TM4SF1與腦膠質(zhì)瘤病理分級(jí)及預(yù)后的相關(guān)性

霍宏志 梁 金 柴爾青

膠質(zhì)瘤是成人最常見(jiàn)、最具侵襲性的原發(fā)性顱 內(nèi)腫瘤。目前，膠質(zhì)瘤的治療方法包括手術(shù)、化療和放療，但是效果仍不理想，腦膠質(zhì)瘤的治療仍然是一個(gè)嚴(yán)重的臨床和科學(xué)問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，一些分子與腦膠質(zhì)瘤的個(gè)體化預(yù)后密切相關(guān)。跨膜四蛋白超 家 族 成 員1（transmembrane 4 super family 1，TM4SF1）是一種四聯(lián)體跨膜結(jié)構(gòu)域表面蛋白，屬于L6四聚糖超家族成員，由于含有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，可與多種蛋白（如整合素、受體酪氨酸激酶、免疫蛋白等）形成復(fù)合物，參與多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、粘附、增殖、遷移和侵襲。本文探討TM4SF1與腦膠質(zhì)瘤病理分級(jí)及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 生信分析 從公開(kāi)的腫瘤基因組圖譜（The Can?cer Genome Atlas，TCGA）（https://cancergenome.nih.gov/）篩選腦膠質(zhì)瘤病人數(shù)據(jù)集，包括基因表達(dá)譜和臨床信息，共獲得5 個(gè)正常腦組織、529 個(gè)低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤（low grade glioma，LGG）組織和169 個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）組織，后續(xù)處理排除年齡、總生存時(shí)間數(shù)據(jù)不足或缺失的病例。首先轉(zhuǎn)換RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，將計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為與微陣列結(jié)果更相似的值。為了研究TM4SF1 表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響，根據(jù)TM4SF1的表達(dá)將腫瘤組織分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組。利用基因表達(dá)譜交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis GEPIA）在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）確認(rèn)TM4SF1 表達(dá)與臨床病理信息之間的相關(guān)性。從RNA測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)中分析9 736個(gè)腫瘤組織樣本，并從GTEx 和TCGA 項(xiàng)目中分析8 587 個(gè)正常組織樣本。GEPIA分析TM4SF1差異表達(dá)的生存曲線，以發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)與病人預(yù)后的相關(guān)性。同時(shí)，以疾病狀態(tài)（腫瘤或正常）為變量繪制箱線圖，以計(jì)算TM4SF1基因的差異表達(dá)。

1.2 臨床病例分析

1.2.1 標(biāo)本來(lái)源 收集2014年3月至2017年4月手術(shù)切除的83 例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本，其中男52 例，女31 例；中位年齡54.0歲。LGG共35例，其中彌漫性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤12 例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤13 例，少突星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤10 例。高級(jí)別膠質(zhì)瘤（high grade glioma，HGG）48例，其中間變性星形細(xì)胞瘤18例，間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤13例，GBM 有13例，彌漫性中線膠質(zhì)瘤4 例。排除復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤、合并其他部位原發(fā)性惡性腫瘤、合并嚴(yán)重的基礎(chǔ)性疾病。同時(shí)，收集顱腦損傷內(nèi)減壓術(shù)切除的非腫瘤腦組織標(biāo)本23 例為對(duì)照組，其中男14例，女9例；中位年齡52.0歲。

1.2.2 免疫組化染色法檢測(cè)TM4SF1 蛋白表達(dá) 采用SP 法進(jìn)行免疫組化染色。組織石蠟包埋后切片（4 μm）。二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，10 mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）煮沸修復(fù)抗原。用含0.3%HO的甲醇溶液孵育30 min 抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，用2%正常山羊血清封閉30 min。加入兔抗人TM4SF1 單克隆抗體（1:500，美國(guó)Abgent 公司）4 °C孵育過(guò)夜。PBS 洗滌后，用兔生物素化二抗室溫孵育30 min。用DAB顯色后，用蘇木精復(fù)染，顯微鏡下觀察。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性染色細(xì)胞比例評(píng)估TM4SF1 的表達(dá)（圖1）。染色強(qiáng)度：無(wú)染色計(jì)0 分，淡黃色計(jì)1 分，棕黃色計(jì)2 分，棕色或棕褐色計(jì)3分。陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分比：<5%計(jì)0 分；5%～25%計(jì)1 分，26%～50%計(jì)2 分，51%～75%計(jì)3 分，>75%計(jì)4分。染色強(qiáng)度與染色細(xì)胞百分比乘積≥3分為高表達(dá)。

圖1 免疫組化染色檢測(cè)TM4SF1表達(dá)情況（SP法，×200）

1.2.3 隨訪 至少隨訪5 年。無(wú)進(jìn)展生存期（progres?sion-free survival，PFS）定義為初次手術(shù)到腫瘤進(jìn)展的時(shí)間；影像學(xué)檢查如CT、MRI 和PET 證實(shí)復(fù)發(fā)。總生存期（overall survival，OS）從初次手術(shù)到死亡或最后隨訪的日期。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0軟件分析；定量資料以±

s

表示，采用

t

檢驗(yàn)；定性資料采用

χ

檢驗(yàn)；多因素Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析PFS和OS的影響因素；Kaplan-Meier生存曲線分析TM4SF1表達(dá)水平與PFS和OS的關(guān)系；

P

<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果GEPIA 分析顯示，包括GBM在內(nèi)的多種腫瘤TM4SF1表達(dá)上調(diào)（圖2A）。相較于正常腦組織，LGG 和GBM 組織TM4SF1 mRNA表達(dá)量均明顯升高（

P

<0.05；圖2B）；而且GBM 組織TM4SF1 mRNA 表達(dá)量明顯高于LGG 組織（

P

<0.05；圖2B）。TM4SF1高表達(dá)GBM病人OS較低表達(dá)病人明顯縮短（

P

<0.05；圖2C）。TM4SF1 高表達(dá)LGG 病人PFS、OS 較低表達(dá)病人均明顯縮短（

P

<0.05；圖2C）。

圖2 GEPIA分析腦膠質(zhì)瘤TM4SF1 mRNA表達(dá)及與病人預(yù)后的關(guān)系

2.2 臨床標(biāo)本分析結(jié)果

2.2.1 膠質(zhì)瘤TM4SF1 表達(dá) 膠質(zhì)瘤TM4SF1 高表達(dá)率[50.60%（42/83）]明顯高于非腫瘤腦組織[13.04%（3/23）；

P

<0.01]。HGG 組 織TM4SF1 高 表 達(dá) 率[60.42%（29/48）]明顯高于LGG 組織[37.14%（13/35）；

P

<0.05]。2.2.2 膠質(zhì)瘤生存預(yù)后影響因素 隨訪期間，26 例（31.33%）腫瘤進(jìn)展/復(fù)發(fā)，41例（49.40%）死亡。多因素Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示，TM4SF1高表達(dá)是膠質(zhì)瘤病人生存預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（

P

<0.05；表1、2）。

表1 本文83例膠質(zhì)瘤無(wú)進(jìn)展生存期影響因素的Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析

危險(xiǎn)因素年齡≥60歲男性WHO分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)腫瘤直徑≥2.5 cm術(shù)前KPS評(píng)分≥70分IDH1突變型染色體1p/19q共缺失腫瘤全切除術(shù)后同步放化療TM4SF1陽(yáng)性表達(dá)單因素風(fēng)險(xiǎn)比（95%置信區(qū)間）1.387（0.555～3.466）0.884（0.355～2.204）3.212（1.241～9.047）1.416（0.356～2.612）0.789（0.631～1.850）0.679（0.443～1.705）0.556（0.125～1.371）0.630（0.549～0.828）0.702（0.618～0.881）2.681（1.744～4.566）P值0.484 0.791 0.024 0.131 0.251 0.121 0.212 0.005 0.009 0.012多因素風(fēng)險(xiǎn)比（95%置信區(qū)間）P值1.885（1.294～4.005）0.003 0.776（0.650～0.910）0.867（0.773～0.955）1.435（1.036～3.607）0.004 0.004 0.025

2.2.3 TM4SF1 表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤病人PFS 和OS的關(guān)系Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示，TM4SF1高表達(dá)病人中位PFS 和OS 較低表達(dá)病人明顯縮短（

P

<0.05；圖3）。

圖3 Kaplan-Meier生存曲線分析TM4SF1表達(dá)與膠質(zhì)瘤病人無(wú)進(jìn)展生存期、總生存期的關(guān)系

3 討論

腦膠質(zhì)瘤現(xiàn)已成為僅次于腦卒中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的第二大致死原因。2016年，WHO對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類進(jìn)行了修訂，將分子生物標(biāo)志物與經(jīng)典組織學(xué)特征納入綜合分析，以便盡可能精確地定義不同的膠質(zhì)瘤。這種模式的轉(zhuǎn)變顯著地改變了膠質(zhì)瘤的診治方式。

表2 本文83例膠質(zhì)瘤總生存期影響因素的Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析

危險(xiǎn)因素年齡≥60歲男性WHO分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)腫瘤直徑≥2.5 cm術(shù)前KPS評(píng)分≥70分IDH1突變型染色體1p/19q共缺失腫瘤全切除術(shù)后同步放化療TM4SF1陽(yáng)性表達(dá)單因素風(fēng)險(xiǎn)比（95%置信區(qū)間）1.487（1.155～3.466）1.884（0.655～3.104）2.315（1.125～4.123）1.125（0.523～3.542）0.889（0.731～0.950）0.875（0.812～0.965）0.956（0.875～0.982）0.860（0.799～0.958）0.802（0.768～0.875）1.854（1.544～3.526）P值0.024 0.291 0.014 0.231 0.012 0.005 0.002 0.005 0.008 0.015多因素風(fēng)險(xiǎn)比（95%置信區(qū)間）1.254（1.125～3.856）P值0.031 2.105（1.895～4.265）0.013 0.852（0.786～0.924）0.825（0.786～0.924）0.924（0.882～0.995）0.876（0.820～0.960）0.807（0.776～0.905）1.485（1.106～3.457）0.008 0.009 0.005 0.003 0.006 0.018

我們通過(guò)GEPIA 分析發(fā)現(xiàn)，LGG 和GBM 組織TM4SF1 mRNA 表達(dá)均明顯上調(diào)；同時(shí)，我院臨床標(biāo)本分析顯示，TM4SF1高表達(dá)腦膠質(zhì)瘤病人術(shù)后復(fù)發(fā)或死亡的風(fēng)險(xiǎn)更高。研究表明，TM4SF1在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移方面發(fā)揮著不可或缺的作用。TM4SF1 能夠通過(guò)JAK2/STAT3 信號(hào)通路和PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路促進(jìn)人肝癌細(xì)胞增殖和存活。TM4SF1還可以通過(guò)PARγ-SIRT1反饋環(huán)路調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期。另外，TM4SF1 作為一些miRNAs（miR-141、miR-9、miR-203）的直接靶點(diǎn)，能夠促進(jìn)食管癌和乳腺癌細(xì)胞的自我更新、侵襲和遷移。這些研究結(jié)果顯示TM4SF1 具有促癌基因的活性。然而，也有學(xué)者持不同意見(jiàn)。Peng 等[發(fā)現(xiàn)TM4SF1 在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，TM4SF1 低表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、腫瘤的進(jìn)展和侵襲以及胃癌病人的總體生存率降低有關(guān)。此外，Xu 等認(rèn)為T(mén)M4SF1高表達(dá)與胰腺癌病人生存預(yù)后良好有關(guān)；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 可下調(diào)TM4SF1 表達(dá)并誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。這說(shuō)明TM4SF1 表達(dá)和功能具有一定的組織特異性，其原因可能是TM4SF1 受不同的信號(hào)通路調(diào)節(jié)，不同的亞細(xì)胞位置在不同惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著不同的作用，因而導(dǎo)致不同的臨床預(yù)后。腦膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后與病理分級(jí)密切相關(guān)，例如GBM 是一種高度血管化的腫瘤，病人的5 年生存率大約為10%。然而，本文納入的GBM較少，各亞型腦膠質(zhì)瘤病人納入不均衡可能也影響了最后的多因素分析。但是，不能忽視TM4SF1在腦膠質(zhì)瘤進(jìn)展過(guò)程中的作用。

總之，腦膠質(zhì)瘤組織TM4SF1 呈高表達(dá)，與腫瘤病理分級(jí)、不良生存預(yù)后有關(guān)。