橘紅素通過調控AMPK/SIRT3信號軸影響胃癌AGS細胞自噬的機制

李 強 ,王 剛 ,王 凡 ,李玉慶

1.唐山市協和醫院普外科,唐山 063000;2.唐山市協和醫院急診科,唐山 063000

橘紅素(tangeretin,Tan)是從枳實等中藥中提取的一種多氧甲基黃酮類成分,其對肺癌、胃癌等腫瘤細胞具有一定抑制作用[1]。Tan可能通過抑制細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化和上調細胞周期蛋白B1(cyclinB1)的表達來抑制人胃癌AGS 細胞的增殖,還可通過p53依賴的線粒體途徑和Fas/FasL 介導的死亡受體途徑誘導胃癌AGS細胞的凋亡[2-4]。研究發現,細胞自噬與胃癌發生、發展過程密切相關[5]。因此,本研究通過探究Tan對人胃癌AGS細胞自噬的作用機制,以期為Tan用于胃癌的防治提供新的實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

7300型熒光實時定量PCR 儀(美國Applied Biosystems公司);IX53型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司);JEM-1230型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)。

1.2 試藥

橘紅素(質量分數≥98%,上海研生實業有限公司);腺苷酸激活蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK]激動劑A-769662(美國Biovision 公司);HAM's/F12 培養液(美國Hyclone公司);Triol試劑、反轉錄試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司;兔抗人AMPK單抗、p-AMPK 單抗、沉默調節蛋白(silent mating type information regulation 2 homolog-3,SIRT3)單抗、微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)-Ⅱ單抗均購自美國Cell Signaling Technology 公司;p62 單抗、HRP 標記的山羊抗兔二抗均購自美國Abcam 公司;細胞自噬MDC染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 細胞株

人胃癌AGS細胞株購自美國ATCC(American Type Culture Collection)。

2 方法

2.1 細胞培養

將常規凍存復蘇的人胃癌AGS細胞接種于含體積分數10%胎牛血清的HAM's/F12 培養液中,置于體積分數5% CO2、飽和濕度的培養箱內,37 ℃恒溫培養。用質量濃度0.25 g·mL-1胰蛋白酶消化傳代,2～3 d傳代1次,取處于對數生長期的細胞用于實驗。

2.2 MTT 法檢測細胞抑制率及細胞形態學

取處于對數生長期的AGS 細胞,以1.0×106個·mL-1的密度接種于96孔板,常規培養,待細胞貼壁后,棄去培養基,加入含不同濃度的(5、10、30、60、120 μmol·L-1)Tan的培養基,每個濃度設置5個復孔,分別培養24、48、72 h 后,于每孔中加入20 μL MTT(質量濃度5 g·L-1)溶液,孵育4 h后,棄上清,加入150 μL DMSO 振 蕩10 min,用酶標 儀檢測570 nm 處的吸光度。抑制率=[(1-實驗組A值/對照組A值)]×100%。繪制細胞增殖抑制曲線,計算半抑制濃度(50% inhibitory concentration,IC50),表示抑制50%細胞生長使所需的Tan濃度。觀察不同濃度Tan作用48 h后細胞的形態學變化。

2.3 分組、干預及透射電鏡觀察細胞自噬

取處于對數生長期的細胞,以1×107個·mL-1的密度接種于直徑90 mm 的培養皿,隨機分為激動劑組、對照組、Tan組,待細胞貼壁后棄去培養基,以IC50的Tan 干預細胞(根據后續實驗結果選擇濃度為60 μmol·L-1的Tan),激動劑組加入60 μmol·L-1Tan+質量濃度100 ng·mL-1A-769662的培養基,對照組加入常規培養基,培養2 d,加入質量濃度為0.25 g·mL-1的胰酶消化細胞,以1 200 r·min-1(離心半徑8 cm)離心10 min,收集細胞,加入體積分數為2.5%的戊二醛溶液在4 ℃條件下固定3 d,置于體積分數為1%的四氧化鋨中固定30 min,用醋酸鈾和枸櫞酸鉛定位染色,置于電鏡下觀察細胞自噬情況。

2.4 MDC染色實驗觀察細胞自噬

取處于對數生長期細胞,以1×106個·mL-1的密度接種于6孔板,常規培養,待細胞貼壁后,3個實驗組按前述藥物干預方法處理,繼續培養48 h,用1×wash buffer洗滌2次,加入120 μL MDC 染液,室溫避光染色50 min,離心收集細胞,用1×wash buffer洗滌3次,滴加60 μL 抗淬滅封片液封片后置于4 ℃避光保存,置于熒光顯微鏡下觀察細胞自噬情況。

2.5 AMPK、SIRT3 mRNA 相對表達水平檢測

取處于對數生長期的細胞,用Triol試劑提取細胞總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書中的步驟合成cDNA。qRT-PCR 反應體系:反應總體系20 μL,5×SYBR Green buffer 10 μL,5 μL cDNA 模板、引物(見表1)各1 μL(10 pmol·L-1),用雙蒸水補足20 μL。反應條件:93 ℃預變性2 min,93 ℃變性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,40個循環,72 ℃延伸6 min。全部樣品設置3個平行管。以β-actin為內參基因,用2-△△CT法計算AMPK、SIRT3 mRNA 的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 The primer sequence of gene

2.6 細胞AMPK、SIRT3、LC3II、p62蛋白相對表達水平檢測

取處于對數生長期的細胞,以1×106個·mL-1的密度接種于培養瓶中,待細胞貼壁后,3個實驗組按前述方法處理,并繼續培養,48 h后收集細胞。加入裂解液后放置5 min,離心取上清,測蛋白濃度并統一上樣量,加入SDS上樣緩沖液,100 ℃水浴15 min,進行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結束后進行轉膜。將轉好的膜用1×TBST 沖洗3次,每次2 min,用質量分數為0.5 g·L-1的脫脂牛奶室溫封閉2 h,用1×TBST 洗膜2次,每次2 min,依次加入AMPK、SIRT3、LC3II、p62、β-actin 一抗(1∶2 000),4 ℃孵育過夜,用1×TBST 洗膜3次,每次5 min,加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000),室溫孵育2 h。用1×TBST 洗膜3次,每次5 min,根據ECL化學發光試劑盒說明書滴加發光液,曝光顯影后用凝膠成像分析系統進行灰度掃描。目的蛋白的相對表達水平=目的蛋白的灰度值/內參β-actin的灰度值。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 細胞抑制率

細胞24、48、72 h抑制率組間比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。48、72 h的抑制率均高于24 h(P＜0.05),各濃度Tan 48、72 h抑制率比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。根據細胞增殖抑制曲線,24、48、72 h AGS 細胞對 應Tan 的IC50值分別 為(46.42±5.62)、(59.76±7.01)、(83.56±8.86)μmol·L-1。用60 μmol·L-1的Tan作用48 h,細胞的IC50值接近于50%,選取該濃度作用于細胞48 h進行后續實驗。結果見表2。

表2 不同濃度Tan的細胞抑制率比較 (n=5,)Tab.2 Inhibitory effect of different concentrations of Tan on AGS cells (n=5,)

表2 不同濃度Tan的細胞抑制率比較 (n=5,)Tab.2 Inhibitory effect of different concentrations of Tan on AGS cells (n=5,)

注:與0 μmol·L-1 比較,*P＜0.05;與5 μmol·L-1 比較,#P＜0.05;與10 μmol·L-1 比較,￥P＜0.05;與30 μmol·L-1比較,&P＜0.05;與60 μmol·L-1 比較,△P＜0.05;與24 h比較,▽P＜0.05。

3.2 不同濃度Tan作用48 h后細胞形態學變化

對照組細胞密度均勻,形態正常,生長狀況良好,無壞死脫落;不同濃度Tan作用于細胞后,細胞密度隨著Tan濃度的增加而逐漸降低,細胞皺縮、變圓,脫落和死亡細胞的數量明顯增多。結果見圖1。

圖1 不同濃度Tan作用48 h后AGS細胞形態學變化 (MDC×200)Fig.1 Morphological changes of AGS cells after different concentrations of Tan for 48 hours (MDC×200)

3.3 電鏡觀察細胞自噬

Tan作用48 h后,AGS細胞的自噬情況見圖2。由圖2可見,對照組AGS細胞可見少量自噬泡;Tan組細胞器清晰,無自噬泡;激動劑組可見圓形、大小不一、包裹細胞器或細胞質的自噬泡。

圖2 透射電鏡觀察AGS細胞自噬 (×25 000)Fig.2 Observation of AGS cell autophagy under transmission electron microscope (×25 000)

3.4 MDC染色觀察細胞自噬

Tan作用48 h后的MDC 染色結果見圖3。由圖3可見,對照組有熒光,Tan組與對照組比較,熒光強度較弱;激動劑組與對照組比較,熒光強度較強。

圖3 熒光顯微鏡下MDC染色觀察自噬小體 (×200)Fig.3 MDC staining under fluorescent microscope to observe autophagosomes (×200)

3.5 細胞中AMPK、SIRT3 mRNA相對表達水平檢測

細胞中SIRT3 mRNA 的相對表達量組間比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。與對照組比較,Tan組SIRT3 mRNA 的相對表達量降低,激動劑組SIRT3 mRNA 的相對表達量增加,差異有統計學意義(P＜0.05);與Tan 組比較,激動劑組SIRT3 mRNA 的相對表達量增加,差異有統計學意義(P＜0.05)。各組細胞中AMPK mRNA 的相對表達量比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。結果見表3。

表3 各組細胞中AMPK 和SIRT3 mRNA 相對表達量比較(,n=5)Tab.3 Comparison of gene expression levels of AMPK and SIRT3 in each group (,n=5)

表3 各組細胞中AMPK 和SIRT3 mRNA 相對表達量比較(,n=5)Tab.3 Comparison of gene expression levels of AMPK and SIRT3 in each group (,n=5)

注:與對照組比較,aP＜0.05;與Tan組比較,bP＜0.05。

3.6 AMPK、p-AMPK、SIRT3、LC3II和p62 蛋白相對表達水平檢測

細胞中p-AMPK、SIRT3、LC3II、p62 蛋白的相對表達量組間比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。與對照組比較,Tan 組細胞中p-AMPK、SIRT3、LC3II蛋白的相對表達量降低,p62蛋白的相對表達量升高,激動劑組p-AMPK、SIRT3、LC3II蛋白的相對表達量升高,p62蛋白的相對表達量降低(P＜0.05);與Tan 組比較,激動劑組細胞中p-AMPK、SIRT3、LC3II蛋白的相對表達量升高,p62蛋白的相對表達量降低(P＜0.05)。各組細胞中AMPK蛋白的相對表達量比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。結果見表3、圖4。

圖4 Western blot檢測各組細胞中AMPK、p-AMPK、SIRT3、LC3II、p62蛋白的表達水平Fig.4 Western blot detection of AMPK,p-AMPK,SIRT3,LC3II,p62 protein expression levels in cells of each group

表4 各組細胞中AMPK、p-AMPK、SIRT3、LC3II、p62蛋白表達水平比較 (,n=5)Tab.4 Comparison of protein expression levels of AMPK,p-AMPK,SIRT3,LC3II and p62 in cells of each group (,n=5)

表4 各組細胞中AMPK、p-AMPK、SIRT3、LC3II、p62蛋白表達水平比較 (,n=5)Tab.4 Comparison of protein expression levels of AMPK,p-AMPK,SIRT3,LC3II and p62 in cells of each group (,n=5)

注:與對照組比較,aP＜0.05;與Tan組比較,bP＜0.05。

4 討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的一種惡性腫瘤,可損害胃腸道、肝、腎的功能,目前臨床主要通過化療、手術、輔助性中藥和心理調試等手段進行治療,但復發率高且預后極差,因此深入研究與胃癌發生和發展相關的分子機制,尋找安全、有效的抗癌藥物十分迫切[6-7]。自噬是細胞的一種自我防御途徑,在某些應激條件下,細胞的自噬相關基因(autophagy associated gene,Atg)會被激活,在這些基因的調控下利用溶酶體降解受損的大分子物質和細胞器,為細胞本身提供營養[8-9]。自噬與腫瘤的發生和發展關系密切,有研究表明,自噬參與胃癌細胞增殖、凋亡和轉移等生物學過程,在胃癌的發生和發展過程中發揮重要作用[10]。

Tan是一種天然多甲氧基黃酮類成分,主要存在于青皮、枳實、橘皮等中藥中,對于直腸癌、乳腺癌等腫瘤細胞的增殖均有抑制作用[11-12]。Tan可阻滯人卵巢癌細胞的增殖,誘導其凋亡,并通過線粒體途徑和內質網應激途徑誘導紅白血病細胞系凋亡[13-14]。研究表明,Tan可增強5-氟尿嘧啶抑制人AGS胃癌細胞增殖的作用,同時還可抑制細胞發生自噬,造成自噬體的堆積,促進細胞凋亡[15-16]。

本研究將不同濃度的Tan 作用于人胃癌AGS細胞后,隨著Tan濃度升高,細胞抑制率升高,同時細胞形態改變程度加劇,表明Tan可抑制AGS細胞增殖;透射電鏡觀察顯示,Tan組無自噬泡;MDC 染色結果顯示,Tan組熒光強度最弱,提示Tan具有抑制AGS細胞自噬的作用。

自噬包括自噬體的形成,自噬體成熟后與溶酶體融合,形成自噬溶酶體,同時降解其內容物,這是一個動態且連續的過程[17]。通過自噬流可以評價自噬活性,自噬體的形成和消除是自噬流的2個十分緊密的過程。LC3蛋白是一種自噬標志物,LC3的C 端能夠被Atg4分割成LC3I,存在于細胞質中,形成自噬體以后,LC3I能夠與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3II。p62是一種選擇性自噬的底物蛋白,在自噬溶酶體的降解中發揮重要作用,當缺少Atg基因或自噬體與溶酶體融合受阻時,p62蛋白會明顯堆積,故可通過檢測p62蛋白的表達水平來觀測自噬流。本研究的結果顯示,經Tan處理后LC3II和p62蛋白的表達水平降低,表明Tan具有抑制胃癌AGS細胞自噬的作用。AMPK/SIRT3信號通路正調控自噬相關途徑,某些分子通過刺激AMPK 的磷酸化提高SIRT3的表達水平而增強細胞自噬。研究表明,二甲雙胍可通過AMPK/SIRT3 信號通路促進細胞自噬[18]。Caffeine可通過調控SIRT3/AMPK 信號通路誘導細胞自噬從而緩解細胞衰老[19]。本研究使用AMPK 激動劑A-769662處理細胞,與對照組和Tan組比較,激動劑組p-AMPK、SIRT3的表達水平顯著升高,表明AMPK/SIRT3 信號通路參與調控AGS細胞的自噬過程,Tan可能通過抑制AMPK/SIRT3信號通路抑制胃癌細胞發生AGS自噬。

綜上所述,Tan具有抑制人胃癌AGS細胞發生自噬的作用,其可能是通過阻斷AMPK/SIRT3信號通路發揮抑制細胞自噬的作用,從而發揮抗腫瘤作用,為臨床治療胃癌提供依據。