基于鯰魚頭和魚排制備魚味美拉德反應物微膠囊熱穩定性的研究

于德陽，馬儷珍

（天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300392）

微膠囊技術具有使食品功能成分損失少、延長食品貨架期、遮蓋和減少異味等優點，微膠囊技術已經在食品的多個領域廣泛使用[1]。微膠囊技術主要是指利用天然或合成高分子材料對固體的、液體的或氣體的芯材進行包覆形成一種具有半透性或密封囊膜的微型膠囊的技術[2]，它具有保護物質免受環境條件影響，延長揮發性物質存儲時間，隔離不可混合的化合物等優點[3]。

目前，關于微膠囊技術的相關報道很多，包含油脂微膠囊化、酶和微生物的微膠囊化、防腐劑的微膠囊化、甜味劑的微膠囊化、酸味劑的微膠囊化、著色劑的微膠囊化、營養強化劑的微膠囊化、香精香料的微膠囊化等。如Wang 等[4]將魚油制成粉狀微膠囊，并測定其氧化穩定性，證明微膠囊化具有明顯的防止魚油氧化的作用。蘇陽等[5]研究得出利用β-環糊精為壁材，魚油為芯材制備魚油微膠囊的最佳工藝條件為：芯材壁材比為1:7、攪拌時間2 h、攪拌溫度45 ℃，包埋率為90.75%，電鏡觀察微膠囊具有典型的柱狀結構，制備微膠囊，具有吸濕性低的優點，因此可以長期保存。萬義玲等[6]采用復凝聚法制備魚油微膠囊，壁材選用殼聚糖、海藻酸鈉，結果表明：反應溫度60 ℃下具有最佳的效率及產率。劉偉[7]通過對河蚌進行酶解，再進行美拉德反應，最后對美拉德反應物進行微膠囊包埋，結果顯示：調味料芯材已被很好包埋，形成了基本呈球形的微膠囊。DSC 分析表明微膠囊調味料的玻璃態轉變溫度為58.71 ℃，高于常溫，因此微膠囊調味料在常溫下性質穩定。王正云等[8]通過復凝聚法對青魚內臟魚油進行微膠囊包埋，研究結果表明：結果表明制得的魚油微膠囊產品品質較好，貯藏期可較未包埋的魚油分別延長6 d 以上。李穎杰等[9]通過對魚糜酶解蛋白亞鐵螯合肽微膠囊工藝，結果表明：微膠囊能有效保護芯材不被氧化，并且由于微膠囊的緩釋作用，可以有效發揮其芯材的活性物質，并延長作用時間，為小肽金屬螯合物的有效利用提供了參考依據。Sarkar 等[10]以瓜爾膠和阿拉伯膠為復合壁材制得的薄荷油微膠囊在食品中的應用效果比單獨以阿拉伯膠為壁材得到的微膠囊效果好。從以上例子中可以看出，雖然對微膠囊的研究較多，但對于水產品，尤其是利用鯰魚頭和魚排制備魚味美拉德反應物再制備微膠囊，并對其熱穩定性進行研究的報道較少，而這又是實際應用中急需解決的一個問題。

因此本試驗以前期鯰魚頭和魚排為基料經過高壓浸提、酶解、發酵、美拉德反應得到MRPs 作為芯材，添加量為8%，再添加0.3%吐溫-80 作為乳化劑，以12%麥芽糊精和0.16%大豆分離蛋白作為復合壁材制備出乳化液，噴霧干燥得到微膠囊粉劑。再以MRPs 和微膠囊粉劑為研究對象，研究其經不同溫度加熱處理后風味物質的變化，探討微膠囊包埋技術對穩定MRPs 的應用效果，為其達到更好的實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

革胡子鯰魚（Clarias gariepinus），體重1000～1500 g，體長30～35 cm 天津市徳仁農業發展有限公司提供；復合蛋白酶（酶活40 萬 U/g） 南寧東恒華道生物科技有限公司；風味蛋白酶（3.6 萬 U/g）南寧東恒華道生物科技有限公司；SHI-59（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌） 意大利薩科公司；無水葡萄糖 秦皇島驪驊淀粉有限公司；D-木糖、VB1、牛磺酸、半胱氨酸、半胱氨酸鹽酸鹽 河北華恒化工有限公司；氫氧化鈉 天津鵬坤化工有限公司；蘋果酸 濰坊英軒實業有限公司；麥芽糊精 秦皇島驪驊淀粉有限公司；大豆分離蛋白 河南萬邦實業有限公司；吐溫-80 廣東潤滑化工有限公司（以上材料均為食品級）；2-甲基-3-庚酮 分析純，美國Sigma 公司。

Agilent7890A/5975C 氣相質譜儀 美國Agilent公司；HeraclesII 超快速氣相電子鼻 法國Alpha M.O.S 公司；DSC200F3 差示掃描量熱分析儀 德國NETZSCH 公司；YX-18LM 高壓滅菌鍋 上海三神醫療器械有限公司；WND-100 高速組織搗碎機浙江省蘭溪市偉能達電器有限公司；ATY124 精密分析天平 日本島津公司；THZ-98AB 恒溫振蕩器上海一恒科學儀器有限公司；ZWY-240 全溫型多振幅軌道搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；DW-50 調溫電熱器 南通利豪實驗儀器有限公司；SX-GO7102 節能箱式電爐 天津市中環實驗電爐有限公司；SDX-1 全自動風冷速凍箱 天津市特斯達食品機械科技有限公司；101-0A 型電熱鼓風干燥箱天津市華儀盛達實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解發酵液、美拉德反應產物、微膠囊乳化液和微膠囊粉劑的制備 根據前期試驗所得酶解發酵液、美拉德反應產物、微膠囊乳化液和微膠囊粉劑的制備方法制備樣品。

1.2.1.1 基于酶解液的發酵液（Fermentation broth based on enzymatic hydrolysis，FBEH）的制備 鯰魚頭/魚排用絞肉機絞碎得到魚骨肉泥，在魚骨肉泥中加入2 倍重的蒸餾水進行高壓蒸煮（120 ℃/2 h）得到高壓浸提液，冷卻至55 ℃，加入1200 U/g 的復合蛋白酶（以魚骨肉泥的比例計算），55 ℃酶解2 h 時再加入720 U/g 的風味蛋白酶，繼續酶解1 h，滅酶（煮沸保持10 min）后用雙層紗布過濾得到分步酶解液。在分步酶解液中接種SHI-59 發酵劑，接種量為0.024%，發酵溫度34 ℃，發酵時間53 h 得到FBEH。

1.2.1.2 美拉德反應產物（Maillard Reaction products，MRPs）的制備 在美拉德反應體系中依次加入40%FBEH、2.5%酵母提取物、0.3%甘氨酸、1%木糖、2%葡萄糖、0.5%半胱氨酸鹽酸鹽、0.25%半胱氨酸、0.2%丙氨酸、0.2%牛磺酸、0.3%VB1，首先用10%蘋果酸溶液調節反應體系的pH 為5.5，在溫度保持100 ℃條件下，進行美拉德反應時間為1 h，然后用2 mol/L NaOH 調節體系的pH 為7.0，再繼續反應1.5 h，得到MRPs。

1.2.1.3 微膠囊乳化液的制備 在1 L 的燒杯中依次加入蒸餾水、0.3%吐溫-80（乳化劑）、12%麥芽糊精（壁材）、0.16%大豆分離蛋白（壁材），用磁力攪拌器在60 ℃加熱攪拌使其完全溶解，然后加入8%MRPs（芯材），使總量為500 g，用高速剪切乳化機在8000 r/min 下剪切2 min，最后形成均勻的微膠囊乳化液。

1.2.1.4 微膠囊粉劑的制備 將得到的微膠囊乳化液進行噴霧干燥，得到微膠囊粉劑，噴霧干燥的工藝條件為：進風溫度180 ℃，出風溫度80 ℃，風機速度45.0 Hz，蠕動泵轉速300 mL/h，撞針時間3 s，撞針間隔8 s。

1.2.2 熱穩定性實驗 將1.2.1.2 中制備的MRPs 用蒸餾水稀釋成濃度為3%的稀釋液（A 樣品）；將1.2.1.4 中制備的微膠囊粉劑用蒸餾水稀釋成濃度為4.79%的稀釋液（B 樣品），根據微膠囊的包埋率（62.67%），使A 樣品和B 樣品兩者稀釋液中含有的MRPs 量相等。

將A 樣品和B 樣品分裝入試管中（每一種稀釋液12 管），分別在常溫常壓、90 ℃常壓、121 ℃，0.12 MPa、160 ℃，常壓下加熱20 min，具體試驗設計方案和字母表示方法見表1所示。為了比較分析樣品經不同溫度加熱處理后，其對熱的穩定性，分別對樣品進行電子鼻、GC-MS 分析，并對MRPs 和微膠囊粉劑進行DSC 分析。

表1 試驗設計方案Table 1 Experimental design scheme

1.2.3 指標測定

1.2.3.1 包埋率的測定 褐色的類黑精是美拉德反應的重要產物，褐變程度提供了一個可視化的測量手段。褐變程度（A420）測定根據文獻[11]的方法加以修改測定吸光值。本試驗的芯材是MRPs，因此選用420 nm 處吸光度值表示芯材含量，最終結果越大，則表明褐色產物的生成量越多[12]。將微膠囊乳液在12000 r/min 下離心15 min，取上清液（未包埋的芯材）和微膠囊乳液分別稀釋10 倍，在420 nm 波長處測吸光值。

1.2.3.2 HeraclesII 超快速電子鼻分析 本試驗參照陳援援等[13]的方法并稍作修改，將處理后的4 組稀釋液，稱取7 g 樣品于20 mL 頂空樣品瓶中，將樣品在55 ℃水浴鍋中水浴20 min，用 10 mL 進樣針吸取頂空瓶中5 mL 氣體，手動進樣注射入電子鼻進樣口中。試驗條件：進樣口溫度200 ℃，持續進樣時間40 s，捕集井分流速率10 mL/ min，柱溫的程序升溫方式0.5 ℃/min 升到100 ℃，1 ℃ /min，100～200 ℃，采集時間為140 s。

1.2.3.3 揮發性成分的GC-MS 分析 參照雷虹[14]的方法并做修改將8 g 樣品稀釋液加入20 mL 頂空樣品瓶中，加5 mL 的飽和NaCl 溶液和2 μL 的2-甲基-3-庚酮溶液（1 μg/mL），放入轉子后置于磁力攪拌器上，將老化的萃取頭插入樣品瓶使石英纖維頭暴露于樣品上部空間，在60 ℃下吸附45 min 后拔出，萃取頭在GC 進樣口（250 ℃）下解吸附4 min。

GC 條件：TR-5 毛細色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為He，載氣流速為1.0 mL/min，傳輸線溫度250 ℃，不分流進樣，手動進樣；升溫程序：45 ℃保持2 min，以6 ℃/min 升溫到230 ℃，保持5 min。

MS 條件：離子源溫度250 ℃，進樣口溫度250 ℃，質量掃描范圍30～400 m/z；溶劑延遲時間為1 min。風味化合物相對于2-甲基-3 庚酮的含量，計算公式如下：

式中：C 為所測定的揮發性化合物濃度（μg/kg）；AX為測定揮發性化合物的峰面積（AU. min）；C0為內標物的濃度（1 μg/mL）；A0為內標物的峰面積（AU. min）；V 為內標物的進樣量（μL）；m 為所測定樣品的質量（g）。

1.2.3.4 DSC 分析 用十萬分之一的天平稱分別稱取10 mg 左右的樣品（樣品A 為MRPs 液，樣品B為微膠囊干粉）于DSC 特制的鋁盒中，封口后放入儀器中進行掃描。掃描條件以空鋁盒為參比，氮氣流量為60 mL/min，空氣流量為20 mL/min，以10 ℃/min的掃描速率從25 ℃升至300 ℃結束，繪制DSC 曲線并進行分析。

1.3 數據處理

采用Excel 2016 軟件、Origin10.0 軟件進行圖表制作，采用IBM SPSS Statistics 19 軟件進行顯著性分析，PCA 分析，差異顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 熱處理后MRPs 和微膠囊粉劑稀釋液的電子鼻分析

電子鼻是氣味特征分析中常用的儀器，不同傳感器對不同氣味物質的靈敏性不同。電子鼻傳感器中不同金屬氧化物半導體型化學傳感元件所對應的敏感物質類型不同[15]，經過不同的溫度處理后的稀釋液主成分風味物質的種類和相對含量不同，因此在傳感器上呈現不同的氣味感應信號[16]。因此可以通過傳感器比較不同氣味的差異。

由圖1（a）可知，PC1、PC2 的方差貢獻率分別為75.62%和18.52%，總貢獻率為94.14%，說明在整體香氣成分水平上各組樣品中主成分可以很好地反映多指標信息[17-18]。在主成分1 上，從距離上來看，MRPs 的A 樣品（未經熱處理），與其經過高溫處理后的樣品A1、A2、A3 之間的距離很大，說明MRPs 經過熱處理后的香氣損失比例較大，但A1、A2、A3 之間的距離很近，這一現象表明，MRPs 的熱穩定性較差，受熱處理會顯著影響它的香味成分，也就是說，如果將MRPs 直接添加到某一肉制品或魚糜制品中，隨著進一步的加熱工序將會影響到MRPs 作用的發揮。而經過微膠囊包埋后的稀釋液B，與經過高溫處理后的稀釋液B1、B2、B3 之間的距離相對較小，說明經過高溫處理后的香氣損失比例較小，微膠囊包埋可提高MRPs 的熱穩定性。在主成分2 上，A、A1、A2、A3 都位于負向端，而B、B1、B2、B3 大部分都位于正向端[19]。

判別因子分析（DFA）是在PCA 的基礎上，對不同氣味的信號數據進一步優化，將氣味數據的差異性擴大，用少數的幾個因子來描述多因素間的聯系，以達到用較少的因子去反映原數據大部分信息[20]。由圖1（b）可知第1 和第2 主成分貢獻率分別為67.1%和25.5%，總貢獻率為92.6%，說明DFA 表示樣本的整體信息是可信的，圖中A2、A3 距離較近較難區分,結合PCA 的分析可知，可能是由于其耐熱性差,高溫處理導致揮發性香氣成分揮發嚴重，而B1、B2、B3 距離較遠，可以完全分開，說明在加熱過程中揮發性物質的峰度是逐漸減小的。

圖1 熱處理對MRPs 和微膠囊粉劑稀釋液的PCA 及判別因子（DFA）分析圖Fig.1 PCA and discriminant factor （DFA） analysis diagram of heat treatment on MRPs and microcapsule powder diluent

2.2 熱處理對MRPs 和微膠囊粉劑稀釋液揮發性風味物質的影響

熱處理對MRPs 和微膠囊粉劑稀釋液揮發性風味物質的影響結果見表2所示。從表2 中可以看出，從8 組樣品中共檢出揮發性風味化合物有7 大類96 種，其中酸類18 種、胺類13 種、吡嗪類7 種、醇類14 種、醛類11 種、酮類13 種、酯類10 種。

表2 熱處理對MRPs 和微膠囊粉劑稀釋液的GC-MS 分析結果Table 2 GC-MS analysis results of heat treatment on MRPs and microcapsule powder diluent

分析發現，A 樣品和B 樣品經不同熱處理會顯著降低MRPs 中的揮發性風味物質種類，且受熱溫度越高，這種降低的趨勢越明顯，如A、A1、A2、A3 的揮發性風味物質依次降低為41、30、25、16種；B、B1、B2、B3 的揮發性風味物質種類依次降低為44、42、34、27，其中A1、A2、A3 中的胺類分別為15.60、1.23、0.59 μg/kg，而B1、B2、B3 胺類分別為48.45、19.29、3.42 μg/kg，可以明顯看出B3 樣品的酸類、胺類等物質有明顯降低現象[21]，因為酸類和胺類揮發性比較強。同樣熱處理溫度下，B 樣品的揮發性物質種類及胺類均顯著高于A 樣品。這是因為經微膠囊包埋后隨著溫度升高，經熱處理后油-水界面的蛋白質分子結構展開，分子內部帶電基團和氨基酸殘基暴露，界面蛋白緊密結合，在油滴表面形成蛋白膜，使得蛋白質分子結構伸展、松散，分子柔性增強對芯材起到保護作用[22-23]。

分析發現，A1、A2、A3 中的吡嗪類物質分別為7.18、3.83、2.61 μg/kg 而B1、B2、B3 中吡嗪類物質分別為9.86、11.32、10.26 μg/kg。A1、A2、A3 中的醇類物質分別為6.89、4.68、1.70 μg/kg 而B1、B2、B3 中醇類物質分別為9.35、5.98、3.59 μg/kg。

醛類物質氣味閾值較低，具有脂香氣味，是肉類香氣的重要指標[24]，A1、A2、A3 中的醛類物質分別為3.15、2.47、1.05 μg/kg 而B1、B2、B3 中醛類物質分別為7.17、3.79、1.91 μg/kg。新生成的2,4-壬二烯醛，具有明顯的脂肪香氣，這可能是因為MRPs中含有的脂肪，隨著溫度的升高加速了油脂的氧化降解，形成了新的風味物質[25-26]。

續表 2

酮類物質由脂肪氧化和美拉德反應產生，具有清香、奶油香及果香等令人愉快的香氣[27]，如新生成的2-庚酮等。A1、A2、A3 中的酮類物質分別為8.08、5.23、0.66 μg/kg 而B1、B2、B3 中酮類物質分別為9.18、6.52、3.72 μg/kg。醛類、酮類和醇類均比A3有明顯增加趨勢，并有新的風味物質生成，尤其是醇類和醛類。醇類化合物主要由脂質氧化降解產生，大多數醇類化合物是由脂質氧化和蛋白質水解產生的。如1-辛烯-3-醇為直鏈醇，由脂質氧化降解產生，有蘑菇香氣；芳樟醇有清香香氣，對美拉德反應物的整體香氣有明顯的修飾作用[28]。

A1、A2、A3 中的酯類物質分別為0.63、0.52、0 μg/kg 而B1、B2、B3 中酯類物質分別為6.54、4.77、2.66 μg/kg。進一步分析發現B、B1、B2、B3 樣品中揮發性風味物質的相對質量總濃度分別為94.91、114.78、52.74、26.20 μg/kg，而A、A1、A2、A3 樣品中揮發性風味物質的相對質量總濃度分別為79.50、48.24、27.75、8.92 μg/kg，B1、B2、B3 樣品中揮發性風味物質的相對質量總濃度分別是相對應的A1、A2、A3 的2.38、1.90、2.94 倍。綜上所述，MRPs 經微膠囊包埋后的樣品B 耐熱性優于未經包埋的MRPs（樣品A）。

2.3 對MRPs 和微膠囊粉劑的差式量熱掃描（DSC）分析

差示掃描量熱儀（DSC）反映的是與熱效應相關的物理或化學變化。在程序升溫條件下，利用儀器中的熱流傳感器測量待測樣品和參照物之間的熱流差值來反映出相關的熱效應。DSC 能分析微膠囊顆粒發生相變時的起始溫度，并了解微膠囊產品的耐熱情況[29-30]。

MRPs（A 樣品）的DSC 曲線見圖2所示。從圖2中可以看出，其裂解溫度范圍為110～150 ℃，明顯的吸熱峰出現時的溫度是115 ℃。當溫度達到120 ℃時，吸熱完成。圖3所示為以MRPs 為芯材的微膠囊粉劑（B 樣品）DSC 曲線，從圖3 中可以看出，其裂解溫度范圍為120～300 ℃，明顯的吸熱峰出現時的溫度是155 ℃，在180 和250 ℃又分別出現兩個拐點，出現明顯吸熱峰時的溫度比A 樣品的溫度提高了40 ℃，這說明MRPs 芯材經壁材包埋后可以保護揮發性物質，使其在加熱過程中揮發速度減慢[31]。一般來說，微膠囊內無定形物質因受熱會發生玻璃化轉變，熱特性和力學特性、介電特性等會發生明顯變化，只有當包埋基質處于玻璃態的內層受到足夠的拉力，產生裂痕時才會導致風味包埋物的釋放[32]，本試驗的微膠囊壁材是麥芽糊精和大豆分離蛋白，這說明本試驗所用的壁材種類和比例恰當，起到很好的包埋作用。從圖3 的對比熱降解曲線可以看出，MRPs 的熱降解曲線變化程度明顯高于微膠囊變化曲線。綜上所述，通過微膠囊包埋MRPs 后，可有效地擴寬MRPs 的釋放溫度，增加其在熱釋放領域的應用范圍，因此熱穩定性更好。

圖2 MRPs（樣品A）的DSC 曲線圖Fig.2 Thermal degradation (DSC) curve of MRPs (sample A)

圖3 以MRPs 為芯材的微膠囊（樣品B）DSC 曲線圖Fig.3 Thermal degradation （DSC） curve of microcapsules with MRPs (sample B) as core material

3 結 論

通過電子鼻的PCA、DFA 分析可知，經微膠囊包埋后的稀釋液B2、B3 熱穩定性優于其他稀釋液，通過GC-MS 測定不同稀釋液的揮發性風味物質可知，在同樣溫度處理后，B1、B2、B3 樣品的揮發性風味物質種類分別是A1、A2、A3 樣品的1.4、1.36、1.69 倍；B1、B2、B3 樣品的揮發性物質的質量濃度分別是A1、A2、A3 的2.38、1.9、2.94 倍。通過DSC 的曲線圖也可以看出，MRPs 的裂解溫度范圍為110～150 ℃，以MRPs 為芯材的微膠囊曲線圖,其裂解溫度范圍為120～300 ℃，出現明顯吸熱峰時的溫度比MRPs 時的溫度提高了40 ℃，因此，本試驗以MRPs 為芯材的微膠囊熱穩定性優于未經包埋的MRPs，使通過微膠囊包埋制備美拉德反應調味料得到更廣泛的應用。本實驗也有不足之處，由于選擇的壁材種類有限，包埋率并不是太高，因此后續研究還應進一步探究，提高包埋率。