枸骨法尼基焦磷酸合酶IcFPS2基因克隆與原核表達分析

涂 逸，曾 慧，張威威，許 鋒，廖詠玲，葉家保

枸骨法尼基焦磷酸合酶基因克隆與原核表達分析

涂 逸，曾 慧，張威威*，許 鋒，廖詠玲，葉家保

長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025

克隆枸骨三萜皂苷生物合成途徑中關鍵酶法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，）基因，對其進行組織特異性表達分析，構建原核表達載體并進行重組蛋白誘導表達，探究其參與調控三萜皂苷生物合成的功能。結合枸骨轉錄組數據設計特異性引物，采用PCR技術從枸骨葉中擴增得到了基因的cDNA序列，對其進行生物信息學分析；通過實時熒光定量進一步分析其組織表達特異性，構建原核表達載體pET32a-，并轉化至大腸桿菌BL21（DE3）pLysS感受態細胞，經異丙基-β--硫代半乳糖苷（IPTG）誘導重組蛋白的表達?；蜷L1259 bp，開放閱讀框為1050 bp，編碼350個氨基酸，其蛋白質相對分子質量和等電點分別為40 200、5.54。氨基酸序列比對分析表明枸骨與梔子、杜仲、甘草、絞股藍、竹節參的FPS氨基酸序列具有較高的同源性。系統進化樹分析顯示，蛋白與西洋參、人參、竹節參FPS蛋白聚為一支，表明枸骨FPS蛋白可能與雙子葉植物五加科FPS蛋白在功能上較為接近。實時熒光定量PCR分析表明，基因在根中的表達量最高，其次是葉，而后是雄花和莖，該基因在雌花中表達水平最低。原核表達分析結果顯示，構建的pET-32a載體能在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達，SDS-PAGE結果顯示，誘導的重組表達蛋白相對分子質量在45 000左右，與預測的IcFPS2蛋白大小基本一致。通過對基因的全長cDNA 克隆與生物信息學分析、組織表達特異性分析和原核表達載體的構建，為后續進一步研究法尼基焦磷酸合酶基因在枸骨三萜皂苷生物合成途徑的功能供科學依據。

枸骨；法尼基焦磷酸合酶；克?。槐磉_分析；原核表達

枸骨L.為冬青科（Aquifoliaceae）冬青屬常綠灌木或小喬木，在我國長江中下游地區各省均有栽培。枸骨是一味傳統的藥食同源植物，其主要藥用部位是枸骨的干燥葉，常用于治療風濕痹痛、肺癆咳嗽、勞傷失血等癥狀[1]，同時也是“苦丁茶”的主要原料之一[2]。三萜皂苷（triterpenoids saponins）是枸骨的主要活性成分[3]，現代藥理學研究表明枸骨三萜皂苷具有調血脂、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用[4-8]。三萜皂苷還廣泛分布于人參[9]、金鐵鎖[10]、三七[11]、無患子[12]等藥用植物中。近年來隨著枸骨藥用價值不斷被挖掘，醫藥等行業對枸骨的需求日益增加。因此，研究枸骨三萜皂苷的分子機制及提高枸骨藥材中三萜皂苷的含量具有重要意義。

枸骨三萜皂苷主要是通過甲羥戊酸途徑合成而來的，法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，）是該生物合成途徑中的一個關鍵酶。是甲羥戊酸途徑中的主鏈延伸酶，催化二甲基烯丙基二磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）和香葉基二磷酸（geranyl diphosphate，GP）與異戊烯基二磷酸的連續縮合生成法尼基二磷酸（farnesyl diphosphate，FPP）；也是第一個承擔流向各個化合物分支點反應底物的酶[13]。因此，FPS蛋白的活性和功能會影響下游萜類物質的合成[13]。目前，基因已在廣藿香[14]、赤芝[15]、獨行菜[16]、千里光[17]等多種植物中被成功克隆與鑒定。本研究從枸骨葉中擴增得到基因序列，并進行生物信息學分析，組織表達模式分析，以及原核表達研究，以期為進一步弄清枸骨基因的功能，解析三萜皂苷合成通路奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

枸骨的根、莖、葉、雄花和雌花組織采摘于長江大學校園，液氮速凍后轉至?80 ℃冰箱保存，用于后續RNA提取和基因表達分析。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和cDNA合成 從?80 ℃取出凍存的枸骨各組織材料，使用液氮研磨至粉末，依據TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit提取試劑盒說明提取各組織的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和和核酸濃度檢測儀檢測RNA的質量、完整性以及濃度。按照PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒說明進行cDNA第一鏈反轉錄。

1.2.2 枸骨基因的克隆 根據枸骨轉錄組數據[18-20]挖掘出2條法尼基焦磷酸合酶基因序列，分別為、，本研究對其中的一個展開試驗。利用Primer5軟件設計特異性克隆引物（表1），以枸骨cDNA為模板進行PCR反應。反應體系共50 μL，包括2×Rapid Taq Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，cDNA 1 μL及ddH2O 20 μL。PCR反應條件：95 ℃、3 min，95 ℃、15 s，58 ℃、15 s，72 ℃、30 s，共35個循環，最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，按照FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit試劑盒純化回收擴增產物，將回收產物連接至pMD18-T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態，37 ℃ 200 r/min振蕩培養1 h，涂布于含50 μg/mL Amp的LB培養平板上，37 ℃倒置培養過夜。挑取單菌落活化并進行菌液PCR驗證，將陽性的單克隆菌液送至上海生物工程公司測序。

1.2.3 枸骨基因的生物信息學分析 利用NCBI-BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BlAST/）在線工具進行序列同源比對，DNAMAN軟件完成蛋白質序列翻譯，采用在線工具SPOMA進行蛋白質二級結構預測，使用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）進行蛋白理化性質分析。利用Vector NTI Suite V11.5軟件對多種植物的FPS蛋白進行氨基酸序列比對分析，利用Clustal X 2. 0和MEGA 6.0軟件，采用鄰接法（NJ）構建系統進化樹，使用Bootstrap對系統樹可信性進行檢驗，重復1000次。

1.2.4基因的組織特異性表達分析 根據TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒和PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒說明書，分別提取枸骨新鮮組織根、莖、葉、雄花和雌花的總RNA并反轉錄為cDNA。根據基因cDNA序列設計定量引物，qRT-PCR內參基因選用的是（表1）。反應總體系為20 μL，包括2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，正反引物各0.4 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。反應程序為95 ℃、30 s，95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，共35個循環，溶解曲線為95 ℃、15s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。qRT-PCR實驗分別設置一個陰性對照，基因相對表達量使用2-ΔΔCt方法[18]計算，進行3次生物學重復與3次技術重復。

1.2.5 原核表達分析 為了鑒定基因的生物學功能，利用pET32a載體，進行了該基因的原核表達分析。實驗選擇I和Ⅲ作為酶切位點，設計含酶切位點的擴增引物（表1）。以枸骨葉cDNA為模板擴增獲得基因序列，進行膠回收純化，采用北京全式金生物質粒提取試劑盒提取pET32a質粒。采用雙酶切法，分別對基因和pET32a質粒進行酶切，酶切產物純化后使用T4連接酶連接。用熱激法將重組質粒載體pET32a-轉入DH5α大腸桿菌感受態，活化后涂布在含有Amp的LB平板上，37 ℃過夜培養，菌液PCR篩選陽性單克隆，送至上海生物工程公司測序。將構建成功的重組質粒pET32a-轉化大腸桿菌BL21（DE3）pLysS感受態，經菌落培養、PCR鑒定后挑選陽性單菌落到含Amp的LB液體培養基中活化12 h。取活化好的菌液按1∶50的稀釋比例加至含有抗生素的50 mL LB培養基中，37 ℃恒溫搖床200 r/min培養到600值0.6～1.0，加入不同濃度的IPTG，28 ℃誘導蛋白表達0、4、8 h，以轉化空載體pET32a的表達作為對照。收集誘導菌液，在4 ℃以5000 r/min冷凍離心5 min得到菌體沉淀，使用200 μL蛋白提取緩沖液重懸菌體，低溫下超聲破碎菌體30 min，12 000 r/min冷凍離心10 min得到樣品上清蛋白，取10 μL進行SDS-PAGE電泳檢測。

表1 引物序列信息

2 結果與分析

2.1 IcFPS2基因cDNA克隆與序列分析

以反轉錄的cDNA為模板，利用PCR和TA克隆得到基因的cDNA序列（圖1），經測序和在線工具NCBI-Blast比對，此cDNA序列與其他物種的FPS基因序列具有較高的一致性，說明克隆獲得的cDNA序列為枸骨的基因，命名為。該cDNA長為1259 bp，開放閱讀框（open reading frame，ORF）為1050 bp，編碼350個氨基酸（圖2）。

圖1 IcFPS2基因擴增

圖2 IcFPS2基因cDNA序列和推測的氨基酸序列

2.2 枸骨IcFPS2蛋白的生物信息學分析

2.2.1 枸骨IcFPS2蛋白的理化性質分析 分析發現，IcFPS2蛋白的相對分子質量為40 200，理論等電點為5.54；SOPMA分析IcFPS2蛋白二級結構顯示α螺旋、無規則卷曲和β轉角占比分別為63.04%、27.51%、2.87%；在線工具BlASTP（NCBI）和Align X（Vetctor NTI 11.5）軟件分析顯示，蛋白屬于類異戊二烯合成酶（isoprenoid_biosyn_C1）超家族的成員。

2.2.2 枸骨IcFPS2蛋白質的同源比對 利用Vetctor NTI 11.5軟件對枸骨2個基因的氨基酸序列進行比對，同源性為83.7%，屬于同源蛋白。且將與及其他物種基因編碼的氨基酸序列進行序列比對，結果顯示與其他植物基因編碼的蛋白序列高度同源（圖3），其中與梔子（AYC62332.1）的FPS蛋白質一致性最高，高達90.26%，與杜仲（APG79413）、橡膠樹（ALR72606）、米團花（ALT07952）、甘草（ADE18770）、胡椒薄荷（AAK63847）、假馬齒莧（ADV03080）、絞股藍（AII72208）和竹節參（AKN52395）等FPS蛋白質的一致性均在80%以上，分別為88.83%、87.98%、87.11%、87.10%、87.9%、86.82%、86.51%、86.22%。

2.2.3 枸骨IcFPS2蛋白質的系統進化分析 為了研究枸骨IcFPS2蛋白質與及其他植物FPS蛋白質的親緣關系，基于的氨基酸序列，利用BlastP在線工具，檢索了人參C. A. Meyer、西洋參L.、竹節參s (T. Nees) C. A. Meyer、一串紅Ker-Gawler、梔子Ellis等11種植物的FPS蛋白序列，采用ClustaIX 2.0和MEGA 6.0軟件構建了FPS蛋白序列系統進化樹（圖4）。進化樹結果顯示，IcFPS1蛋白和IcFPS2蛋白都與人參、西洋參和竹節參的蛋白聚類在同一分支上，表明枸骨FPS蛋白可能與雙子葉植物五加科FPS蛋白在功能上較為接近。在枸骨中，推測IcFPS1、IcFPS2可能協同調控枸骨萜類化合物的合成。

一致氨基酸用白色前景和黑色背景表示；保守氨基酸用白色前景和灰色背景表示；非相似氨基酸用黑色前景和白色背景表示；紅色框表示顯著相似性的7個區域；黃色框表示高度保守區域

圖4 不同物種FPS基因的系統進化樹

不同字母表示差異顯著，P＜0.05

2.3 IcFPS2基因表達水平分析

為了探究基因的生物學功能，通過qRT-PCR檢測了在枸骨根、莖、葉、雄花和雌花中的表達模式。結果如圖5顯示，基因在枸骨各個器官中均有表達；其中，在根中的相對表達量最高，其次葉，而后是雄花、莖，在雌花中的表達量最低。該結果表明基因在枸骨的表達具有組織器官特異性。有研究表明，植物基因表達具有組織特異性，并且伴隨著類異戊二烯衍生物含量增加而增加[19]。前期研究發現，枸骨齊墩果酸在根中含量最高，熊果酸在葉片中含量最高；三萜化合物總含量在根中最高，其次是葉和果實[20]。本研究中基因也在根中的相對表達量最高，與三萜皂苷組織分布呈現一致性，因此，推測可能也與枸骨三萜皂苷的生物合成量密切相關。

2.4 IcFPS2基因的原核表達分析

本研究利用酶切位點I和III，通過雙酶切法構建了pET32a-原核表達載體。挑選轉入大腸桿菌的克隆子，PCR擴增得到了大小約1100 bp的條帶（圖6），與目的片段大小一致；進一步測序驗證條帶正確，表明原核載體IcFPS2-pET32a構建成功。將構建成功的重組pET32a-原核表達載體導入大腸桿菌BL21（DE3）pLysS中，加入不同濃度的IPTG，在28 ℃條件下誘導蛋白表達，0、4、8 h后取樣處理后進行SDS-PAGE電泳檢測。結果如圖7所示，以大腸桿菌BL21（DE3）pLysS為宿主菌，1 mmol/L IPTG，28 ℃、200 r/min振搖誘導22 h為條件，在45 000附近位置出現了特異蛋白帶，特異蛋白帶大小符合預期。未經誘導的含有重組質粒pET32a-的菌株不表達該蛋白。說明原核表達載體pET32a-構建成功，并通過IPTG誘導成功表達。且1 mmol/L IPTG條件下的pET32a-重組質粒成功在4 h和8 h時間內誘導出目的蛋白條帶，但未經誘導的重組質粒不表達該蛋白。

圖6 pET32a-IcFPS2重組質粒陽性克隆檢測

M-Marker 1-空載體pET32a 2～3-1 mmol/L IPTG誘導空載pET32a表達0、4 h 4-未經誘導的重組質粒pET32a-IcFPS2 5～7-1 mmol/L IPTG誘導重組質粒pET32a-IcFPS2 0、4、8 h。

3 討論

三萜皂苷廣泛分布在植物界中，在枸骨、人參、三七、黃芪、絞股藍等植物中的含量較高。枸骨三萜皂苷不僅參與植物病原體、病害的防御、生長發育和感覺調控作用外，還具有抗炎、抗腫瘤、抗菌等多種藥理功效[21]。隨著枸骨藥用價值不斷被挖掘，枸骨三萜皂苷生物合成途徑也受到了越來越多學者的關注。為了進一步探究枸骨三萜皂苷生物合成途徑中關鍵酶和目標基因的分子調控機制，本研究基于枸骨轉錄組數據，通過PCR技術成功的從枸骨葉中擴增得到了1個基因的全長cDNA序列。同源氨基酸序列比對表明，IcFPS2蛋白與IcFPS1蛋白的一致性為83.7%，且IcFPS2的蛋白與梔子、杜仲、橡膠樹、米團花、絞股藍、甘草、竹節參等植物的FPS蛋白高度同源。還有來自原核和真核的所有FPS的顯著相似性的7個區域I～VII幾乎相同[22]，其中II和VI區域富含高度保守的天冬氨酸序列，分別為DDXX（XX）D（D為天冬氨酸，X為任意氨基酸），被稱為FARM；另一個是DDXXD，被稱為SARM[23]。此外，系統進化樹分析顯示IcFPS1、IcFPS2蛋白與五加科FPS蛋白在進化關系上較近，推測、可能協同調控枸骨萜類化合物的合成。

三萜皂苷的分布具有組織和器官特異性，如人參C. A. Meyer、桔梗(Jacq.) A. DC.靈芝(Curtis) P. Karst、三七的根，麥藍菜(Miller) Rauschert）的種子，羅漢果(Swingle) C. Jeffrey ex A. M. Lu et Z. Y. Zhang的果實和積雪草的莖、葉，白樺suk.樹皮和樹葉等部位均積累著豐富的三萜皂苷[24]。本研究實時熒光定量結果顯示基因在枸骨的五個組織中的表達量存在差異性，其中在根中的表達量最高。目前已在多種植物中進行了基因的分離與功能驗證，如千里光基因在花、葉、莖和根中均有表達，在根和葉中的表達量最高[17]；金鐵鎖基因在根、葉、莖中均有差異表達，且在根中的表達量最高[25]；枸骨在根中的基因表達量最高，葉中表達量次之，雄花中較低，在莖和雌花中的表達量最低[26]；橡膠草在橡膠草的葉片中表達量最高，根、葉柄、種子次之，花中表達量最低[27]；金線蓮中的在根和莖中的相對表達量高，葉次之[28]；杜仲在葉片和果實中廣泛表達[29]。這與本研究的基因表達結果相似。而人參基因的表達水平隨著生長周期的增加呈明顯遞減的趨勢，其中在展葉期的表達量最高，而根中的表達量趨于0[30]；刺五加在幼莖中的表達量最高，葉柄和根次之，葉片中的表達量最低[31]。這些研究表明基因的轉錄水平在不同組織中表達可能與次生代謝產物的合成積累部位有關，而在不同的植物中又存在一定的個體差異性。法尼基焦磷酸合酶是甲羥戊酸途徑中偏上游的第一個分支點的限速酶，在三萜皂苷合成途徑中起著至關重要的作用。采用過表達方式提高三七的轉錄水平，有利于促進三七皂苷的積累[32]；劉美佳等[33]研究發現轉基因珠子參比野生型珠子參含有更高的皂苷含量。因此，通過調控基因的表達水平將有助于提高枸骨三萜皂苷的含量。

為更進一步研究基因在枸骨中的功能，構建了pET32a-載體，并且在大腸桿菌中異源表達，獲得分子質量約為45 000的重組蛋白。

原核生物中表達載體有多種，其中pET是目前使用最為廣泛且很便捷的載體之一[34]；同時，BL21（DE3）是一種高效表達且成本較低的表達系統[35]。與昌燕李[36]研究木薯的結論一致，本研究所選用的pET32a載體和大腸桿菌BL21（DE3）可以高效、大量地誘導IcFPS2蛋白表達。周晨等[37]利用大腸桿菌構建澤瀉基因的原核表達載體，為后期提高澤瀉中原萜烷型四環三萜含量提供了科學依據；梁良等[38]成功獲得白木香pET28a重組蛋白，為揭示沉香倍半萜形成的分子機制奠定了基礎；李鐵錚等[39]首次在大腸桿菌中表達了白木香的AsERF1蛋白，后期希望能夠在蛋白水平上研究白木香中的生物學功能奠定了分子基礎。還有單婷玉等[40]利用大腸桿菌構建山楂鯊烯合酶、基因的原核表達載體，為進一步研究山楂三萜生物合成途徑提供了理論依據。

本研究為進一步通過轉基因驗證基因的生物學功能奠定了基礎，為后續通過基因工程手段提高枸骨三萜皂苷含提供了一定的理論依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cloning and prokaryotic expression analysis of farnesyl pyrophosphate synthasegene from

TU Yi, ZENG Hui, ZHANG Wei-wei, XU Feng, LIAO Yong-ling, YE Jia-bao

College of Horticulture and Gardening, Yangtze University, Jingzhou 434025, China

To clone the key gene of chalcone synthase farnesyl diphosphate synthase () in triterpenoid saponins biosynthetic pathway of, analyze tissue-specific expression of the chalcone synthase, construct the prokaryotic expression vector and induce the recombinant protein to express, explore its function in regulating the biosynthesis of triterpenoid saponins.Based on the transcriptome data ofin the previous study, the full-length cDNA ofwas cloned by PCR from the leaves ofand bioinformatics analysis was performed. The qPCR was used to further analyze the tissue-specific expression of. The prokaryotic expression vector pET32a-was constructed, transformed into BL21 (DE3) pLysS competent cells and the expression of recombinant protein was induced by IPTG.The size ofgene was 1259 bp, containing an open reading frame (ORF) of 1050 bp and encoding 350 amino acids, its protein molecular weight and isoelectric point are 40 200 and 5.54, respectively. Amino acid sequence alignment analysis showed thatamino acid sequences ofhad high homology with those of,,,and. Phylogenetic tree analysis showed that the IcFPS2 protein clustered with the FPS proteins of,ands, suggesting that the FPS protein ofmay be functionally close to the FPS protein of the dicotyledonous plant Pentaphyllaceae. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that the expression ofgene was highest in roots, followed by leaves, and then male flowers and stems, and the gene was expressed at the lowest level in female flowers. The results of the prokaryotic expression analysis showed that the constructed pET32a-vector could be successfully expressed inBL21 (DE3), and the SDS-PAGE results showed that the induced recombinantly expressed protein was around 45 000, which was basically consistent with the predicted IcFPS2 protein size.The full-length cDNA cloning and bioinformatics analysis ofgene, tissue-specific expression analysis and prokaryotic expression vector construction were used to provide scientific basis for further research on the function of farnesyl pyrophosphate synthase gene in triterpenoid saponins biosynthetic pathway of

L.; farnesyl pyrophosphate synthase; clonig; expression analysis; prokaryotic expression

R286.12

A

0253 - 2670(2022)15 - 4813 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.025

2021-12-13

國家自然科學基金資助項目（31500546）

涂 逸，碩士研究生。研究方向為主要從事林木次生代謝分子調控機制研究。E- mail: ty1102903626@163.com

通信作者：張威威，博士，副教授。研究方向為主要從事林木次生代謝分子調控機制研究。E-mail: wwzhangchn@163.com

[責任編輯 時圣明]