超聲輔助低共熔溶劑提取新疆紅棗中環磷酸腺苷的工藝優化

張 雪，劉 婭，劉秀敏，單春會,2,

（1.石河子大學食品學院，新疆石河子 832000；2.新疆特色果蔬貯藏加工教育部工程研究中心，新疆石河子 832000）

紅棗（Zizyphus jujubeMill）作為一種藥食同源食物，因其中富含膳食纖維、多糖、多酚和環磷酸腺苷（cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate，cAMP）[1-2]等多種營養和功效成分而廣受消費者青睞。已有研究表明，紅棗中cAMP 具有第二信使作用，是生物界普遍存在的一種生物活性成分，廣泛調節生物體生理生化過程，人類至少有40 多種疾病（包括心肌梗塞、冠心病、心源性休克、高血壓等重大疾病）與cAMP的代謝調控相關[3-4]。

目前，cAMP 常見的生產方法有：化學合成法、微生物發酵法及天然產物提取法。微生物發酵法存在培養周期長、產量低等缺點；化學合成法的不足之處是化學試劑殘留，易污染環境[5]；而天然產物提取法中的水提法和醇提法存在耗時長，所需條件較高等問題。低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvent，DES）作為一種新型、綠色的高效溶劑，主要是由氫鍵受體和氫鍵供體組成[6]，相比于傳統的有機溶劑，DES 不僅環保、無毒、可生物降解，而且還具有生產成本低、可回收和易于生產的特點[7-8]。已有研究用于總黃酮、多酚、多糖等多種功效成分的提取[9]，Chen 等[10]利用超聲輔助DES 從東茜草和茜草的果實中提取出總黃酮；Gao 等[11]通過微波輔助DES 從桑葉中提取出酚類物質；Chen 等[12]研究發現氯化膽堿/乙二醇型DES 可同時快速高效萃取出卷丹莖中的酚酸和多糖，但是使用DES 提取cAMP 的文章未見報道。本文研究從超聲波輔助不同類型的DES 中選擇出一種DES 能夠從新疆紅棗中提取出最多的cAMP，結合單因素實驗和響應面優化試驗獲得最佳提取條件，旨在提升新疆紅棗附加值，促進新疆紅棗產業經濟增長和可持續發展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗片 新疆石河子市金馬市場；氯化膽堿（分析純）、磷酸二氫鉀（色譜純） 上海源葉生物科技有限公司；丙三醇、乙二醇 分析純，天津市富宇精細化工有限公司；尿素 分析純，天津市光復科技發展有限公司；果糖、萄糖 分析純，福晨（天津）化學試劑有限公司；超純水 屈臣氏桶裝水；甲醇 色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；環磷酸腺苷標準品（cAMP） 純度≥99%，上海麥克林生化科技有限公司。

LC-20AT 高效液相色譜儀 日本島津制作所；78-1 磁力加熱攪拌器 常州普天儀器制造有限公司；JPGL-20G-Ⅱ高速離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；JP-1000B-2 高速多功能粉碎機 永康市永久工貿有限公司；SK5200BT 超聲清洗器 上海科導超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 低共熔溶劑的制備與篩選 以氯化膽堿為氫鍵受體，按1:2 的摩爾比，含水量30%分別與5 種氫鍵供體丙三醇、乙二醇、尿素、果糖、葡萄糖配制DES，使用磁力攪拌器加熱、攪拌至澄清透明狀態，冷卻至室溫保存備用[13-14]。使用5 種DES 以相同的提取條件進行新疆紅棗中cAMP 的提取，選擇提取量較高的DES 做以下研究。

1.2.2 紅棗中cAMP 的提取 紅棗片烘干、粉碎、過0.25 mm 篩網，4 ℃保存。將紅棗粉與DES 按一定料液比混合均勻，使用200 W 超聲功率和35 kHz 超聲頻率的超聲清洗儀在55 ℃下進行提取，3000 r/min離心15 min，上清液即為紅棗中cAMP 提取液。

1.2.3 cAMP 含量的測定及標準曲線的繪制 采用HPLC 法測定cAMP 含量[15]。色譜柱為C18（4.6×250 nm，5 μm）；檢測器為紫外檢測器；流動相為V（甲醇）:V（0.05 mol/L 磷酸二氫鉀）=20:80 等度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量20 μL，在254 nm波長下測定[16-17]。

配制濃度為1、5、10、15、20、25、30、35、40、45 和50 μg/mL 的cAMP 標準品溶液，按照上述的色譜條件測定，并記錄峰面積。

cAMP 提取量（μg）=提取液中cAMP 質量（μg）/紅棗粉質量（g）

1.2.4 單因素實驗 氯化膽堿為氫鍵受體，丙三醇為氫鍵供體組成的DES，以DES 摩爾比分別為1:1、1:2、1:3、1:4、1:5，DES 含水量分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%，料液比分別為1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 g/mL，超聲時間分別為15、30、45、60、75、90 min，超聲溫度分別為25、35、45、55、65 ℃的條件，按照1.2.2 的提取方法，研究DES摩爾比、DES 含水量、料液比、超聲時間和超聲溫度五個因素對新疆紅棗中cAMP 提取量的影響。

1.2.5 響應面優化試驗 根據單因素實驗結果，以DES 含水量、料液比、超聲時間和超聲溫度為自變量，cAMP 提取量（Y）為響應值，利用Box-Behnken設計四因素三水平的響應面優化試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken 響應面因素水平設計Table 1 Box-Behnken response surface factor horizontal design

1.2.6 對照試驗 分別以報道較多的水提法和醇提法為對照，進行新疆紅棗中cAMP 的提取。按照1.2.2 中的提取方法，以相同的提取條件，不同的提取溶劑提取新疆紅棗中的cAMP，按照1.2.3 的色譜條件進行測定，計算cAMP 提取量。

1.3 數據處理

采用Origin 8.5 和Design-Expert 8.0.6 軟件進行數據分析，每組試驗重復3次，采用單因素方差分析，不同字母代表差異顯著（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 cAMP 標準曲線及樣品cAMP 的定性

以cAMP 濃度為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標進行線性回歸分析，得到的回歸方程為：y=44824x-3538.1，R2=0.9992，表明cAMP 標準品濃度與色譜峰面積有良好的線性關系。如圖1 和圖2所示，在HPLC條件下，cAMP 分離度良好，表明樣品與標品保留時間一致，說明DES 法能夠提取出新疆紅棗中的cAMP[18]。

圖1 cAMP 標準品色譜圖（5 μg·mL-1）Fig.1 Chromatogram of cAMP standard substance (5 μg·mL-1)

圖2 DES 提取cAMP 色譜圖Fig.2 cAMP chromatogram extracted by DES

2.2 低共熔溶劑體系篩選試驗

如圖3所示，以氯化膽堿為氫鍵受體，丙三醇、乙二醇、尿素、果糖、葡萄糖分別作為氫鍵供體構成的不同DES 體系提取新疆紅棗中的cAMP，得到的提取量分別是（256.02±0.07）、（227.76±0.08）、（226.56±0.12）、（219.28±0.16）、（188.16±0.06） μg/g。氯化膽堿-丙三醇是這5 種DES 中提取cAMP 含量最高的。這可能是因為cAMP 溶液本身呈酸性，氯化膽堿-丙三醇中含有羥基比較多，并且黏度相對于氯化膽堿-果糖和氯化膽堿-葡萄糖體系較小，有利于cAMP 的溶出，因此選用氯化膽堿-丙三醇構成的DES 體系提取新疆紅棗中的cAMP。

圖3 不同低共熔溶劑對cAMP 提取量的影響Fig.3 Effect of different DES on cAMP extraction amount

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 DES 摩爾比對cAMP 提取量的影響 以氯化膽堿與丙三醇構建DES 體系，考察二者摩爾比對cAMP 提取量的影響見圖4。

圖4 摩爾比對cAMP 提取量的影響Fig.4 Effect of molar ratio on cAMP extraction amount

由圖4可知，DES 體系中氫鍵受體-氯化膽堿與氫鍵供體-丙三醇的摩爾比從1:1 至1:3 時，cAMP提取量呈上升趨勢；摩爾比為1:3 時達到cAMP 的最大提取量，為（240.33±0.13） μg/g；二者摩爾比從1:3 至1:5 時，cAMP 提取量呈下降趨勢。這可能是因為cAMP 為極性大分子，而氯化膽堿與丙三醇DES體系的極性也較大，根據相似相溶原理，cAMP 會在氯化膽堿與丙三醇DES 體系中溶解進而釋出[19-20]，也可能是因為不同的摩爾比使DES 體系的黏度和表面張力不同，過高或者過低的摩爾比會弱化溶劑與cAMP 的相互作用，而1:3 的摩爾比可能恰好達到使cAMP 容易擴散的DES 體系[21]。所以，氯化膽堿與丙三醇的摩爾比以1:3 為宜。由于不同DES 摩爾比提取出的cAMP 含量相差較小，最大值與最小值相差12 μg/g，所以不選擇DES 摩爾比作為響應面優化條件[22]。

2.3.2 DES 含水量對cAMP 提取量的影響 以氯化膽堿與丙三醇構建DES 體系，考察DES 含水量對cAMP提取量的影響見圖5。

由圖5可知，DES 含水量從30%～40%時，cAMP提取量逐漸增加；當DES 含水量達到40%時，cAMP提取量最大值為（257.89±0.09） μg/g；DES 含水量從40%～80%時，cAMP 提取量反而逐漸下降。這主要是因為低含水量的DES 體系黏度太大，滲透性弱[23]。隨著含水量的增加，DES 體系黏度降低增加了溶劑的傳質效率。然而過高的含水量會增加混合物的極性，極性過大會引起分子間氫鍵的斷裂[24]。

圖5 DES 含水量對cAMP 提取量的影響Fig.5 Effect of DES water content on cAMP extraction amount

2.3.3 料液比對cAMP 提取量的影響 以氯化膽堿與丙三醇構建DES 體系，考察料液比對cAMP 提取量的影響見圖6。

圖6 料液比對cAMP 提取量的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on cAMP extraction amount

由圖6可知，隨著料液比的減小，cAMP 提取量逐漸增加，當料液比1:30 g/mL 時，cAMP 提取量達到最大值（259.25±0.10） μg/g，隨后cAMP 提取量開始下降。這可能是因為溶劑量逐漸增加時，紅棗粉與溶劑的接觸面積會大大增加，有利于cAMP 的析出；而cAMP 提取量的下降可能是由于cAMP 在溶劑中溶解達到飽和[25]，或者過多的溶劑起到了稀釋作用。所以，料液比選擇1:30 g/mL。

2.3.4 超聲時間對cAMP 提取量的影響 以氯化膽堿與丙三醇構建DES 體系，考察超聲時間對cAMP提取量的影響見圖7。

由圖7可知，超聲時間從15～45 min 時，cAMP提取量不斷增加，當達到45 min 時，提取量達到最大值（263.94±0.04） μg/g，之后隨時間的延長，cAMP 提取量逐漸減少。這種現象可能是因為隨著超聲時間的延長，超聲波產生的能量在溶液中形成的空化效應和機械效應越來越強[26]，加強了對紅棗細胞壁的破壞，使cAMP 充分擴散，所以cAMP 提取量越來越高。但是隨著超聲時間的延長，體系處于超聲輻射和熱效應的作用下，可能會溶出其他物質干擾cAMP的釋出[27]，導致了cAMP 提取量的下降。所以，超聲時間以45 min 為宜。

圖7 超聲時間對cAMP 提取量的影響Fig.7 Effect of ultrasonic time on cAMP extraction amount

2.3.5 超聲溫度對cAMP 提取量的影響 以氯化膽堿與丙三醇構建DES 體系，考察超聲溫度對cAMP提取量的影響見圖8。

圖8 超聲溫度對cAMP 提取量的影響Fig.8 Effect of ultrasonic temperature on cAMP extraction amount

由圖8可知，隨著超聲溫度的不斷升高，cAMP的提取量也在不斷增加，當超聲溫度為55 ℃時，達到cAMP 最大提取量（265.38±0.05） μg/g，之后隨著溫度繼續升高，cAMP 提取量呈下降趨勢。這可能是由于適當升高溫度導致DES 表面張力降低，黏度下降，有利于紅棗粉與DES 的接觸，增強了cAMP 在溶劑中的溶解；然而溫度過高可能會導致熱敏感物質降解和溶劑的揮發[28]。所以，55℃為cAMP 提取的適宜溫度。

2.4 響應面試驗

2.4.1 響應面試驗結果及方差分析 響應面試驗結果見表2。回歸模型方差分析見表3。

表2 響應面試驗結果Table 2 Response surface test results

對模型數據進行回歸擬合，得到自變量含水量（A）、料液比（B）、超聲時間（C）、超聲溫度（D）與cAMP 提取量（Y）的二次多元回歸方程：Y=276.03+1.03A+5.93B+1.00C-4.05D+4.56AB+2.23AC-8.06AD-3.02BC-11.90BD-1.78CD-18.88A2-8.76B2-15.73C2-6.49D2

從表3 可以看出，回歸模型P＜0.0001，說明模型擬合程度良好；失擬項不顯著，說明未知因素對試驗結果干擾小[29]。方程復相關系數的平方R2=0.9901，說明該方程擬合度較高，可用該模型對cAMP 得率進行分析和預測。模型R2=0.9803，說明試驗穩定性較高[30]。一次項B、D 對響應值影響極顯著（P＜0.01）；交互項AB、AD、BC、BD 對響應值影響極顯著（P＜0.01），AC 對響應值影響顯著（P＜0.05）；二次項A2、B2、C2、D2對響應值影響極顯著（P＜0.01）。根據F值可知各因素對cAMP 提取量影響程度的大小順序為：料液比＞超聲溫度＞含水量＞超聲時間。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model variance analysis

2.4.2 響應面分析 3D 響應面圖的曲線越陡峭，說明該因素對cAMP 提取量的影響越大。橢圓形的等高線說明兩因素的交互作用較強，等高線越密集，表明因素對響應值的影響越顯著[31]。由圖9 可以看出AB、AD、BC、BD 的交互作用曲面坡度較大，等高線密集，說明其對cAMP 提取量影響顯著（P＜0.01）。由等高線圖的密集程度可知，料液比對提取量的影響比超聲溫度、超聲時間、含水量影響顯著；超聲溫度對提取量的影響比含水量影響顯著。

圖9 各因素交互作用的響應面圖Fig.9 Response surface diagram of interaction of various factors

2.4.3 驗證試驗 響應面優化后的提取條件為：含水量44.21%，料液比1:35 g/mL，超聲時間44.83 min，超聲溫度45.34 ℃，預測cAMP 提取量為293.35 μg/g。結合實際操作可行性，以含水量44%，料液比1:35 g/mL，超聲時間45 min，超聲溫度45 ℃的提取條件提取新疆紅棗中的cAMP，得到實際cAMP 提取量為（284.15±0.06） μg/g。實際提取量達到預測值的96.9%，驗證了響應面法優化新疆紅棗中cAMP 的提取工藝可行，得到的回歸模型可靠。

2.5 對照試驗

將DES 提取法與傳統水提法、醇提法進行比較，如圖10所示。DES 提取cAMP 得到的提取量最高（284.15±0.06） μg/g，優于水提法（266.25±0.12）μg/g 與醇提法（270.14±0.10） μg/g。李輝等[32]對北方紅棗中cAMP 提取一次得到的cAMP 含量約為240 μg/g，袁輝等[33]從50 批次不同產品和品種的新疆紅棗中測定cAMP 的平均含量為190.68 μg/g，本次試驗提取的cAMP 含量高于已有的研究結果。這可能是因為氯化膽堿-丙三醇這種DES 可以活化改性紅棗中的木質素和分離木質纖維材料的組分[34]，使cAMP 更容易溶出。

圖10 不同提取溶劑下的cAMP 提取量Fig.10 cAMP extraction amount under different extraction solvents

3 結論

試驗以新疆紅棗為原料，以氯化膽堿-丙三醇為提取溶劑，利用超聲波輔助技術進行cAMP 的提取，確定了cAMP 的最佳提取條件：DES 體系含水量44%，料液比1:35 g/mL，超聲時間45 min，超聲溫度45 ℃，此時的cAMP 提取量為（284.15±0.06） μg/g，比同等條件下的水提法和醇提法得到的cAMP 提取量分別高出6.7%和5.2%。綜合考慮天然cAMP 的含量和實際應用價值，說明了超聲波輔助DES 提取cAMP的可行性和高效性。本文研究打破傳統的cAMP 提取方法，選用超聲波輔助新型、綠色的DES 提取方法，開拓了DES 的使用領域，也增加了新疆紅棗的附加值，拉動新疆棗業經濟發展，為今后的cAMP 提取研究提供了參考意義。