菱角殼黃酮提取工藝優化及抑腫瘤細胞增殖活性作用

雷秋琪，葉詩潔，黃永康，楊 過，周 敏,3，王宏勛,3，王麗梅,3,

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學生命科學與技術學院，湖北武漢 430023；3.湖北省生鮮食品工程技術研究中心，湖北武漢 430023）

菱角作為我國民間一種藥用佳果已有幾千年的歷史[1]。根據《中華藥海》所記載：“菱殼性味微苦、澀，性涼，入肺、脾、腸三經，具有解毒療瘡、澀腸止瀉、清華濕熱的功效”。《中藥大辭典》記載：“菱殼可治腹瀉、脫肛、痔瘡、黃水瘡、天泡瘡”。研究表明，菱角殼具有抗腫瘤細胞增殖、抗氧化、抗菌、降糖和抗炎等作用[2-5]。在中國的民間用藥中，菱角殼被用于輔助治療癌癥[6-10]。牛鳳蘭等[11]用富含三羥基苯甲酸二聚體粗菱殼水提物對MFC 荷瘤小鼠進行體內實驗，發現菱角殼水提物具有抑瘤效果而且存在量效關系。文獻報道菱角殼中含有生物堿、酚酸類、萜類、黃酮類及多糖等功能成分[12-14]。李麗等[15]對東北菱黃酮類化合物的成分進行定性定量分析，發現其中可能含有黃酮苷或苷元、山奈酚、高良姜素的2 個對映異構體以及多種其他成分。黃酮[16-17]具有抗氧化性[18-19]，可作為天然抗氧化劑用于食品行業。另外，黃酮還具有抗腫瘤、抗炎鎮痛、保護肝臟等功效[20-25]，可用于相關疾病的藥物開發。常見的黃酮提取方式有熱水浸提法[26]、有機溶劑提取法[27]、超聲波提取法[28-29]、酶解法[30]、膜分離提取法[31]、超臨界流體萃取[32]。其中，熱水浸提、有機溶劑提取法等是實驗室常見提取工藝。主要依據相似相溶的原理[27]，一般具有操作簡單、實驗器材要求低、節約成本等諸多優點。另外， 酶解法具有高度專一的特性，能夠避免使用有機試劑且具有較高的提取率，但作用條件不便于調控。膜分離濃縮可以減少干燥時間，提高干燥效率。超臨界CO2萃取是目前國際上公認的先進物理萃取技術，主要是運用其溶劑力將超臨界流體與萃取物接觸，選擇性分離提純。但這三種提取方式均成本較高，不適于大規模生產。

根據目前的研究現狀，黃酮已經廣泛用于植物抗腫瘤活性的研究中[33]，但將菱角殼黃酮用于抗腫瘤活性的文獻并不多見。其中Hela 作為常見的人源腫瘤細胞[34-35]，也沒有相關報道將其用于驗證菱角殼黃酮的抗腫瘤活性。常見的用來檢測腫瘤細胞增殖活性的方法有很多[36-37]，如：臺盼藍染色法、3H 放射性同位素摻入法、MTT 法、細胞儀法等。MTT 法形成的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）物質不溶于水[28]，添加有機溶劑溶解后，因為棄去上清液的同時可能會丟失少部分的Formazan，因此可能會產生誤差。為了減少實驗誤差，目前更常用CCK-8 法檢測細胞增殖活性。CCK-8 法比MTT 法對細胞濃度變化更敏感，測得的結果則更為準確。

因此，本研究以湖北洪湖菱角種植區所產的菱角取殼做為原料，采用單因素實驗結合響應面分析法優化菱角殼黃酮提取工藝，運用CCK-8 法檢測菱角殼黃酮對人宮頸癌Hela 細胞增殖的影響。拓展黃酮類物質的提取來源，為菱角殼黃酮的體外的抗腫瘤活性研究及菱角殼的開發利用理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菱角殼（兩角菱，Water chestnut shell） 湖北洪湖菱角種植地；人宮頸癌Hela 細胞株 武漢百邁生物科技有限公司；無水乙醇（分析純）、蘆丁標品、亞硝酸鈉（NaNO2，分析純）、硝酸鋁（Al（NO3）3，分析純）、氫氧化鈉（NaOH，分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、DMEM（Dulbecco’s modified Eagle's medium）高糖培養基 塞默爾飛世爾生物化學制品有限公司；5-氟尿嘧啶（5-Fu）sigma 公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum） 浙江天杭生物科技有限公司；青霉素鏈霉素溶液-雙抗（后文均簡稱雙抗） 上海斯信生物科技有限公司；胰蛋白酶（Trypsin）、乙二胺四乙酸（EDTA） 吉諾生物醫藥技術有限公司；二甲基亞砜（DMSO） 湖北百奧斯生物科技有限公司；細胞活力檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8） 日本同仁試劑公司。

BL 2000F 型電子天平 上海升隆電子科技有限公司；PL402-L 型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-S114 型電熱恒溫水浴鍋 上海太倉精宏儀器設備有限公司；721-100 型紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；T25 細胞培養瓶、凍存管 北京中創先鋒科技有限責任公司；96 孔培養板 上海化科實驗器材有限公司；CW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備公司；SCHP-80 型CO2培養箱 深圳市奧德瑪電子科技有限公司；BX19-HK830 型倒置顯微鏡 奧林巴斯有限公司；SUNRISE 型酶標儀 奧地利Tecan 公司；普通冰箱、-80 ℃低溫冰箱 海爾集團；DHG-9145A 型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海恒科學儀器有限公司；TGL-16GB 型離心機 北京醫用離心機廠制造；GR60DA 型立式自動壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SCIENTZ-12N 型真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 選用新鮮的菱角，摘去果肉，將菱角殼洗干凈之后放在40 ℃烘箱中烘干，用藥物粉碎機粉碎，過80 目篩得菱角殼粉，4 ℃下避光保存備用。

1.2.2 單因素實驗 通過實驗室原有實驗基礎以及相關文獻資料，確定了對菱角殼總黃酮含量有明顯影響的四個因素：提取時間、料液比、乙醇濃度、提取時間。

a：提取時間對菱角殼黃酮提取得率的影響：準確稱取15 份菱角殼粉，每份1.0 g，置于500 mL 三角瓶中，分為五個實驗組，每組三個平行。選取濃度為70%的乙醇水溶液作為其提取溶劑，選取1:30 的料液比，將三角瓶分別放置在50 ℃恒溫水浴鍋中提取，并分別提取10、30、50、70、90 min，提取結束后用紗布進行過濾，得到樣品液，冷卻待測。

b：料液比對菱角殼黃酮提取得率的影響：選取濃度為70%的乙醇水溶液作為其提取溶劑，料液比分別為1:20、1:30、1:40、l:50、1:60，將三角瓶分別放置在50 ℃恒溫水浴鍋中提取50 min，其余實驗操作與提取時間實驗組相同。

c：乙醇濃度對菱角殼黃酮提取得率的影響：分別選取濃度為30%、40%、50%、60%、70%的乙醇水溶液作為其提取溶劑，料液比為1:30，將三角瓶分別放置在50 ℃恒溫水浴鍋中提取50 min，其余實驗操作與提取時間實驗組相同。

d：提取溫度對菱角殼黃酮提取得率的影響：選取濃度為70%的乙醇水溶液作為其提取溶劑，料液比為1:30，將三角瓶分別放置在40、50、60、70、80 ℃恒溫水浴鍋中提取50 min，其余實驗操作與提取時間實驗組相同。

1.2.3 Box-Behnken 試驗設計 如表1所示，根據單因素實驗的結果，結合Box-Behnken 中心組合的試驗來設計優化試驗，分析影響菱角殼黃酮提取得率主要因素，得出最佳提取工藝。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Response surface experimental factor level

1.2.4 總黃酮含量的測定方法：

1.2.4.1 制作標準曲線 分別準確量取0.3 mg/mL蘆丁標準品溶液（無水乙醇溶解）1、2、3、4、5、6、7、8 mL 置于25 mL 容量瓶中，取無水乙醇分別補充至1 mL，加超純水至12.5 mL，再加入5% NaNO2溶液0.7 mL，充分混合均勻，靜置5 min。再加入10%Al（NO3）3溶液0.7 mL，混合均勻，靜置6 min 后，加入1 mol/L NaOH 溶液5 mL。最后加入無水乙醇補充樣液的總體積至25 mL，混合均勻，靜置10 min。另取1 mL 無水乙醇，按照相同步驟進行處理后作為空白對照，在最大吸收波長510 nm 處，使用紫外可見分光光度計測定吸光度，以吸光度Y 值為縱坐標（Y），以相應試管中濃度X（mg/mL）為橫坐標（X），繪制標準曲線，得出回歸方程。

1.2.4.2 測定樣品中總黃酮含量 取1 mL 樣品液（無水乙醇溶解），置于25 mL 容量瓶中，加超純水至12.5 mL，再加入5% NaNO2溶液0.7 mL，混合均勻，靜置5 min。再加入10% Al（NO3）3溶液0.7 mL，混合均勻，靜置6 min，加入1 mol/L NaOH 溶液5 mL，最后加入無水乙醇水補液至25 mL，搖勻之后再靜置10 min。直接取1 mL 超純水按照相同步驟進行處理后作為空白對照，在最大吸收波長510 nm 處，使用紫外可見分光光度計測定吸光度，最后結合標準曲線計算測定樣品中總黃酮濃度計算總黃酮提取得率。樣品中總黃酮得率式中，C 為由標曲得出的總黃酮濃度，mg/mL；V 為樣液總體積，mL；m 為菱角殼粉的質量，g。

1.2.5 菱角殼黃酮對Hela 細胞增殖活性的影響

1.2.5.1 藥品配制方法 a：培養基：以DMEM 高糖培養基:胎牛血清:雙抗=90:10:1 的比例，取45 mL的DMEM 高糖培養基5 mL 胎牛血清、0.5 mL 雙抗配制成50 mL 培養基。

b：凍存液：將DMEM 高糖培養基、胎牛血清、DMSO 按照7:3:1 比例混合配制成凍存液，密封保存于4 ℃冰箱。

1.2.5.2 菱角殼黃酮純化及樣品配制 根據實驗室研究基礎以及現有研究成果[38-39]，采用AB-8 大孔樹脂對菱角殼黃酮粗體物進行純化，以進行后續實驗。預處理：將AB-8 大孔吸附樹脂用無水乙醇浸泡24 h 以充分溶脹后，95%乙醇沖洗至洗出液加5 倍量超純水時無白色渾濁，超純水洗三次，密封保存，備用。再生：將使用過樹脂用無水乙醇洗脫至無色后，0.5 mol/L 鹽酸浸泡2 h，水洗至中性，0.5 mol/L NaOH 浸泡2 h，水洗至中性。純化工藝為：將處理過的AB-8 大孔吸附樹脂加入26×50 mm 層析柱中，吸附流速0.8 mL/min，一次洗脫上樣體積為20 mL，樣品濃度10 mg/mL，用70%乙醇溶液洗脫，洗脫樣品的流速為0.8 mL/min，經純化濃縮凍干后得到菱角殼黃酮純化物。

菱角殼黃酮溶液的配制：按照1.2.1 中得出的提取工藝進行菱角殼黃酮粗提取物的提取，并取一定量菱角殼黃酮粗提物按照上述方法進行純化。分別稱量80 mg 菱角殼黃酮粗提物、菱角殼黃酮純化物、5-Fu 溶解于1 mL DMSO 溶液中，用DMEM 培養基分別稀釋到50、100、200、400、500、600、700、800 μg/mL。黃酮不溶于水，可溶于DMSO，而DMSO溶液本身對細胞具有毒害作用，以DMSO 作為溶劑配置相應濃度的藥品時，其濃度不可高于0.5%。

1.2.5.3 Hela 細胞復蘇 將凍存于-80 ℃冰箱裝有Hela 細胞的凍存管取出后迅速放入37 ℃水浴鍋中快速解凍，解凍后立即停止水浴，將凍存管移入超凈工作臺，用移液槍輕輕吹打細胞使之懸浮混勻，將凍存管所有細胞轉移到離心管中離心（1000 r/min，5 min），離心結束后棄去離心管中的上清液。在離心管中加入1 mL DMEM 高糖培養基，用移液槍輕輕吹打離心管底部，使底部細胞懸浮并與DMEM 高糖培養基充分混勻。將細胞轉移到T25 細胞培養瓶中，加入4 mL DMEM 高糖培養基，將瓶蓋擰緊，水平劃十字搖勻后將培養瓶放入37 ℃、5% CO2培養箱中培養。放入培養箱之前注意用75%酒精噴灑培養瓶，以達到滅菌目的。放入培養箱之后適度將瓶蓋擰緊后再回轉半圈，以達到與培養箱通氣目的。每24 h 換液一次：把培養基吸出，加1 mL PBS，蓋上瓶蓋輕輕搖動后棄去PBS，反復清洗三次，在培養瓶中加入5 mL DMEM 高糖培養基，最后放入37 ℃、5%CO2培養箱培養。

1.2.5.4 細胞傳代 首先在倒置顯微鏡下觀察，將融合度大于90%的培養瓶挑出，棄去培養基，向培養瓶中加入1 mL PBS 清洗細胞，隨后棄去PBS，反復三次，在培養瓶中加入1 mL 胰蛋白酶消化1 min，立即棄去胰蛋白酶。在培養瓶中加入1 mL DMEM 高糖培養基，終止消化，用移液槍將瓶壁上剩余的細胞輕輕吹打使之脫落。將培養瓶中的細胞轉移到15 mL離心管內，1000 r/min 離心5 min，棄去上清液。按照適當密度在離心管中加入2～3 mL 培養基，用移液槍輕輕吹打使離心管底部細胞浮起，再將離心管中細胞轉移1 mL 至裝有4 mL 培養基的T25 瓶內，輕輕搖勻，定期觀看細胞生長狀態。Hela 細胞傳代培養若干代后，待Hela 細胞處于對數生長期時，細胞活力增強，細胞密度明顯增大，此時的細胞就可以用于CCK-8 法測定藥物對腫瘤細胞的增殖抑制作用。

1.2.5.5 細胞凍存 取對數生長期細胞，凍存前2 h換液一次，用胰蛋白酶消化制成細胞懸浮液，轉移到離心管中離心（1000 r/min、5 min）后棄去上清液。在離心管中添加1.5 mL 凍存液，用移液槍輕輕吹打細胞，使之懸浮并與凍存液混勻后，將細胞轉移至凍存管中。用封口膜密封，貼上標簽，標記名稱、時間。實行分階段降溫：4 ℃保存2 h，隨后-20 ℃保存2 h，最后將細胞轉移至-80 ℃下凍存。

1.2.5.6 CCK-8 法測定菱角殼黃酮對Hela 細胞增殖抑制作用 實驗開始前首先用胰蛋白酶消化細胞，將細胞制成懸浮液，置于15 mL 離心管中離心（1000 r/min，5 min），最后在離心管中加入8 mL 培養基。將濃度為1×105cells/mL 的Hela 細胞懸浮液接種96 孔培養板，取三瓶細胞分別接種于三個96 孔培養板，每個孔加入100 μL 細胞液。一個培養板用3 種藥品，每種藥品有5 個濃度，每一個濃度5 個復孔，同時設置5 個空白對照孔。三個培養板置于37 ℃、5%CO2培養箱中48 h，使孔板中細胞生長狀態同步，培養期間有換液步驟。48 h 后，向培養板中分別加入200 μL 濃度分別為50、100、200、400、800 μg/mL的菱角殼黃酮粗提物、菱角殼黃酮純化物、5-Fu。其中5-Fu 作為陽性對照，另外加入200 μL 培養基作為空白對照，分別培養12、24、48 h。達到適當時間后移除孔板中的培養基，加入100 μL 新鮮培養基，避光加入10 μL CCK-8 試劑，置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育3 h，用酶標儀于450 nm 條件下讀數，測出OD 值。按照以下計算公式計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率其中，OD實驗組值：菱角殼黃酮提取物或5-Fu 處理孔的OD 值；OD對照組值：無藥物處理孔的OD 值。

根據不同樣品不同濃度對Hela 細胞的增殖抑制率，選擇抑制率在50%左右的濃度范圍，進一步試驗得出半抑制質量濃度，即IC50值。以樣品濃度作為橫坐標，抑制率IC%為縱坐標，作線性回歸方程，分別計算菱角殼黃酮粗提物、純化物，以及5-Fu 作用12、24、48 h 的IC50值。

1.3 數據處理

本文中，單因素實驗與響應面試驗的實驗組樣品平行次數與測試平行次數均為3次，而CCK-8 法測定菱角殼黃酮對Hela 細胞增殖抑制作用的實驗中，均復孔5次，以均值表示最終結果。利用Excel 2020、SPSS16.0、Design ExpertV8.0.6.1 軟件進行數據分析以及繪圖處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 提取時間對菱角殼黃酮得率的影響 如圖1所示，在實驗組中，提取時間為30 min 時菱角殼黃酮得率最高為3.04%。當提取時間小于30 min 時，菱角殼黃酮提取得率隨著提取時間的增加而上升成，而后，隨著提取時間增加，菱角殼黃酮得率會隨之下降。原因可能是提取時間過長，使得原料中的其他醇溶性物質被溶解，進而導致雜質增加，使得黃酮提取率下降。因此，選擇提取時間10、30、50 min 作為響應面試驗的因素水平。提取時間的變化對菱角殼黃酮提取得率的影響極顯著（P＜0.01），以上結果表明提取時間對菱角殼黃酮得率有影響。

圖1 提取時間對菱角殼黃酮提取得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the extraction yield of water chestnut flavonoids

2.1.2 料液比對菱角殼黃酮得率的影響結果分析如圖2所示，在實驗組中，料液比為1:30 g/mL 時菱角殼黃酮提取效果最佳，此時的菱角殼黃酮得率為3.13%。料液比超過1:30 g/mL 之后，菱角殼黃酮得率呈下降趨勢。產生這種現象的原因可能是溶劑用量少時，提取不夠充分，但隨著溶劑增多，其它雜質的溶出率也會增大。因此，選擇料液比1:20、1:30、1:40 g/mL 作為響應面試驗的因素水平。料液比的變化對菱角殼黃酮得率的影響極顯著（P＜0.01），以上結果表明料液比對菱角殼黃酮得率有影響。

圖2 料液比對菱角殼黃酮提取得率的影響Fig.2 Effect of the ratio of material to liquid on the extraction yield of water chestnut flavonoids

2.1.3 乙醇濃度對菱角殼黃酮得率的影響結果分析由圖3所示，在實驗組中，乙醇濃度為50%時菱角殼黃酮提取得率最高為3.20%。當乙醇的濃度超出50%時，菱角殼中總黃酮得率與乙醇濃度成反比。原因可能是乙醇濃度過高，某些醇溶性雜質和脂溶性物質的溶出率會增大，使黃酮類物質的溶出受到影響，從而造成菱角殼黃酮的提取率下降。因此，選擇乙醇濃度40%、50%、60%作為響應面實驗的因素水平。乙醇濃度的變化對菱角殼黃酮得率的影響極顯著（P＜0.01），以上結果表明乙醇濃度對菱角殼黃酮得率有影響。

圖3 乙醇濃度對菱角殼黃酮提取得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of water chestnut flavonoids

2.1.4 提取溫度對菱角殼黃酮得率的影響結果分析如圖4所示，在實驗組中，提取溫度為60 ℃時，菱角殼黃酮提取效果最佳，對應總黃酮提取率為3.11%。當提取溫度變化時，40、50、70 ℃處理，以及60、70 ℃處理之間對于菱角殼黃酮提取得率的影響差異并不顯著（P＞0.05）。以上結果表明提取溫度對菱角殼黃酮提取得率沒有影響，因此在進行響應面試驗設計時可以舍去對該因素的討論，固定提取溫度為60 ℃。

圖4 提取溫度對菱角殼總黃酮提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of total flavonoids from water chestnut shell

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面試驗結果 根據Design Expert 軟件提供的模型，選取提取時間（X1，min）、料液比（X2，g/mL）、乙醇的濃度（X3，%）為變量因素，設定響應值為菱角殼總黃酮得率（Y，%），響應面試驗結果如表2：

表2 響應面試驗結果Table 2 Response surface experimental design and results

2.2.2 回歸模型建立及方差分析 通過Design-Expert軟件進行回歸分析得到回歸方程：Y=-9.77070+0.11095X1+161.07200X2+0.34237X3-0.10900X1X2+1.36250E-004X1X3-0.80800X2X3-2.07225E-表3所示，模型P＜0.0001，達到極顯著水平；失擬項P＞0.05，表示方程擬合度良好。方差分析的結果表明提取時間、料液比和乙醇濃度對菱角殼黃酮得率的影響均極顯著（P＜0.01）。P（X1X2）＞0.05、P（X1X3）＞0.05、P（X2X3）＜0.01，由此證明，料液比（X2）和乙醇濃度（X3）的交互作用對菱角殼黃酮得率的影響顯著，其余交互作用的影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.3 兩兩因素交互作用分析 為了使結果更直觀，做出三維空間圖進行進一步的分析：響應面坡度越陡峭，表明響應值對于條件的改變越敏感，該因素對菱角殼黃酮得率的影響越大；反之則表明該因素對菱角殼黃酮得率的影響越小。如圖5所示，在各因素兩兩交互作用對總黃酮得率的影響中，提取時間與料液比的交互作用顯著，提取時間與乙醇濃度、料液比與乙醇濃度的交互作用對菱角殼黃酮得率的影響不顯著，這與方差分析的結果一致。

圖5 各因素兩兩交互作用對總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of the interaction of various factors on the yield of total flavonoids

2.2.4 優化工藝的驗證實驗 通過 Design-Expert 軟件設計響應面試驗優化菱角殼黃酮提取工藝的條件，結果顯示最佳提取工藝：提取時間27.65 min、料液比1:33.33 g/mL、乙醇濃度53.13%，對應的總黃酮得率為3.512%。為了實際操作可行，將最佳工藝條件修正為：提取時間28 min、料液比1:33 g/mL、乙醇濃度53%，對應的總黃酮得率為3.512%，對該工藝條件下進行驗證，重復實驗三次，得到菱角殼總黃酮得率為3.455%±0.16%。實際值與模型預測值相近，表明該模型具有一定的可行性。

2.3 菱角殼黃酮對Hela 細胞增殖的影響

2.3.1 不同藥物不同條件對Hela 細胞增殖的影響根據不同濃度、不同作用時間的菱角殼黃酮粗提物溶液、菱角殼黃酮純化物溶液、5-Fu 溶液對Hela 細胞增殖的抑制率，評價菱角殼黃酮對Hela 細胞的增殖抑制效果。5-Fu，即胸苷酸合成酶抑制藥，是尿嘧啶5 位上的氫被氟取代的衍生物。5-Fu 在細胞內轉變為5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸（5F-dUMP），而抑制脫氧胸苷酸合成酶，阻止脫氧尿苷酸（dUMP）甲基化轉變為脫氧胸苷酸（dTMP），從而影響DNA 的合成。此外，5-FU 在體內可轉化為5-氟尿嘧啶核苷，以偽代謝產物形式摻入RNA 中干擾蛋白質的合成，從而干擾細胞增殖，可作為陽性對照。

根據表4可知菱角殼黃酮粗提物、純化物均對Hela 細胞具有抑制作用，這種抑制作用在實驗范圍內，均弱于陽性對照5-Fu。同時，菱角殼提取物對Hela 細胞增殖的抑制作用與提取物的濃度、作用時間均呈正相關，會隨著作用時間的增加或作用濃度的升高而增長。本文中的實驗組參數范圍內，并未出現高濃度或長時間抑制作用。此外，藥物濃度低至50 μg/mL 時，作用相同時間，5-Fu 抑制率＞菱角殼黃酮粗提物抑制率＞菱角殼黃酮純化物溶液抑制率，；當藥物濃度在100～800 μg/mL 時，5-Fu 溶液抑制率＞菱角殼黃酮純化物抑制率＞菱角殼黃酮粗提物溶液抑制率。出現這種現象的原因可能是，低濃度的菱角殼黃酮對于Hela 細胞的毒性作用不明顯，需要濃度累積，并且由于其對于微生物的抑制作用反而會為Hela 細胞提供更好的生長環境。黃酮類物質對于Hela 細胞等腫瘤細胞具有一定的細胞毒性，可通過促進細胞凋亡來抑制其增殖。根據現有文獻報道[40-41]，大多數情況下這種抑制作用，有一定的濃度依賴，與本文的研究結果一致。

表4 不同藥物不同條件下對Hela 細胞增殖的抑制作用Table 4 Inhibitory effects of different drugs on the growth of Hela cells under different conditions

2.3.2 不同藥物抑制Hela 細胞的IC50值 IC50值[42-43]（half maximal inhibitory concentration）是指示某一物質（主要指抑制劑）或者藥物在抑制某些生物程序的時半量。在凋亡方面，可以理解為一定濃度的某種藥物誘導細胞凋亡率達到50%，該濃度稱為50%抑制濃度，即凋亡細胞與全部細胞數之比等于50%時所對應的濃度。IC50值可以用來衡量藥物誘導凋亡的能力，即誘導能力越強，該數值越低。

根據表5可知隨著作用時間的增加，菱角殼黃酮粗提物、純化物、5-Fu 的IC50值逐漸下降，則進一步證明在已驗證的48 h 處理時間內，菱角殼黃酮粗提物、菱角殼黃酮純化物、5-Fu 對Hela 細胞的增殖抑制作用均有時間依賴性，呈極顯著正相關（P＜0.01）。同時，以作用時間達到48 h 為例，菱角殼黃酮粗提物、菱角殼黃酮純化物、5-Fu 的IC50值分別為：271.46、268.16、152.09 μg/mL。菱角殼黃酮純化物IC50值低于菱角殼黃酮粗提物，同時，菱角殼黃酮粗提物、純化物的IC50值均高于5-Fu。進一步驗證說明在實驗范圍內，菱角殼黃酮純化物對Hela 細胞的增殖抑制作用高于菱角殼粗提物，菱角殼提取物對Hela 細胞的抑制作用均弱于陽性對照5-Fu。且，不同藥物對Hela 細胞IC50值得影響差異顯著（P＜0.05）。

表5 不同藥物對Hela 細胞增殖抑制作用的IC50 值Table 5 Inhibitory effect of purified water chestnut shell flavonoids on the growth of Hela cells

3 結論

以菱角殼黃酮粗提物中的總黃酮提取得率為評價指標，優化所得最佳工藝參數為：提取時間28 min、料液比1:33 g/mL、乙醇濃度53%。在該條件下，菱角殼黃酮的提取率為3.455%±0.16%。其中，提取溫度對最終得率的影響不顯著（P＞0.05），提取時間、料液比、乙醇濃度對于最終結果的影響均極顯著（P＜0.01）。兩兩交互，僅提取時間與料液比的交互作用對最終菱角殼黃酮粗提物中的總黃酮提取得率影響極顯著（P＜0.01）。通過此工藝提取所得菱角殼黃酮粗提物，以及經過進一步分離純化的菱角殼黃酮純化物均能夠有效抑制Hela 細胞的增殖，說明菱角殼黃酮提取物具有一定的抗腫瘤活性。結合抑制率的變化趨勢可知，菱角殼黃酮提取物抑制Hela 細胞活性對濃度和作用時間有依賴性。在一定范圍內，其抑制作用與提取物濃度和作用時間均呈正相關。菱角殼作為菱角生產企業的下腳料，每年產量頗多，直接丟棄會造成了較大的資源浪費。本研究可以對菱角殼以及其它類似的農副產品資源開發利用提供參考。