白木香轉錄因子AsNAC2的克隆及表達分析

張玉秀，劉培衛*，呂菲菲，楊 云，徐艷紅，高志暉，魏建和, *

? 藥材與資源?

白木香轉錄因子AsNAC2的克隆及表達分析

張玉秀1，劉培衛1*，呂菲菲1，楊 云1，徐艷紅2，高志暉2，魏建和1, 2*

1. 中國醫學科學院 北京協和醫學院藥用植物研究所海南分所海南省南藥資源保護與開發重點實驗室 國家中醫藥管理局沉香可持續利用重點研究室，海南 海口 570311 2. 中國醫學科學院 北京協和醫學院藥用植物研究所 中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室 瀕危藥材繁育國家工程實驗室，北京 100193

對珍稀南藥沉香基原植物白木香AsNAC2轉錄因子進行分子克隆，并對其進行生物信息學和表達模式分析。以白木香莖的總RNA反轉錄的cDNA為模板，采用PCR技術獲取基因編碼序列（coding sequence，CDS）全長；利用生物信息學軟件預測蛋白的理化性質、結構域和亞細胞定位等特性；運用DNAMAN8.0和MEGA6.0等軟件分別進行多序列比對和進化關系分析；利用qRT-PCR技術檢測基因在不同組織和傷害脅迫下的表達特性。克隆獲得基因（GenBank注冊號MT130201），開放閱讀框（open reading frame，ORF）全長864 bp，編碼1條由287個氨基酸組成的弱酸性的穩定的親水性蛋白，該蛋白定位在細胞核中，不存在跨膜結構域。序列比對和系統進化樹分析顯示，AsNAC2蛋白N端具有典型的NAM結構域，與錦葵目中的可可、哥倫比亞錦葵和榴蓮NAC 2-like蛋白親緣關系近，屬于NAC轉錄因子家族中的ATAF亞組。qRT-PCR結果顯示，基因主要在健康白木香的根和莖中表達，全斷干傷害可顯著誘導莖中基因表達量的上調，在2 h達到峰值，此后緩慢下降，至48 h基本恢復正常。首次在白木香中克隆和鑒定了基因，該基因易受傷害誘導表達，且在傷害早期相對應。

白木香；轉錄因子；NAC；克隆；表達分析

沉香為珍稀南藥，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘等功效[1]，同時也是名貴的天然香料，是高級香水中不可或缺的定香劑[2]。白木香(Lour.) Gilg為瑞香科沉香屬植物，是國產藥用沉香法定的唯一來源物種[1]。健康的白木香不能形成沉香，只有在傷害脅迫下才能夠在傷口周圍產生倍半萜和色酮等沉香類物質[3-5]。為了獲得沉香，沉香屬植物受到了無節制濫砍濫伐，加之生態環境破壞日益加劇，造成沉香屬野生植物資源已瀕臨滅絕，包括白木香在內的所有沉香屬及擬沉香屬均被列入了《瀕危野生動植物種國際貿易公約》附錄II[6]。全面解析沉香形成機制，不斷創新高效的結香技術成為解決沉香資源問題的關鍵[4, 7]。項目組早期揭示出“傷害誘導白木香防御反應形成沉香”機制，解析了傷害→內源傷害信號分子→轉錄因子→倍半萜合酶基因→倍半萜分子通路[7-11]。但該網絡中仍有很多關鍵調控步驟有待進一步研究闡明。

課題組前期在研究“傷害誘導白木香防御反應形成沉香”的分子機制過程中，發現轉錄因子在沉香倍半萜物質的形成過程中起著重要的調控作用，如AsMYC2轉錄因子作為正調控子[11]，而AsWRKY44轉錄因子作為負調控子[7]，在茉莉酸信號途徑中通過調控倍半萜合酶基因的表達參與沉香倍半萜物質的形成過程。NAC轉錄因子是植物特有、數量眾多的轉錄因子家族之一[12-13]。已有研究表明，NAC轉錄因子參與植物生長發育和器官形態建成等許多方面[14]。此外，越來越多的研究證明，在植物的信號傳導以及非生物損傷和脅迫應答過程中，NAC轉錄因子也起著激活或抑制應答的功能[12-13, 15]。方澤蘅等[16]的轉錄組數據表明NAC轉錄因子在白木香應答鹽脅迫起到重要的調控作用。但白木香中NAC轉錄因子的克隆和功能的研究還未見報道。本實驗依據前期的白木香轉錄組數據（未發表數據），首次對白木香中一個NAC轉錄因子進行克隆和鑒定，并對它進行組織表達特性和傷害處理下的表達特性分析，旨在為深入研究該基因在傷害誘導白木香結香過程中的生物學功能奠定基礎。

1 材料

樣品采自中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所海口研發中心苗圃，經中國醫學科學院藥用植物研究所楊云副研究員鑒定為4年生健康白木香(Lour.) Gilg。2019年6月15日分別采集白木香的根、莖、葉、果肉和近成熟的種子并迅速置入液氮中，放入?80 ℃冰箱保存備用。

2 方法

2.1 RNA的提取及cDNA的合成

取0.1 g植物材料在液氮中研磨成粉末，采用EASYspin Plus植物RNA提取試劑盒（AidLab RN38，中國）提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA的完整性，分光光度計NanoDrop（Thermo Scientific，美國）測定RNA濃度和純度。采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix試劑盒（TransGen AT311，中國）合成cDNA。

2.2 AsNAC2的克隆

根據轉錄組數據中CDS的全長序列（未發表數據），運用Primer Premier 5.0軟件設計引物，上游為5’-ATGAAGGGAGGTGGAGCAG- AG-3’，下游為5’-TCAATATGGCTTCTGAAGG- TA-3’。以白木香的cDNA為模板，利用高保真性的TaKaRa LA酶進行PCR擴增。PCR體系：LA Tap 0.5 μL，LA Buffer 5 μL，dNTP 8 μL，上、下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 33.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃、4 min；98 ℃、10 s，52 ℃、15 s，72 ℃、1 min，30個循環；最后72 ℃、10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，連接到pSmart-HCKan-T載體上，連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞，藍白斑篩選，挑取陽性克隆送廣州艾基生物技術有限公司測序。

2.3 生物信息學分析

使用一系列生物信息學軟件對基因的核酸序列及編碼蛋白序列進行生物信息學分析。利用NCBI在線工具Conserved Domains對其結構域進行預測；在NCBI Reference proteins數據庫中BLAST獲得同源的NAC蛋白序列，運用DNAMAN8.0軟件對AsNAC2及獲得的氨基酸序列進行多重序列比對，利用MEGA 6.0軟件構建NJ系統樹（Bootstrap參數為1000）。蛋白的理化性質、亞細胞定位和跨膜結構預測分別采用ExPASy-ProtParatool（http://web.expasy.org/protparam），WoLFPSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）和TMHMM（http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）等在線工具完成。

2.4 白木香AsNAC2基因的表達分析

2.4.1 組織表達分析 選取白木香作為內參基因[17]，根據上面獲得的NAC基因的CDS序列設計熒光定量PCR引物（表1）。用羅氏實時熒光定量PCR儀（LightCycler96，瑞士）進行qRT-PCR。反應體系20 μL包括2XTop Green qPCR Supermix（TransGen AQ131，中國）10 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。每個組織重復3次。PCR程序為95 ℃、600 s；95 ℃、10 s，55 ℃、15 s，72 ℃、20 min，40個循環。利用2?△△Ct方法計算相對表達量。

表1 qRT-PCR所用的引物序列

2.4.2 傷害脅迫表達分析 將4年生的白木香莖直接鋸斷，處理1、2、6、12、24、48 h后，將距離傷口1 cm的莖段，迅速鋸下，立即放入液氮中保存、標記，然后放入?80 ℃冰箱保存備用。參照組織表達分析進行qRT-PCR。

3 結果與分析

3.1 白木香AsNAC2基因的克隆及鑒定

以白木香RNA反轉錄成的cDNA為模板，PCR擴增得到了1條略小于1000 bp的條帶（圖1）。通過純化、克隆和測序等技術，獲得1條為864 bp開放閱讀框，編碼287個氨基酸（圖2）。NCBI的Conserved Domains在線軟件分析表明該蛋白N-端具有一個典型的NAM保守結構域，分布在11～134位氨基酸之間（圖2）。

M-Marker 1～3-擴增產物

在NCBI Reference proteins數據庫中BLAST搜索與AsNAC2同源的功能相對明確的NAC蛋白序列，用DNAMAN8.0將AsNAC2與獲得的甜橙CsNAC2（NP_001275792.1）、大豆GmNAC2（NP_ 001341065.1）、棉花GhNAC2（NP_001314659.1）、麻瘋樹JcNAC2（NP_001295644.1）、甜瓜CmNAC2（NP_001284423.1）、擬南芥ANAC002（NP_171677.1）和ANAC102（NP_201184.2）的氨基酸序列進行多重比對。結果顯示AsNAC2與其他植物NAC轉錄因子一樣，-端氨基酸序列高度保守，并可進一步劃分為A～E 5個保守的亞結構域（圖2）。

3.2 AsNAC2蛋白的生物信息學分析

利用MEGA6.0軟件的NJ方法構建AsNAC2蛋白與其他種植物的同源性高的NAC轉錄因子的系統進化樹（圖3）。植物的NAC轉錄因子可以分成2個大組，18個亞組[18]，從系統進化樹可以看出，AsNAC2與ATAF亞組中的擬南ANAC002/102和水稻OsNAC48/71轉錄因子聚在在一個分支上（圖3），說明AsNAC2屬于NAC轉錄因子ATAF亞組。

另外，可以從圖中看出，AsNAC2與錦葵目錦葵科中的可可NAC 2-like（XP_007048529.2）和哥倫比亞錦葵NAC 2-like（XP_021274745.1）及同目木棉科中榴蓮NAC 2-like（XP_022774837.1）分布在一個小支上（圖3），說明同屬于熱帶木本植物的這類NAC轉錄因子的進化關系最近。ExPASy在線工具分析顯示，AsNAC2蛋白分子式為C1463H2214N396O429S14，相對分子質量為32.663，理論等電點為6.61，不穩定系數為33.80，屬于穩定蛋白質，親水性平均系數為?0.687，屬親水性蛋白。TargetP 5.0 Server分析顯示AsNAC2不具有信號肽，為非分泌蛋白；WoLFPSORT亞細胞預測定位結果表明該蛋白定位在細胞核中。TMHMM工具分析顯示，AsNAC2編碼的蛋白不存在跨膜結構域，是非膜蛋白。

黑色表示氨基酸在這8個NAC序列中100%相同，紅色表示相同率不小于75%，黃色表示相同率不小于50%

圖3 AsNAC2和其他植物的同源NAC蛋白的系統進化樹

3.3 白木香AsNAC2基因的表達模式分析

運用qRT-PCR技術檢測基因在健康白木香不同組織中的表達情況（圖4）。如圖所示基因主要在根和莖中表達，在葉片中的表達量最低（圖4）。為了研究此基因在傷害誘導白木香結香過程的作用，本實驗進一步分析了白木香莖在全斷干傷害后基因的表達模式（圖5）。結果顯示，在白木香莖受到全斷干傷害后，基因的表達量顯著增加，在2 h達到最高峰，約為對照（健康）的6.8倍。隨后呈現緩慢的下降趨勢，在48 h左右基本恢復正常（圖5）。

圖4 AsNAC2基因在健康白木香不同組織中的表達特征

圖5 機械傷害脅迫下白木香莖中AsNAC2基因的表達情況

4 討論

本研究首次從白木香中克隆了基因。生物信息學分析表明，AsNAC2蛋白在N-端具有NAC轉錄因子特有的典型的NAM結構域，含有A、B、C、D和E 5個亞結構域，在C-端具有一個高度變異的轉錄激活區[18]，而且和其他植物中已經報道的NAC蛋白具有較高的同源性及相類似的理化特性。由此推斷，本研究中獲得的AsNAC2屬于NAC家族轉錄因子。

已有研究表明NAC轉錄因子在擬南芥木質組織的細胞壁加厚和楊樹次生細胞壁的形成過程中起著重要的調控作用。例如擬南芥NAC轉錄因子VND7調控了導管次生壁的形成[19]，SND1在纖維次生壁的加厚過程中起到了關鍵的調控作用[20]，在擬南芥中過量表達楊樹NAC轉錄因子PtrWND2B和PtrWND6B，能夠恢復NST1和NST3雙突變引起的維管束間纖維細胞次生壁缺陷的表型[21]。本研究發現，基因主要在白木香莖和根中表達，而其蛋白與熱帶木本植物可可和榴蓮等NAC蛋白關系最近。另外Pascual等[22]認為NAC轉錄因子在木本植物的木材形成和應對脅迫過程中具有保守的調控機制。綜上說明，AsNAC2轉錄因子可能與白木香木材細胞的形成有關。

Ooka等[18]根據水稻和擬南芥NAC結構域的氨基酸序列的相似性將NAC轉錄因子家族分為2個大組和18個亞組。同一亞組的NAC蛋白，不僅結構域的氨基酸序列相似性非常高，而且還通常具有相似生物學功能[23]。系統進化樹表明，白木香AsNAC2蛋白屬于ATAF亞組。擬南芥ATAF亞組中的ATAF1（ANAC002）轉錄因子正向調控了淀粉粒的降解[24]。白木香在受到傷害形成沉香的過程中，最明顯的變化之一就是淀粉粒的消失[25]。本研究發現全斷干法傷害后，基因的表達量顯著上調。綜上說明，AsNAC2轉錄因子可能與傷害誘導白木香淀粉粒降解有關。

本研究從白木香中克隆獲得一個NAC轉錄因子AsNAC2，并發現該轉錄因子可能與白木香木材細胞的生長和傷害誘導淀粉粒的降解有關，豐富了“傷害誘導白木香防御反應形成沉香”的理論。目前課題組正對其進行亞細胞定位和轉錄活性分析，并預期通過轉基因研究，進一步解析AsNAC2轉錄因子在白木香生長發育，尤其是傷害誘導白木香結香過程中的功能。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Molecular cloning and expression characterization of a transcription factor AsNAC2 in

ZHANG Yu-xiu1, LIU Pei-wei1, LV Fei-fei1, YANG Yun1, XU Yan-hong2, GAO Zhi-hui2, WEI Jian-he1, 2

1. Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine & Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Agarwood Sustainable Utilization, Hainan Branch of the Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Haikou 570311, China 2. Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education & National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China

To molecular clone transcription factor ofencoding gene AsNAC2, a rare southern medicine sedum-based plant, in order to analyze its bioinformatics and expression pattern.The full length of the coding sequence (CDS) was obtained by PCR using total RNA reverse transcribed cDNA from the stems ofas the template; Bioinformatics software was used to predict the physicochemical properties, structural domains and subcellular localization of the protein; DNAMAN8.0 and MEGA6.0 were used to perform multiple sequence alignment and evolutionary relationship analysis, respectively. The expression characteristics ofgene under different tissues and injury stresses were examined by qRT-PCR.gene (GenBank accession MT130201) was cloned from; The full length of open reading frame (ORF) was 864 bp. Codification Code a weakly acidic, stable hydrophilic protein consisting of 287 amino acids, which was localized in the nucleus and no transmembrane structural domain existed. Sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that the-terminal AsNAC2 protein had a typical NAM structural domain and was closely related to,and,. NAC 2-like proteins in the mallow order, belonging to the ATAF subgroup of the NAC transcription factor family. qRT-PCR results showed that AsNAC2 gene was mainly expressed in the roots and stems of healthy, and whole-break dry injury significantly induced the up-regulation ofgene expression in the stems, reaching a peak at 2 h, and then slowly decreasing until 48 h when it basically returned to normal.The AsNAC2 gene was cloned and characterized fromfor the first time, which is susceptible to injury-induced expression and correspondingly early in the injury.

(Lour.) Gilg; transcription factor; NAC; cloning; expression analysis

of agarwood–perfumery in eastern Asia and the Asian neighbourhood [J]., 2013, 23(1): 103-125.

R286.12

A

0253 - 2670(2022)15 - 4807 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.024

2021-12-06

國家重點研發計劃項目（2018YFC1706400）；海南省基礎與應用基礎研究計劃（自然科學領域）高層次人才項目（2019RC343）；國家自然科學基金青年基金項目（81703651）；中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程項目（2021-I2M-1-032）

張玉秀，女，助理研究員，研究方向為藥用植物資源保護和開發。E-mail: scauzyx@163.com

通信作者：劉培衛，副研究員，研究方向為藥用植物解剖與分子生物學。E-mail: brucelpw@aliyun.com

魏建和，研究員，博士生導師，研究方向為藥用植物基因資源與分子育種及次生代謝產物調控研究。Tel: (010)57833016 E-mail: wjianh@263.net

[責任編輯 時圣明]