刺梨中質量標記物的提取工藝優化及其含量同時測定

汪 濤，李良群，嚴艷芳，田 強，陳發菊，譚云飛，楊 娟，彭 梅，楊禮壽，羅忠圣，李齊激，楊小生,3,

（1.貴州中醫藥大學研究生院，貴州貴陽 550025；2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽 550014；3.貴州醫科大學天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽 550014）

刺梨（Rosa roxburghii）是一種薔薇科薔薇屬多年生灌木，是我國西南地區特有的一種野生藥用植物，集中分布于貴州、云南、四川等地區[1]。刺梨的利用迄今已有400 多年的歷史，具有很高的營養和藥用價值。刺梨的根、莖、葉、果實均可入藥，有健胃、消食、滋補的作用[2-3]。研究表明，刺梨富含維生素C、五環三萜、黃酮類、多糖類、有機酸類、其他類化合物如超氧化物歧化酶（SOD）等化學成分[4-8]，具有抗凋亡作用、降血糖、抗氧化、減輕炎癥作用、增強免疫功能、調節小鼠結腸菌群等多種生物活性[9-13]；因此刺梨被廣泛應用于食品、醫藥、保健品等行業。

中藥質量標志物（Q-marker）是用于評價中藥質量的新概念，2016 年由劉昌孝院士首次提出，為藥材、飲片、制劑等方面建立了可參照的質量評價和質量控制模式，對形成質量和風險控制的“藥材-飲片-成藥”全過程質量追溯系統、建立全新的質量管理體系具有實踐應用價值[14-15]。現代藥理學研究表明，刺梨三萜類物質在抗抑郁、消炎、對海馬神經元的保護及機體免疫調節等方面具有較好的藥理活性[16-19]，此外，刺梨三萜提取物對酒精性肝損傷的小鼠具有很好的治療效果[20]，并且刺梨總三萜（主要含刺梨苷、野薔薇苷、薔薇酸和委陵菜酸）還可以改善機體免疫抑制[21]。基于刺梨三萜成分的活性以及其在刺梨植物體內中的較高含量，因此可以作為刺梨質量標志物。

迄今，有關刺梨三萜的研究主要集中于總三萜含量檢測或者2 種三萜的含量測定。南瑩等[22]研究了貴州龍里地區的刺梨果實中總三萜的含量；代甜甜等[23]測定了貴州松桃地區野生刺梨中總三萜的含量；劉英梟等[24]研究了刺梨果渣中薔薇酸的提取工藝；李齊激等[25-26]使用HPLC 測定了刺梨中刺梨苷或薔薇酸和1-β-羥基薔薇酸的含量。在提取工藝研究方面，刺梨三萜的提取方法主要有超聲提取[27]和乙醇回流提取[28]，但是普遍存在提取效率不高，損失較大的問題。特別是近幾年來，貴州省將刺梨產業打造成富民和鄉村振興的大產業，大面積種植刺梨和開發高附加值的刺梨產品是貴州促進經濟發展的主要方式之一。如能以刺梨中含有的功能性三萜類物質為基礎開發高附加值的產品，將會創造更大的經濟效益。因此，對刺梨中質量標記物的提取工藝進行優化及其含量同時的測定進行研究，具有較強的新穎性和實際應用價值。本研究以貴州惠水野生刺梨為原材料，以4 個化合物即薔薇酸、委陵菜酸、刺梨苷、野薔薇苷為質量標志物建立HPLC 同時測定方法并優化提取工藝，分析刺梨根、莖葉、果四個不同部位中4 種化合物的含量，為其開發利用與質量評價提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨根、莖、葉、果 采自貴州省黔南布依族苗族自治州惠水縣212 國道（經度：106.673411，緯度：26.197517），經貴州中醫藥大學孫慶文教授鑒定為薔薇科薔薇屬植物繅絲花的根、莖、葉、果實，標本（憑證202106001）保存于貴州省、中國科學院天然產物化學重點實驗室；三萜化合物標準品（薔薇酸，刺梨苷，野薔薇苷自制，經HPLC 檢測測定純度≥98%）；乙醇（分析級） 國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙腈（HPLC 級） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氟乙酸（分析級） 天津市科密歐化學試劑有限公司。

BJ-400T 型粉碎機 陜西現代醫藥有限公司；SB25-12DTD 型超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；FA2004N 型電子天平（萬分之一）上海菁海儀器有限公司；DKN612C 型電熱鼓風干燥箱 上海雅馬拓科技貿易有限公司；DK-98-Ⅱ型水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；Eppendor f 5427R型高速冷凍離心機 北京龍躍生物科技發展有限公司；Agilent-1260 型高效液相色譜儀 上海連橋生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 質量標志物的提取工藝 參照劉偉等[29]的方法，略改：將刺梨根置于65 ℃的烘箱中烘干，粉碎，過3 號篩。精密稱定2.00 g 刺梨根粉末，按照料液比1:25 加入體積分數70%的乙醇，先放入超聲儀中25 ℃、250 W 超聲30 min，再將料液進行加熱回流2 h，連續提取3次，得到刺梨總質量標志物提取液。以同樣的方法對刺梨莖、葉、果進行提取。

1.2.2 試樣制備

1.2.2.1 標準品溶液配制 精密稱定刺梨苷標準品10.00 mg，置于10 mL 容量瓶中，用75%甲醇完全溶解，定容至刻度線，即得刺梨苷標準溶液（刺梨苷濃度為1.022 mg/mL）。按照同樣的方法配制濃度為1.020 mg/mL 的野薔薇苷標準品溶液，濃度為1.192 mg/mL 的薔薇酸標準品溶液和濃度為1.098 mg/mL的委陵菜酸標準溶液。

1.2.2.2 供試品溶液配制 精密稱定刺梨根、莖、葉、果粉末樣品2.00 g，置于具塞錐形瓶中，裝入250 mL錐形瓶中，按1:25 g/mL 的比例加入50 mL 70%乙醇。先放入超聲儀中25 ℃、250 W 超聲30 min，再將料液進行加熱回流2 h，重復提取3次，合并提取液，低溫濃縮后用75%甲醇定容至25 mL 量瓶中，0.45 μm微孔濾膜過濾，然后以刺梨苷、野薔薇苷、薔薇酸和委陵菜酸4 個質量標志物的含量為指標，用HPLC進行檢測。

1.2.3 提取方法

1.2.3.1 超聲提取 精密稱定2.00 g 預處理后的刺梨根粉末，裝入250 mL 錐形瓶中，按1:20 g/mL 的比例加入40 mL 100%乙醇。 放入超聲儀中25 ℃、250 W超聲30 min 后將料液過濾，取濾液，過0.45 μm 微孔濾膜裝入2 mL 螺紋樣品瓶中，待HPLC 檢測使用。

1.2.3.2 乙醇回流提取 精密稱定2.00 g 預處理后的刺梨根粉末，裝入250 mL 錐形瓶中，按1:20 g/mL的比例加入40 mL 100%乙醇，加熱回流2 h，過濾，取濾液，過0.45 μm 微孔濾膜裝入2 mL 螺紋樣品瓶中，待 HPLC 檢測使用。

1.2.3.3 超聲輔助乙醇回流提取 精密稱定2.00 g預處理后的刺梨根粉末，裝入250 mL 錐形瓶中，按1:20 g/mL 的比例加入40 mL 100%乙醇。放入超聲儀中25 ℃、250 W 超聲30 min 后加熱回流2 h，取濾液，過0.45 μm 微孔濾膜裝入2 mL 螺紋樣品瓶中，待 HPLC 檢測使用。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 溶劑用量對各質量標志物含量的影響 精密稱定2.00 g 預處理后的刺梨根粉末，裝入250 mL錐形瓶中，以不同溶劑用量（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）加入100%乙醇。放入超聲儀中25 ℃、250 W 超聲30 min 后加熱回流2 h，以4 個刺梨質量標志物的含量為指標，用HPLC 進行檢測。

1.2.4.2 乙醇濃度對各質量標志物含量的影響 精密稱定2.00 g 預處理后的刺梨根粉末，裝入250 mL錐形瓶中，按1:25 的比例加入50 mL 不同的乙醇體積分數（60%、70%、80%、90%和100%）乙醇。放入超聲儀中25 ℃、250 W 超聲30 min 后加熱回流2 h，然后以4 個刺梨質量標志物的含量為指標，用HPLC 進行檢測。

1.2.4.3 回流時間對各質量標志物含量的影響 精密稱定2.00 g 預處理后的刺梨根粉末，裝入250 mL錐形瓶中，按1:25 的比例加入50 mL 70%乙醇。放入超聲儀中25 ℃、250 W 超聲30 min 后分別加熱回流（0.5、1、1.5、2 和2.5 h），然后以4 個刺梨質量標志物的含量為指標，用HPLC 進行檢測。

1.2.4.4 提取次數對各質量標志物含量的影響 精密稱定2.00 g 預處理后的刺梨根粉末，裝入250 mL錐形瓶中，按1:25 的比例加入50 mL 70%乙醇。放入超聲儀中25 ℃、250 W 超聲30 min 后加熱回流2 h（分別加熱1、2、3、4 和5次），然后以4 個刺梨質量標志物的含量為指標，用HPLC 進行檢測。

1.2.5 響應面試驗 本研究使用Design Export 8.0軟件中的Box-Behnken 中心組合設計優化提取條件（表1），在上述單因素實驗基礎上，考察溶劑用量（A）、乙醇濃度（B）和回流時間（C）3 個因素對刺梨三萜質量標志物含量的影響，從而確定刺梨中三萜質量標志物的最適提取工藝。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Design and results of response surface method

1.2.6 刺梨根、莖、葉、果中4 個標志物的提取及含量測定

1.2.6.1 樣品處理 通過單因素與響應面試驗，得到提取刺梨質量標志物的最佳條件，在最佳條件下繼續提取刺梨根、刺梨莖、刺梨葉、刺梨果實中的質量標志物。然后采用高效液相色譜法對從刺梨中提取到的質量標志物含量進行分析。各質量標志物的含量等于各質量標志物的量/刺梨原料質量（單位mg/g），以4 種質量標志物的百分含量總和即總三萜化合物百分含量為評價指標。

1.2.6.2 儀器參數 Thermo C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長203 nm；柱溫20 ℃；流速為1 mL/min；進樣體積為10 μL；流動相A 為0.05%三氟乙酸水，B 為乙腈；梯度洗脫條件為0～15 min，25% A～30% A；15～20 min，30% A～35% A；20～60 min，35% A 等度洗脫。

1.3 數據處理

每個實驗重復3次，結果表示為Mean±SD，未做特殊說明差異顯著性分析限定為P=0.05，利用Excel 2010 對實驗數據進行分析，采用Origin 2018 64Bit 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 系統適用性考察

吸取“1.2.3.1”項下標準品溶液適量，在“1.2.2”項色譜條件下進樣，結果見圖1。由此表明，理論塔板數以刺梨苷、野薔薇苷、薔薇酸、委陵菜酸峰計，分別為30592、40063、30163、34065，分離度均大于1.5，各基線分離良好。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系考察 吸取“1.2.2.1”項下標準品溶液適量，在“1.2.6.2”項色譜條件下進樣。進樣體積依次為2、4、6、8、10、20 μL，以質量濃度與進樣體積的乘積為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸并分析，結果各成分的r都在三個9 以上，表明各成分峰面積和質量濃度與進樣體積的乘積呈良好線性關系（見表2）。

2.2.2 日內和日間精密度試驗 吸取“1.2.2.1”項下標準品溶液適量，在“1.2.6.2”項色譜條件下連續進樣6次，連續3 d，測得刺梨苷、野薔薇苷、薔薇酸、委陵菜酸的日內精密度RSD 分別為1.20%、1.80%、1.20%、1.40%；日間精密度分別為1.79%、0.89%、1.26%、1.23%，表明儀器日內和日間精密度良好。

2.2.3 穩定性試驗和重復性試驗 吸取“1.2.2.1”項下標準品溶液適量，于0、2、4、8、12、24 h 在“1.2.6.2”項色譜條件下進樣，測得刺梨苷、野薔薇苷、薔薇酸、委陵菜酸的精密度RSD 分別為1.44%、0.96%、0.96%、1.47%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。精密稱取同一批刺梨根粉末6 份，按“1.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“1.2.6.2”項色譜條件下進樣，測得刺梨苷、野薔薇苷、薔薇酸、委陵菜酸的精密度RSD 分別為1.40%、1.48%、1.65%、1.78%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 加樣回收試驗 精密稱定刺梨根粉末樣品6 份，每份1.00 g，精密稱定，每份樣品分別加入相對應標準品（刺梨苷4.61 mg、野薔薇苷5.02 mg、薔薇酸4.88 mg、委陵菜酸3.24 mg），按“1.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測得4 種成分加樣回收率，結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n=6）Table 3 Results of recovery tests for various constituents (n=6)

2.3 刺梨中各質量標志物提取方法比較結果

首先以刺梨根為提取原料，對比超聲提取法、乙醇回流提取法及超聲-乙醇回流法三種提取工藝，以刺梨質量標志物化合物類型為橫坐標，質量標志物含量為縱坐標，其結果如圖2所示。由圖2可知，先超聲再乙醇回流結合方法優于單獨超聲提取法與單獨乙醇回流提取法；其二是超聲加乙醇回流得到的刺梨各質量標志物含量分別為，刺梨苷0.43%，野薔薇苷0.55%，薔薇酸0.22%，委陵菜酸0.26%。因此，接下來的試驗都以超聲-乙醇回流法提取刺梨根、刺梨莖、刺梨葉和刺梨果中質量標志物。

圖2 三種提取方法效率對比圖Fig.2 Comparison of three extraction methods

2.4 單因素實驗結果

溶劑用量、乙醇濃度、提取時間及提取次數等是影響刺梨中4 個質量標志物含量的主要因素[30]。因此，基于超聲-乙醇回流法，考察溶劑用量、乙醇濃度、回流時間以及提取次數對刺梨中4 個質量標志物含量的影響。

2.4.1 溶劑用量對刺梨中各質量標志物含量的影響溶劑用量對刺梨根中各質量標志物含量的影響結果見圖3。由圖3可知：當料液比從1:10～1:25 時，刺梨中三萜化合物的含量呈現增大的趨勢，可能由于隨著溶劑用量的增大，刺梨三萜在乙醇中的溶解度也增大，在1:25 的時候刺梨三萜的溶解度達到最大，各三萜化合物的含量也達到最大（刺梨苷0.40%、野薔薇苷0.58%、薔薇酸0.18%、委陵菜酸0.24%）；當料液比從1:25～1:30 時，刺梨苷和野薔薇苷明顯降低，委陵菜酸和薔薇酸的含量逐漸下降，這可能是由于其他醇溶性成分溶出，使得刺梨三萜的含量下降。選定料液比1:20、1:25、1:30 作為響應面試驗水平。

圖3 溶劑用量對刺梨根中質量標志物含量的影響Fig.3 Effects of solvent dosage on the contents of Q-marker in R. roxburghii root

2.4.2 乙醇濃度對刺梨中各質量標志物含量的影響乙醇濃度對刺梨根中各質量標志物含量的影響結果見圖4。由圖4可知：當乙醇體積分數從60%升到70%時，刺梨苷的含量增大，其含量從0.52%增加到0.55%，提高了5.77%；當乙醇體積分數從60%升到70%時，野薔薇苷的含量緩慢上升，其含量從0.59%增加到0.63%，提高了6.78%；而當乙醇體積分數從80%升到100%時，兩者的含量呈現快速下降的趨勢；當乙醇濃度從60%升到80%時，薔薇酸的含量呈現緩慢上升的趨勢，從0.11%增加到0.21%，提高了90.90%；委陵菜酸的含量增加到最大（2.37 mg/g），而乙醇濃度在80%以后兩者的含量開始下。這可能是由于刺梨苷和野薔薇苷在乙醇濃度為70%的時候的溶出率較好，因此在此時的含量較高；而薔薇酸和委陵菜酸則在乙醇濃度為80%的時候溶出率較好。綜合四者的總含量考慮，選定乙醇濃度60%、70%、80%作為響應面試驗水平。

圖4 乙醇濃度對刺梨根中質量標志物含量的影響Fig.4 Effects of ethanol concentration on the contents of Q-marker in R. roxburghii root

2.4.3 回流時間對刺梨中各質量標志物含量的影響回流時間對刺梨根中各質量標志物含量的影響結果見圖5。提取時間過短會造成原料提取不完全，時間過長且在較高的溫度下會導致成分破環。由圖5可知：在30 min 時，提取不夠完全，刺梨三萜浸出不完全，因此含量較低；隨著回流時間的增加，刺梨苷、野薔薇苷和委陵菜酸的含量均呈上升趨勢，在回流時間為2 h 時，兩者的含量達到最高（刺梨苷0.87%、野薔薇苷0.98%、委陵菜酸0.26%），隨后刺梨苷的含量呈現下降的趨勢，而野薔薇苷和委陵菜酸的含量基本變化不大；在回流時間從0.5 h 到1.5 h 時，薔薇酸的含量緩慢上升，達到最大值（0.34%）；當繼續增加回流時間時，薔薇酸的含量變化基本不大，這表明提取液已基本飽和，刺梨中薔薇酸已不易再滲出至溶液中，野薔薇苷和委陵菜酸亦是如此。本研究結果和高偉城等[31]采用 響應面法優化枇杷葉三萜酸類成分的提取工藝中提取時間研究結果相一致，結合四者的總含量考慮，選定提取時間1.5、2、2.5 h 作為響應面試驗水平。

圖5 回流時間對刺梨根中質量標志物含量的影響Fig.5 Effect of reflux time on the contents of Q-marker in R.roxburghii root

2.4.4 提取次數對刺梨中各質量標志物含量的影響提取次數對刺梨根中各質量標志物含量的影響結果見圖6。由圖6可知，當提取次數逐漸增加到3次時，刺梨苷的含量從0.17%到0.22%、野薔薇苷的含量從0.27%到0.36%，而薔薇酸和委陵菜酸的含量差別不大；提取3次以上，刺梨中各質量標志物含量幾乎無增加，因此在后續實驗中將提取3次。而在實際生產中考慮到生產成本的問題，提取次數因根據實際情況而定。考慮到提取次數對提取刺梨質量標志物的影響不大，將不作為響應面優化的影響因素。

圖6 提取次數對刺梨根中質量標志物物含量的影響Fig.6 Effect of extraction times on the contents of Q-marker in R. roxburghii root

2.5 響應面試驗結果

2.5.1 試驗設計與結果 參考刺梨質量標志物提取單因素實驗結果，設計響應面試驗考察溶劑用量、乙醇濃度及提取試劑對刺梨中4 個三萜化合物含量的影響，結果見表4。

表4 響應面法試驗結果Table 4 Design and results of response surface method

通過對表4 試驗數據進行二次回歸分析，得出多項式回歸方程如下：Y=0.096+(1.200E-003)A-(1.325E-003)B+(3.050E-003)C+(4.975E-003)AB-(1.975E-003)AC-(2.250E-004)BC-0.017A2-(5.558E-003)B2-(9.507E-003)C2，式中Y 為三萜化合物得率，A、B、C 分別為溶劑用量、乙醇濃度及提取時間，R2=0.8834。

2.5.2 響應面結果分析 由表5 回歸模型方差分析結果可以看出，實驗設計模型P＜0.05，具有顯著差異，三萜化合物與3 個變量之間有顯著的線性關系。失擬項P＞0.05 不顯著，表明所建立的二次回歸模型能有效的對響應值進行預測。通過表5 回歸模型系數顯著性檢驗結果可知，A2、C2對刺梨4 個三萜化合物含量的影響顯著。回歸優化響應面圖見圖7、圖8、圖9，響應值與各因素的等高線圖、三維空間響應面圖可直觀地展現各因素之間的交互作用對刺梨三萜含量的影響，通過等高線的密集程度判斷兩因素交互的影響程度[32]。由圖7a可知，等高線沿乙醇濃度密集，乙醇濃度對刺梨三萜化合物含量的影響大于溶劑用量。由圖7b可知，乙醇濃度固定不變時，增大溶劑用量，刺梨三萜化合物的含量先增大后減小；溶劑用量固定不變時，乙醇濃度增加，刺梨三萜化合物的含量先增大后減小；由圖8a可知，等高線沿溶劑用量密集，溶劑用量對刺梨三萜含量的影響大于回流時間。由圖8b可知，溶劑用量固定不變時，回流時間增加，刺梨三萜化合物的含量先增大后減小；回流時間固定不變時，溶劑用量增加，刺梨三萜化合物的含量先增大后減小；由圖9a可知，等高線沿乙醇濃度密集，乙醇濃度對刺梨三萜含量的影響大于回流時間。由圖9b可知，乙醇濃度固定不變時，回流時間增加，刺梨三萜化合物的含量先增大后減小；回流時間固定不變時，乙醇濃度增加，刺梨三萜化合物的含量先增大后減小。綜上，3 個因素對刺梨三萜化合物含量影響為乙醇濃度＞溶劑用量＞提取時間。

圖7 溶劑用量和乙醇濃度交互作用對刺梨根中質量標志物含量的影響Fig.7 Effect of solvent dosage and ethanol concentration on the contents of Q-marker in R. roxburghii root

圖8 溶劑用量和回流時間交互作用對刺梨根中質量標志物含量的影響Fig.8 Effect of solvent dosage and reflux time on the contents of Q-marker in R. roxburghii root

圖9 乙醇濃度和回流時間交互作用對刺梨根中質量標志物含量的影響Fig.9 Effect of ethanol concentration and reflux time on the contents of Q-marker in R. roxburghii root

表5 回歸模型的方差分析和回歸系數的顯著性檢驗Table 5 Analysis of variance for the established regression model and significance test of each regression coefficient

2.5.3 提取工藝優化及驗證 通過Design-Expert 8.0軟件中Numerical 優化模塊得到預測值，給出模型預測最佳提取條件為溶劑用量為1:25（g/mL）、乙醇濃度70.11%、提取時間1.98 h；在此優化條件下刺梨質量標志物的總含量為4.89%。因試驗儀器精度限制，采用溶劑用量為1:25（g/mL）、乙醇濃度70%、提取時間2 h 的提取條件進行3次平行實驗，測得刺梨質量標志物的平均含量5.12%±0.02%，RSD 為1.923%，說明響應面模型具有可行性。

2.6 刺梨中不同部位4 個質量標志物的含量測定

全面考察4 個標志物在刺梨各部位的分布情況，使用最適的條件和方法，經HPLC 測定刺梨根、莖、葉和果中4 個標志物的含量，結果見表6。由表6可知：刺梨苷在葉子中的含量較高，這可能是由于葉片的光合作用或其轉化產物是次生代謝產物的底物，葉片光合作用旺盛，產生的底物多，所以合成的次生代謝產物也多[33]，而刺梨苷的合成底物可能在葉片較多，則在葉片的含量較其他部位高；野薔薇苷在莖中的分布較高；薔薇酸和委陵菜酸則較多的分布于果實中，這可能是由于在合成、運輸的過程中產生了一定的差異。4 個標志物在刺梨不同部位的總含量分別為刺梨葉2.64%、刺梨根2.41%、刺梨莖2.40%、刺梨果2.23%。由此可見，刺梨的不同部位中4 個標志物的總含量（從大到小）順序為刺梨葉、刺梨根、刺梨莖、刺梨果。

表6 刺梨不同部位的含量Table 6 Contents of different parts of R. roxburghii

3 結論與討論

迄今，國內外對刺梨成分工藝的研究主要集中在刺梨中多糖和黃酮類物質的提取工藝優化以及刺梨果酒的工藝優化[34-37]，也有部分研究是關于刺梨多酚[38]和刺梨膳食纖維的工藝優化[39]，而對刺梨中三萜提取條件的優化研究較少。本實驗的單因素實驗結果表明，采用超聲-回流的方法以高收率獲得刺梨質量標志物，該方法可以作為刺梨質量標志物的提取工藝方式。據相關文獻報道[34]，溶劑用量、乙醇濃度與提取時間是影響刺梨質量標志物提取效率最主要的因素。實驗過程中，隨著溶劑用量的增加，刺梨三萜化合物的含量會增加；但是如果乙醇的添加量太少，會導致其無法浸潤整個刺梨根粉末，影響刺梨三萜的提取，也會為后續過濾、檢測等工藝增加一定的難度。此外，本研究在對刺梨根質量標志物的提取過程中發現：從回流時間來看，回流2 h 可提高刺梨三萜的含量，但是當超過2 h 后，刺梨三萜的含量呈現下降的趨勢，這可能是由于在一定時間后，提取過程中的原料和溶劑達到了飽和狀態。根據本研究中的響應面試驗結果，可以得出影響提取工藝效率大小，依次為乙醇濃度＞溶劑用量＞提取時間。提取刺梨中質量標志物的最佳工藝為：按照料液1:25（g/mL）加入70%的乙醇，先放入超聲儀25 ℃、250 W 超聲30 min，再將料液進行加熱回流2 h，連續提取3次。在此條件下，所得到的刺梨葉中質量標志物的總含量為2.64%，分別為刺梨苷含量為0.99%、野薔薇苷含量為0.72%、薔薇酸含量為0.43%和委陵菜酸含量為0.51%。考慮到實際生產中需要成本問題，應當適當地降低乙醇濃度和提取次數以提高經濟效益。

與此同時，采用HPLC 法同時測定刺梨中4 種質量標志物的研究尚未見報道。本研究探索了HPLC 同時測定刺梨4 種質量標志物的含量分析檢測方法，以Thermo C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長203 nm；柱溫20 ℃；流速為1 mL/min；進樣體積為10 μL；流動相A 為0.05%三氟乙酸水，B 為乙腈；梯度洗脫條件為0～15 min，25% A～30%A；15～20 min，30% A～35% A；20～60 min，35% A 等度洗脫作為檢測條件，能夠較好同時測定4 種質量標志物。以此條件，采用HPLC 測定了刺梨不同部位的質量標志物，發現刺梨三萜總含量在刺梨中的（從大到小）順序為刺梨葉、刺梨根、刺梨莖、刺梨果。而目前刺梨常用的藥用部位為根、莖和果實，葉片利用較少，因此可以將葉片作為開發三萜類化合物的新選擇。刺梨中質量標記物的提取工藝及其含量HPLC 同時測定的研究將為刺梨質量評價和開發及生產利用提供科學依據。