復合藻對D-半乳糖誘導小鼠衰老模型皮膚屏障功能的改善作用

時間、激素、飲食、環境污染及太陽輻射等均可導致皮膚老化現象的發生

。真皮膠原細胞外基質是維持皮膚力量和彈性的主要功能組織

。膠原蛋白（Collagen）超家族一共被劃分為8個家族，28種不同類型的膠原蛋白

，其中皮膚內部Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白最豐富，它們是皮膚真皮層細胞外最主要的基質（ECM）。Ⅰ型膠原占皮膚ECM的80%～85%，而Ⅲ型膠原占8%～11%

。

海洋大型藻類富含大量生物活性物質，其在中醫中早已用于皮膚疾病的治療，具有抗氧化、抗炎、抗菌及抗過敏等作用

。課題組通過開發一種由褐藻（海帶、墨角藻、巨藻）及小球藻以適宜比例組成的復合藻，發現其可以通過上調Sirt3表達，促進線粒體能量代謝水平，改善紫外線誘導的皮膚光老化

，但是該復合藻在對皮膚膠原蛋白含量及其修復皮膚屏障功能中的研究尚未明確，因此本研究通過采用D-半乳糖誘導小鼠皮膚衰老及D-半乳糖刺激的小鼠原代皮膚成纖維細胞損傷模型考察復合藻對小鼠皮膚膠原蛋白及其屏障功能的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑：復合藻提取物[褐藻（海帶、墨角藻、巨藻）及小球藻混合組成，成都丁因科技有限公司]；Sirt3抗體（abcom，美國）；Nrf2抗體（abcom，美國）；GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；其他試劑均為國產分析純。

此外，邢孟志[14]從文字學、金石學視角出發提出，清初文字學、金石學家的研究，促使清代碑學運動自清早期開始萌芽，中期以阮元、包世臣為代表。掃盡帖學低眉柔靡之風、倡導碑學質樸雄強面貌的學術運動，仍是在篆隸書的領域展開的，而清代篆隸的復興正是文字學、金石學研究的結果。碑學運動也是受文字學、金石學直接影響的產物，這一影響帶來了書法理論和書法創作上審美取向的根本改變，這一改變豐富了書法創作的理論內容，拓展了書法創作的空間。

1.2 儀器：二氧化碳培養箱(Sigma，公司)；生物潔凈工作臺(蘇州安泰空氣有限公司)；多功能酶標儀（Tecan Mpro200，瑞士），Western blot電泳及化學成像系統（Bio-red，美國）。

路基兩側需要進行加寬處理，方式為拼接，控制加寬寬度約為4.5 m。在對路基加寬處理時，首先將外圍車道進行封堵，然后開始加寬部分的施工，在路基加寬施工期間，為了不給交通帶來太大的壓力，極可能保持雙向車道可以通車，施工過程如圖2所示。

2.1 復合藻對D-半乳糖誘導的小鼠皮膚衰老模型含水量的影響：D-半乳糖干預可以導致小鼠皮膚水分發生明顯損失，在造模的第8周模型組小鼠皮膚與正常對照組比較差異有統計學意義（

＜0.05）；復合藻干預后，小鼠皮膚水分損失現象有降低趨勢，在第8周復合藻高劑量組與模型組比較差異有統計學意義（

＜0.05）。見圖1。

1.3.2 小鼠皮膚水分測定：采用皮膚水分測試儀在建模及給藥干預完成后分別測定各組小鼠皮膚水含量，監測小鼠皮膚含水變化。

馬克思主義認為，社會作為一個有機體是由多個子系統集成的，社會整體觀要求我們看到整體聯動的優越性，要求我們確立整體大于部分觀念。習近平指出，共產黨人的初心就是為了實現人民的根本利益，就是要堅持以人民為中心的發展思想，這也是對社會各子系統運行的總規范。具體說來要把握好以下三個理念：

1.3.3 小鼠皮膚組織生化指標測定：建模及給藥干預完成后，處死小鼠，取100 mg小鼠背部皮膚，并除去皮下脂肪和結締組織，加入生理鹽水勻漿后，4℃、3 000 r/ min條件下離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明檢測皮膚組織中羥脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）、透明質酸（Hyaluronic acid，HA）及皮膚總蛋白含量。

1.3 方法

2.2 復合藻對小鼠皮膚中羥脯氨酸、透明質酸含量的影響：模型組小鼠皮膚中羥脯氨酸、透明質酸含量均顯著降低，與正常對照組比較差異具有統計學意義（

＜0.05）；中、高劑量復合藻干預可以明顯升高小鼠皮膚羥脯氨酸含量，高劑量復合藻干預可升高透明質酸的含量，且與模型組比較差異均具有統計學意義（

＜0.05）。因此給予D-半乳糖可以明顯降低小鼠皮膚羥脯氨酸、透明質酸含量，而復合藻干預后可以明顯抑制D-半乳糖導致的小鼠皮膚羥脯氨酸、透明質酸的丟失，升高小鼠皮膚中羥脯氨酸、透明質酸含量。見圖2。

1.3.5 D-半乳糖誘導小鼠皮膚成纖維細胞衰老模型的建立：采用5～7 d昆明乳鼠的背部皮膚，Ⅰ型膠原酶消化法分離獲得小鼠皮膚成纖維細胞。細胞培養于二氧化碳孵育箱中，采用高糖DMEM培養基培養。采用D-半乳糖（20 g/L）的培養基，刺激建立成纖維細胞衰老模型。模型建立的同時給予復合藻提取物干預，復合藻的濃度為5、25、50 μM。細胞板離心后收集上清液，細胞中每孔加入200 μl 1%的Triton-X 100裂解液，4℃放置30 min后，分別收集至96孔板中，根據ELISA試劑盒說明書分別檢測Ⅰ型（COL1A2）、Ⅲ型膠原蛋白（COL3A1）和纖連蛋白的表達量（E）。相對表達倍數計算公式為：相對表達倍數=E

/E

。

1.3.6 實時定量PCR：實時定量PCR檢測細胞中的mRNA表達。用Trizol常規方法提取總RNA。采用紫外分光光度計檢測OD

/OD

，將1μg總RNA采用逆轉錄試劑盒反轉錄成20 μl cDNA。采用RocheR FastStart Essential DNA Green Master進行實時定量，擴增反應引物（見表1）。擴增條件：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，40個循環。溶解曲線分析表明PCR反應產物為單獨的雙鏈DNA。用2

值法，以β-actin表達為內參定量其他mRNA的表達。

南宋周密《武林舊事》的記錄更有意思了，“小經紀”逐條羅列了杭州城的各種小商品與寵物服務，其中有“貓窩、貓魚、賣貓兒、改貓犬”，貓窩、貓魚、賣貓兒的含義好理解，“改貓犬”很可能是給寵物貓、寵物犬做美容。《宋史·孝義傳》記載，“江州德安陳昉”之家，“有犬百余，共食一槽，一犬不至，群犬不食”。養了一百多條狗，恐怕就不單純是出于實用目的，而應該對狗有特別的感情。又據洪邁《夷堅志》，宋人員琦，“養狗黑身而白足，名為‘銀蹄’，隨呼拜跪，甚可愛。忽失之，揭榜募贖”。這條“甚可愛”的小狗，有名字，有一日丟失了，主人還貼出啟事，懸賞尋狗，顯然員家已將“銀蹄”當成寵物來飼養了。

2.市場化風險合作承包模式。在現有技術、經濟、政策下開發無效益甚至負效益的難采儲量區塊，大港油田提出了在中國石油內部開展市場化風險合作承包的策略，得到中石油集團公司的認可。在嚴格執行中國石油“油氣田開發管理規定”和礦權歸屬不變的前提下，邀請渤海鉆探、長城鉆探、大港油田集團公司3 家企業參加6 個難采儲量區塊的開發競標。通過競標，與渤海鉆探工程有限公司、長城鉆探工程有限公司、大港油田集團有限責任公司3 家企業簽訂了濱海一區、塘沽-長蘆、葉三撥等6個風險區塊的開發協議。生產期間，全部油氣產量歸甲方所有，由甲方按照中國石油相關規定向乙方支付服務費。

2 結果

1.3.1 D-半乳糖誘導的皮膚衰老模型及動物分組：采用18～22 g昆明種小鼠50只，將小鼠隨機分為5組，分別為正常對照組、模型組、復合藻低劑量組（0.25 g/kg）、復合藻中劑量組（0.5 g/kg）及復合藻高劑量組（1 g/kg）。復合藻提取物濃度按照前期預實驗劑量給予。正常對照組皮下注射生理鹽水，其余各組小鼠每天1次皮下注射D-半乳糖（1 g/kg），連續8周，建立亞急性皮膚衰老小鼠模型。在開始注射D-半乳糖4周后，復合藻干預組各組動物皮膚涂抹相應復合藻，每天1次，連續4周。

1.3.4 小鼠皮膚膠原蛋白和纖連蛋白含量檢測：取100 mg小鼠背部皮膚，并除去皮下脂肪和結締組織，加入生理鹽水勻漿后，4℃、3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，檢測Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白和纖連蛋白的表達量（E）。相對表達倍數計算公式為：相對表達倍數=EPTC溶液/E陰性對照。

2.3 復合藻對小鼠皮膚組織老化的影響：正常對照組小鼠皮膚結構完整，真皮層較厚，基底膜可見，毛囊、皮脂腺可見。模型組小鼠皮膚結構紊亂，真皮層顯著變薄，細胞數減少，基底膜不清晰。低、中劑量組小鼠皮膚結構有所改善，皮膚略增厚，真皮層厚度有所恢復，染色較均勻，細胞層數增多；基底膜可見。高劑量組小鼠皮膚結構基本恢復，表皮與真皮界線清晰、規則，染色較均勻，真皮層厚度明顯增加。見圖3。

1.3.7 Western印跡法分析蛋白表達情況：各組細胞轉染48 h后,磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，每孔加入蛋白裂解液后，反復吹打，使細胞充分裂解，95℃～100℃煮沸10 min，10 000 r/min離心10 min，收集的上清液即為樣本蛋白。順序加樣，待電泳分離完全后，采用濕轉法將蛋白轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，TBST充分洗膜后加入特異性一抗GAPDH（1:10 000稀釋）及COL1A1和COL3A1抗體（1:1 000稀釋）。4℃過夜孵育，二抗（1:10 000稀釋）室溫孵育1 h，充分洗膜后加電化學發光（ECL）液顯影，凝膠成像儀自動曝光，并分析灰度值，每個樣本重復3次。

2.4 復合藻對小鼠皮膚COLⅠ﹑COL Ⅲ和纖連蛋白含量的影響：D-半乳糖可以導致小鼠皮膚中屏障功能相關蛋白COLⅠ﹑COL Ⅲ和纖連蛋白的含量明顯減少，模型組與正常對照組比較差異具有統計學意義（

＜0.05）；而給予復合藻干預后，小鼠皮膚中COLⅠ﹑COL Ⅲ和纖連蛋白含量明顯升高，且高劑量組與模型組比較差異具有統計學意義（

＜0.05）。見圖4。

2.5 復合藻對D-半乳糖誘導小鼠皮膚成纖維細胞衰老模型中成纖維細胞活力的影響：D-半乳糖可以導致成纖維細胞活力顯著降低，模型組與正常對照組比較差異具有統計學意義（

＜0.05）；給予復合藻干預后，顯著改善了D-半乳糖誘導的小鼠皮膚成纖維細胞損傷，提高了細胞活力，且中、高劑量組與模型組比較差異具有統計學意義（

＜0.05）。見圖5。

研發阿爾茨海默病藥物的研究人員正在選擇β-淀粉樣蛋白和tau蛋白之外的研究對象，這些蛋白曾經長期被認為是尋求治療方案的關鍵。下面的條狀圖表明：2008年和2017年，國家老齡化研究所對各種不同研究主題資金投入的百分比。

2.6 復合藻對小鼠皮膚成纖維細胞中屏障功能相關蛋白表達的影響：成纖維細胞中COL1A2和COL3A1 mRNA水平降低，蛋白水平表達降低，模型組與正常對照組比較差異具有統計學意義（

＜0.05）；而給予復合藻干預后，成纖維細胞中COL1A2和COL3A1 mRNA水平較模型組顯著升高，高劑量組與模型組比較差異具有統計學意義（

＜0.05）。同時復合藻可促進膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ型在成纖維細胞中的表達，促進細胞屏障功能的恢復，中、高劑量組與模型組比較差異具有統計學意義（

＜0.05）。見圖6～7。

3 討論

真皮細胞外基質中的膠原蛋白為完整皮膚纖維提供附著點和機械阻力，但當皮膚暴露在紫外線下輻照（光老化）或氧化應激（時間老化），活性氧激活信號級聯導致膠原蛋白合成減少，基質金屬蛋白酶含量增加。活性基質金屬蛋白酶可切割膠原細胞外基質，此外被切割生成的膠原蛋白碎片會進一步刺激并通過上調基質金屬蛋白酶表達和下調膠原生成，從而促進皮膚促老化的發生

。

海藻的主要生物活性成分包括：多酚、褐藻多糖、間苯三甲酸酯、類胡蘿卜素等

。有研究從昆布、螺旋藻、石花菜3種海藻中提取海藻多糖，研究發現其具有顯著的抗氧化、吸濕保濕和抗紫外線功效

。同時近期有研究將積雪草苷與海藻酸鈉制備為皮膚修復貼劑，發現家兔皮膚中炎性細胞浸潤較少、新生毛細血管較多

。也有采用海藻多糖敷料制備皮膚修復貼用于面部激光術后皮膚修復，結果表明其功效與透明質酸敷料制備的皮膚修復貼相近

。

本研究采用課題組前期開發的褐藻（海帶、墨角藻、巨藻）及小球藻以適宜的比例組成的復合藻考察其在皮膚屏障功能改善中的作用。膠原蛋白是皮膚延緩衰老的關鍵物質，但該復合藻在膠原蛋白流失的作用有待明確。因此本研究通過采用D-半乳糖誘導小鼠皮膚衰老模型，考察復合藻對其改善作用。D-半乳糖誘導小鼠皮膚衰老是模擬皮膚自然衰老的經典模型，可引起皮膚組織中氧化應激反應的發生，導致皮膚膠原蛋白及相關蛋白酶的顯著改變。本研究結果表明，D-半乳糖刺激后小鼠皮膚中皮膚水分丟失顯著，透明質酸、羥脯氨酸、膠原蛋白和纖連蛋白含量明顯降低，小鼠原代皮膚成纖維細胞活力降低，同時皮膚細胞中COL1A2和COL3A1 mRNA水平降低，膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ型表達顯著降低。復合藻可以明顯改善D-半乳糖刺激導致的小鼠背部皮膚水分丟失，明顯改善模型小鼠中透明質酸、羥脯氨酸含量，升高膠原蛋白和纖連蛋白含量，減少氧化應激指標；復合藻還可顯著改善D-半乳糖導致的小鼠原代皮膚成纖維細胞活力降低，同時促進皮膚細胞中COL1A2和COL3A1 mRNA水平的升高，并促進膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ型的表達。膠原蛋白在皮膚組織中的屏障功能中扮演重要作用，膠原蛋白的缺失或降解均可導致皮膚屏障功能的喪失，導致皮膚褶皺、失水等現象的發生，而復合藻具有顯著的恢復膠原蛋白合成的作用，但其分子機制還有待進一步明確。

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