沉淀蛋白后，取上清液，分別加入相對(duì)應(yīng)的低、中、高質(zhì)量濃度葛根素對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析，得到未經(jīng)提取的葛根素的峰面積。以2次峰面積的比值計(jì)算提取回收率。

2.1.10 定量限 分別按照“2.1.3”項(xiàng)配制出不同質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度各取3份，按照“2.1.4”項(xiàng)進(jìn)行處理，注入液相分析，考察該方法的定量限。

2.1.11 穩(wěn)定性 分別取“2.1.3”項(xiàng)配制的質(zhì)控樣品，按照“2.1.4”項(xiàng)進(jìn)行處理，得到含葛根素質(zhì)量濃度分別為0.114、0.454、4.545 μg/mL的低、中、高質(zhì)量濃度溶液，分別在進(jìn)樣器放置12 h后，進(jìn)液相分析，檢測(cè)進(jìn)樣器放置穩(wěn)定性。將空白血漿從?20 ℃冰箱拿出，室溫放置4 h，再進(jìn)行樣品處理，進(jìn)液相分析，考察血漿樣品在室溫短期放置后再處理，葛根素的穩(wěn)定性。將未處理的血漿樣品在?20 ℃冰箱和室溫間反復(fù)凍融3次，再進(jìn)行樣品處理，測(cè)定其含量，檢測(cè)樣品的凍融穩(wěn)定性。

2.2 中藥多糖對(duì)葛根素口服藥動(dòng)學(xué)的影響

2.2.1 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物禁食不禁水飼養(yǎng)12 h，給藥前根據(jù)動(dòng)物體質(zhì)量，分別ig葛根素原料藥（100 mg/kg）及人參多糖-葛根素溶液、白芨多糖-葛根素溶液、枸杞多糖-葛根素溶液、茶多糖-葛根素溶液、葛根多糖-葛根素溶液、大豆多糖-葛根素溶液（葛根素100 mg/kg，多糖1 g/kg）。

分別于5、15、30及1、2、4、6、8、12、24 h從眼眶靜脈叢中取血300 μL（給藥4 h后，大鼠適當(dāng)補(bǔ)水，保持良好的生理狀態(tài)），將血液置于離心機(jī)中以3000 r/min離心10 min，取上清液，置?20 ℃冰箱中，待測(cè)。

2.2.2 數(shù)據(jù)處理 將血藥濃度、給藥劑量、給藥途徑等參數(shù)輸入DAS 3.2中進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)分析和參數(shù)計(jì)算，并根據(jù)軟件所得的曲線下面積（AUC）計(jì)算葛根素原料藥、各種多糖葛根素溶液的相對(duì)生物利用度（Fr）。

2.3 細(xì)胞毒性研究

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) MDCK細(xì)胞接種于常規(guī)培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，吸棄舊培養(yǎng)液，用37 ℃的PBS溶液清洗2遍，0.25%胰酶-0.02% EDTA消化，傳代。

2.3.2 CCK-8法評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性 調(diào)整MDCK細(xì)胞密度為8×104個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，保留3個(gè)孔不接種細(xì)胞用于排除培養(yǎng)液吸光度（）的干擾，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用PBS溶液清洗細(xì)胞，排除培養(yǎng)基的干擾，加入用DMEM培養(yǎng)基稀釋的不同質(zhì)量濃度（5、10、20、50、100、500、1000 μg/mL）的葛根素和不同質(zhì)量濃度（20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10 000 μg/mL）的人參多糖，對(duì)照組和3個(gè)沒(méi)有接種細(xì)胞的孔加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)2、24 h，棄去藥液并用PBS清洗細(xì)胞2次；各孔加入10 μL CCK-8溶液，搖勻；放入培養(yǎng)箱孵育2 h后，取出；采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(給藥－空白)/(對(duì)照－空白)

采用GraphPad Prism 5軟件和SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理及統(tǒng)計(jì)分析。所得結(jié)果用表示，采用檢驗(yàn)進(jìn)行兩組均數(shù)比較。

2.4 多糖對(duì)葛根素跨MDCK細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

2.4.1 葛根素質(zhì)量濃度對(duì)葛根素轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋瓶底的80%～90%時(shí)，胰酶消化，將細(xì)胞以4×105個(gè)/mL接種于Transwell的聚碳酸酯膜上，每孔0.5 mL，在Transwell接受池（BL）加入1.5 mL培養(yǎng)液，接種24 h后更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)約1周，定時(shí)測(cè)定跨膜電阻（TEER）值，并用電子顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)TEER值＞200 Ω/cm2時(shí)，用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。用DMEM培養(yǎng)基洗去黏附在細(xì)胞表面的代謝物。分別將0.5 mL不同質(zhì)量濃度（50、200、500、1000 μg/mL）的葛根素溶液加入到供給池（AP），同時(shí)在BL加入1.5 mL DMEM培養(yǎng)基，將Transwell置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，于90 min從BL池吸取接收液0.5 mL。收集樣品于?4 ℃保存待測(cè)。樣品按1∶4比例加入甲醇進(jìn)行稀釋，12 000 r/min離心10 min，取上清液，按“2.1.5”項(xiàng)下條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，計(jì)算表觀滲透系數(shù)（apparent permeability coefficient，app）[24]。

app＝d/d×1/×1/0

d/d為單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)量，為轉(zhuǎn)運(yùn)膜的表面積（1.12 cm2），0為AP中葛根素的初始質(zhì)量濃度

2.4.2 人參多糖質(zhì)量濃度對(duì)葛根素轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 用DMEM培養(yǎng)基配制葛根素（500 μg/mL）與人參多糖質(zhì)量濃度比分別為1∶0、1∶1、1∶5、1∶10、1∶20的藥液。構(gòu)建MDCK細(xì)胞模型，將0.5 mL藥液加入到AP，其余操作同“2.4.1”項(xiàng)。

2.4.3 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑[25-28]對(duì)葛根素轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)根皮素可以有效抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1），并且對(duì)GLUT其他亞型也有一定的抑制作用；根皮苷能夠抑制鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sodium-glucose co-transporter，SGLT），特別是SGLT1這個(gè)亞型。考察根皮素（1 mmol/L）、根皮苷（1 mmol/L）對(duì)葛根素（500 μg/mL）及葛根素（500 μg/mL）＋人參多糖（5 mg/mL）的影響。構(gòu)建MDCK細(xì)胞模型，將0.5 mL藥液加入到AP，其余操作同“2.4.1”項(xiàng)。

3 結(jié)果

3.1 血藥濃度方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性考察結(jié)果 如圖1所示，內(nèi)標(biāo)峰及葛根素峰形較好，且大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)內(nèi)標(biāo)峰及葛根素峰沒(méi)有干擾，內(nèi)標(biāo)峰的保留時(shí)間在10.2 min左右，葛根素保留時(shí)間在12.2 min左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明專屬性良好，符合方法學(xué)要求。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），葛根素與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（），得到葛根素的回歸方程為＝0.359 3－0.004 8（2＝0.999 8）。

結(jié)果顯示，體內(nèi)葛根素質(zhì)量濃度在0.023～4.545 μg/mL線性關(guān)系良好，符合方法學(xué)要求。

3.1.3 精密度考察結(jié)果 如表1所示，葛根素低質(zhì)量濃度日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于15%，中、高質(zhì)量濃度日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于5%，見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明精密度良好，符合生物樣品精密度要求。

3.1.4 提取回收率考察結(jié)果 結(jié)果顯示，在低、中、高質(zhì)量濃度下葛根素提取回收率分別為（91.49±3.6）%、（90.22±2.7）%和（91.04±3.4）%。

圖1 空白血漿(A)、空白血漿＋內(nèi)標(biāo)溶液(B)、空白血漿＋內(nèi)標(biāo)溶液＋葛根素溶液(C)和含藥血漿(D) 的HPLC圖

表1 葛根素的日內(nèi)和日間精密度

3.1.5 定量限 當(dāng)體內(nèi)樣品中葛根素的質(zhì)量濃度為0.016 μg/mL時(shí)為定量限，信噪比大于10，RSD%為8.1%，均符合方法學(xué)要求。

3.1.6 穩(wěn)定性 如表2所示，血漿樣品制備好在室溫放置12 h內(nèi)質(zhì)量濃度不會(huì)有所變化，未處理的血漿樣品在室溫4 h內(nèi)短期放置和?20 ℃冰箱到室溫反復(fù)凍融3次后處理，其質(zhì)量濃度無(wú)明顯的變化，所有RSD均小于15%，符合方法學(xué)要求。

表2 葛根素血漿樣品的穩(wěn)定性

3.2 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果

大鼠分別ig葛根素和多糖葛根素后，采用上述所建立的方法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，以大鼠血藥濃度作為縱坐標(biāo)，時(shí)間作為橫坐標(biāo)作圖，得到平均血藥濃度-時(shí)間曲線，見(jiàn)圖2。采用DAS 3.2軟件進(jìn)行非房室模型擬合，計(jì)算達(dá)峰時(shí)間（max）、達(dá)峰濃度（max）、AUC及半衰期（1/2）等藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并用SPSS 23.0軟件分別對(duì)各參數(shù)進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，見(jiàn)表3。葛根素單獨(dú)給藥后max小于30 min，吸收迅速，血藥濃度達(dá)峰時(shí)間較快。與6種中藥多糖聯(lián)合給藥后，葛根素的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)max、AUC0～24、AUC0～∞均有不同程度的變化。其中葛根素與葛根多糖聯(lián)用后AUC0～24為對(duì)照組的0.89倍；與枸杞多糖聯(lián)用后AUC0～24為對(duì)照組的1.21倍；與白芨多糖聯(lián)用后AUC0～24為對(duì)照組的1.40倍；與茶多糖聯(lián)用后AUC0～24為對(duì)照組的1.72倍；與大豆多糖聯(lián)用后AUC0～24為對(duì)照組的1.98倍；與人參多糖聯(lián)用后AUC0～24為對(duì)照組的3.14倍。

圖2 ig不同制劑后大鼠體內(nèi)平均血藥濃度-時(shí)間曲線(n = 5)

3.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖3所示，葛根素在5～1000 μg/mL、人參多糖在20～10 000 μg/mL作用于MDCK細(xì)胞2、24 h后，細(xì)胞存活率均大于95%，表明在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)葛根素和人參多糖對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。

3.4 多糖對(duì)葛根素跨MDCK細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

如圖4-A所示，各質(zhì)量濃度葛根素的app值無(wú)顯著差異，說(shuō)明質(zhì)量濃度對(duì)葛根素轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)影響；且app值均小于4×10?6cm/s，表明其滲透性差，可能導(dǎo)致其口服生物利用度低。

表3 不同制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n = 5)

與葛根素組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001

*< 0.05**< 0.01***< 0.001puerarin group

圖3 葛根素(A) 及人參多糖(B) 對(duì)MDCK細(xì)胞活力的影響(, n = 3)

如圖4-B所示，加入人參多糖后，葛根素的app均有顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），且隨著二者比例增高app值有上升的趨勢(shì)，并在1∶10時(shí)達(dá)到最高。葛根素的app值在質(zhì)量濃度比為1∶20時(shí)開(kāi)始降低，表明人參多糖在促進(jìn)葛根素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方面具有一定的閾值。

如圖4-C所示，加入根皮素和根皮苷后，葛根素組中葛根素的app值無(wú)明顯變化，表明葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體不參與葛根素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。但在葛根素＋人參多糖組，加入抑制劑根皮素和根皮苷后，葛根素的app均顯著降低（＜0.001），表明人參多糖促吸收機(jī)制與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體有關(guān)。

4 討論

關(guān)于中藥多糖促進(jìn)難溶性藥物口服吸收的相關(guān)機(jī)制，目前部分研究者已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)研究，認(rèn)為中藥多糖可能通過(guò)以下途徑影響藥物吸收：①中藥多糖可以抑制外排蛋白活性，成日華、吳芬等[14-16]發(fā)現(xiàn)枸杞多糖和靈芝多糖肽可以將P-gp特異性底物Rh-123的外排率減低25.6%及33%；②中藥多糖可以調(diào)節(jié)腸道菌群種類及數(shù)量，李瑞剛、Shen等[18-19]發(fā)現(xiàn)人參多糖可以顯著提高腸道中乳桿菌和擬桿菌的豐度，從而提高人參皂苷的腸內(nèi)代謝，進(jìn)一步提高活性更強(qiáng)的次生苷吸收入血發(fā)揮藥效；③中藥多糖可以影響藥物代謝酶活性，夏雪雁等[29]發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸總多糖使正常小鼠肝微粒體及線粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性分別升高152%和12%。張國(guó)偉等[30]發(fā)現(xiàn)豬苓多糖可以使樣本中細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶活性降低21.12%。對(duì)于人參多糖是否可通過(guò)其他途徑促進(jìn)難溶性藥物的口服吸收暫未見(jiàn)其他報(bào)道。

A-不同質(zhì)量濃度葛根素的Papp B-葛根素與人參多糖的不同質(zhì)量濃度比對(duì)葛根素Papp的影響 C-葛根素在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑（根皮素、根皮苷）作用下的Papp 與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

Wu等[31]發(fā)現(xiàn)小分子果糖可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)吸收途徑促進(jìn)納米口服給藥的單向上皮轉(zhuǎn)運(yùn)。根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)：①中藥多糖中含有豐富的糖類物質(zhì)；②葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑為人體中高效的能量轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，其可有效地吸收以葡萄糖為代表的糖類物質(zhì)。因此，推測(cè)中藥多糖是否可以通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑提高藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高其口服生物利用度。本研究結(jié)果表明，加入人參多糖后葛根素的app有所提高，且隨著多糖質(zhì)量濃度升高，app值有上升的趨勢(shì)，加入葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（根皮素、根皮苷）后葛根素組的app無(wú)明顯變化，而人參多糖組的app顯著下降。證實(shí)人參多糖促進(jìn)葛根素吸收過(guò)程與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體有密切關(guān)系。并發(fā)現(xiàn)，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.5～5 mg/mL），人參多糖促進(jìn)葛根素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的速率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系，人參多糖質(zhì)量濃度越高，葛根素的app越大。但當(dāng)人參多糖質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí)，葛根素的app開(kāi)始下降，可能與高質(zhì)量濃度的人參多糖阻礙藥物與細(xì)胞的接觸，從而影響藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

本研究前期使用的其他多糖：葛根多糖和枸杞多糖對(duì)葛根素的口服生物利用度無(wú)明顯影響；白芨多糖、大豆多糖和茶多糖能夠提高葛根素在大鼠體內(nèi)的口服吸收，但本研究暫未對(duì)其促吸收機(jī)制進(jìn)行考察。因此，是否其他中藥多糖也可通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑影響葛根素的口服吸收暫未得到證實(shí)，后續(xù)本課題組也將會(huì)對(duì)此進(jìn)行更加深入的研究。

綜上所述，人參多糖可能會(huì)通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑提高葛根素的口服吸收，提示利用人參多糖作為遞藥系統(tǒng)修飾劑，或許可成為一種有潛力的提高難吸收藥物口服吸收的技術(shù)手段，也為中藥多糖在遞藥系統(tǒng)中的應(yīng)用提供一種新的思路與方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of Chinese medicine polysaccharide on pharmacokinetic behaviors and transmembrane mechanisms of puerarin

HE Jia-ying1, YUAN Fang-ying1, LIU Wan1, CHENG Meng1, 2, LIU Mei4, JIN Yi1, FENG Jian-fang1, 3, TU Liang-xing1

1. National Pharmaceutical Engineering Center for Solid Preparation Chinese Herbal Medicine, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330000, China 2. The Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330006, China 3. School of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 4. Sichuan Institute of Food Inspection, Chengdu 611731, China

To explore the effect of traditional Chinese medicine polysaccharide on oral absorption of puerarin by studying the effect of six kinds of traditional Chinese medicine polysaccharide (ginseng polysaccharide,polysaccharide, tea polysaccharide, soybean polysaccharide,polysaccharide,polysaccharide) on pharmacokinetic changes of puerarin in rats. And to study the mechanism of promoting oral absorption of traditional Chinese medicine polysaccharides by using canine kidney MDCK cell monolayer model.After ig puerarin and different traditional Chinese medicine polysaccharide-puerarin suspensions, blood samples were collected at different time points. After appropriate treatment, concentration of puerarin in plasma was determined by high performance liquid chromatography (HPLC), pharmacokinetic parameters were calculated and compared. MDCK cells monolayer model was used to investigate the ability of traditional Chinese medicine polysaccharides to enhance the transmembrane absorption of puerarin through glucose transport.After co-administration with traditional Chinese medicine polysaccharides, main pharmacokinetic parameters of puerarin were changed to varying degrees, mainly showing a trend of promoting oral absorption of puerarin. Among them, ginseng polysaccharide had the most excellent absorption promoting effect. Peak concentration (max) and area under the curve (AUC0～∞) were increased by 1.77 and 3.14 times. CCK-8 experiment showed that when the concentration of drug was 5—1000 μg/mL and concentration of ginseng polysaccharide was 20—10 000 μg/mL, drug and polysaccharide had no obvious cytotoxicity. Within the concentration of 50—1000 μg/mL, apparent permeability coefficient (app) of puerarin had no significantly changed; Ginseng polysaccharide significantly increasedappof puerarin (< 0.05, 0.01, 0.001); After adding glucose transport inhibitors (phloretin, phlorizin),appin puerarin group had no significant changed, whileappin ginseng polysaccharide group was significantly decreased (< 0.001).Traditional Chinese medicine polysaccharides can improve the oral absorption of puerarin through the glucose transport pathway, suggesting that the use of traditional Chinese medicine polysaccharides as drug delivery system modifiers may become a potential technical means to improve the oral absorption of refractory drugs.

ginseng polysaccharide;polysaccharide; tea polysaccharide; soybean polysaccharide;polysaccharide;polysaccharide; puerarin; pharmacokinetics; MDCK cellsmonolayer; transport mechanism; glucose transport pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)15 - 4738 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.017

2022-04-14

江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（20212BCJL23060）；江西中醫(yī)藥大學(xué)“1050”青年人才工程項(xiàng)目（5142001012）；江西中醫(yī)藥大學(xué)博士啟動(dòng)項(xiàng)目（2018BSZR018）

何佳瑩，女，碩士研究生，從事新型遞藥系統(tǒng)研究。E-mail: hejiaying0511@163.com

通信作者：涂亮星，男，博士，副教授，從事新型遞藥系統(tǒng)研究。E-mail: tufrankie@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]