超聲輔助三相分配法同步提取大蒜中大蒜辣素和多糖的工藝優化

史繼童，孫 羽，姜欣洋，劉蘭玲，顏培正，李 佳，蒲高斌，趙東升

（山東中醫藥大學藥學院，山東濟南 250355）

大蒜（Allium sativumL.）為蔥科或廣義百合科蔥屬草本植物[1]，地下鱗莖為藥食兩用資源，性溫，味辛，富含大蒜辣素、多糖、蒜氨酸等多種活性成分[2-3]，大蒜辣素是大蒜中最主要的活性成分，多糖含量最大，約占鮮蒜質量的26%～30%，二者具有高效的抗菌、抗癌、抗氧化和免疫調節活性等藥理作用[4-6]。

目前國內外研究多集中對大蒜中大蒜辣素或多糖的單一成分提取[7-9]，而鮮有同步提取兩種活性成分的工藝研究。若能對大蒜中大蒜辣素和多糖進行同步提取，不僅可以提高大蒜資源的利用率，且降低成本，將產生良好的經濟效益。三相分配體系（threephase partitioning，TPP）是一種簡易的新型分離技術，可以將從動植物中提取的組分分配在三相中實現選擇性分離，即上相（油脂及脂溶性物）、中相（蛋白質）和下相（多糖類等水溶性物質）[10]，已有學者利用三相分配體系提取多糖、蛋白質、油脂等天然活性成分[11-14]。大部分TPP 體系由叔丁醇、硫酸銨和粗水提取液（或懸浮液）組成。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）為水溶性非離子聚合物，與叔丁醇相比具有無毒性、生物相容性等優點[15]，已被廣泛應用于新型TPP 體系中，并有研究報道稱聚乙二醇可以大大提高大蒜中蒜酶催化反應中的穩定性[16]。

因此，本研究以聚乙二醇為有機相，硫酸銨為水相，采用超聲輔助三相分配法同步提取大蒜中大蒜辣素和多糖，通過單因實驗和響應面法優化提取工藝，并對上相大蒜辣素提取液的穩定性進行考察，為大蒜資源的進一步研究開發和綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大蒜 山東省濟南市長清區當地超市，置4 ℃冰箱保存備用；L-半胱氨酸（純度大于99%）、5,5′-二硫代雙（DTNB，純度大于98%）、濃硫酸（純度大于98%）、聚乙二醇4000、硫酸銨、Hepes、苯酚 上海麥克林生化科技有限公司。

KQ-500GVDV 雙頻恒溫數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；ST 16R 高速離心機 賽默飛世爾科技有限公司；UV 9100 B 紫外可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大蒜辣素和多糖的同步提取

1.2.1.1 樣品預處理 參考關明等報道方法[17]，取適量新鮮大蒜，去皮，用蒸餾水洗凈，晾干鱗莖，用組織搗碎機搗碎成蒜漿，置40 ℃水浴10 min。

1.2.1.2 三相分配法提取大蒜辣素和多糖 參照Yan 等[11]報道并稍做修改。將聚乙二醇和硫酸銨按一定質量比例置于離心管中，加入蒜漿5.0 g，固定體系質量為25 g，剩余質量用蒸餾水補足。在一定條件超聲提取，過濾，6000 r/min 離心10 min，得到TTP 體系。分別取上、下相提取液以蒸餾水稀釋并定容至25 mL 容量瓶，用于測定大蒜辣素和多糖提取量。

1.2.2 單因素實驗 為了確定超聲輔助三相分配法同步提取大蒜中大蒜辣素和多糖的工藝優化參數范圍，在前期預試驗和文獻報道[18]的基礎上，固定超聲頻率45 kHz 和功率350 W，選取PEG 質量分數、硫酸銨質量分數、超聲溫度、超聲時間為主要工藝參數進行研究。

1.2.2.1 不同硫酸銨質量分數對大蒜辣素和多糖提取量的影響 稱取5.0 g 蒜漿5 份，設置硫酸銨質量分數分別為12%、15%、18%、21%、24%，在PEG質量分數為24%、超聲時間為40 min、超聲溫度為30 ℃條件下提取，試驗重復3次，取平均值計算大蒜辣素和多糖提取量。

1.2.2.2 不同PEG 質量分數對大蒜辣素和多糖提取量的影響 稱取5.0 g 蒜漿5 份，設置PEG 質量分數分別為14%、19%、24%、29%、31%，在硫酸銨質量分數為18%、超聲時間為40 min、超聲溫度為30 ℃條件下提取，試驗重復3次，取平均值計算大蒜辣素和多糖提取量。

1.2.2.3 不同超聲溫度對大蒜辣素和多糖提取量的影響 稱取5.0 g 蒜漿5 份，設置超聲溫度分別為10、30、50、70、80 ℃，在PEG 質量分數為24%，硫酸銨質量分數為18%，超聲時間為40 min 條件下提取，試驗重復3次，取平均值計算大蒜辣素和多糖提取量。

1.2.2.4 不同超聲時間對大蒜辣素和多糖提取量的影響 稱取5.0 g 蒜漿5 份，設置超聲時間為10、40、70、100、130 min，在PEG 質量分數為24%，硫酸銨質量分數為18%、超聲溫度為30 ℃條件下提取，試驗重復3次，取平均值計算大蒜辣素和多糖提取量。

1.2.3 響應面試驗 基于單因素實驗結果，選擇對大蒜辣素和多糖提取量影響顯著的三個因素為Box-Behnken 試驗的自變量，以大蒜辣素和多糖提取量為響應值，優化提取工藝。因素水平設計見表1。

表1 響應面因素水平設計Table 1 Response surface factor level design

1.2.4 大蒜辣素提取液穩定性的考察 由于大蒜辣素化學性質不穩定，遇光、熱分解成各種含硫化合物[19]，因此在Design-Expert 8.0.6 軟件優化的最佳工藝條件下，考察大蒜辣素提取液在室溫放置0、2、4、6、8、10 h 后，大蒜辣素提取液的穩定性。

1.2.5 大蒜辣素和多糖提取量的測定 由于生長環境、氣候等因素導致不同產地和采收期大蒜含水量差異較大，本研究以干燥品計算大蒜辣素和多糖的提取量[20]。

1.2.5.1 大蒜辣素提取量的測定 取5.0 mL Hepes緩沖液（pH7.5）配制的10 mmol/L 半胱氨酸溶液，加入1.0 mL 上相提取液，混合均勻，26 ℃水浴靜置15 min，取1.0 mL 稀釋100 倍；取4.5 mL 稀釋后的反應混合液與0.5 mL 用Hepes 緩沖液（pH7.5）配制濃度為1.5 mmol/L 的 DTNB 溶液，混合均勻，26 ℃水浴靜置15 min，在412 nm 波長下測量吸光度值（A）[21]。按上述操作步驟加1.0 mL 去離子水測量半胱氨酸溶液未與上相提取液反應的初始吸光度值（A0）。

其計算公式如下：

式中：c 為大蒜辣素物質的量濃度（mmol/mL）；A0為半胱氨酸溶液的初始吸光度值；A 為半胱氨酸溶液與上相提取液反應后的吸光度值；β為半胱氨酸溶液的稀釋倍數；14150 為摩爾消光系數。

式中：Y1為大蒜辣素提取量（mg/g）；V 為上相提取液總體積（mL）；M 為大蒜辣素的分子量；m 為蒜漿的質量（g）。

1.2.5.2 多糖提取量的測定 多糖的提取量用苯酚-硫酸法測定[22]。以葡萄糖的濃度C（g/L）和吸光度A 為X、Y 軸，標準曲線方程為A=89.235C+0.0771（r=0.9989）。根據標準曲線方程計算多糖在下相中的提取量。

式中：Y2為多糖提取量（mg/g）；C 為按照標準曲線方程計算得到的多糖質量濃度（g/L）；V 為下相提取液總體積（mL）；N 為下相提取液稀釋倍數；m 為蒜漿的質量（g）；103為單位轉換。

1.3 數據處理

所有實驗操作重復3次，實驗數據為3次平行測定的平均值。使用軟件Excel、SPSS 26.0、Design-Expert 8.0.6 分析數據，GraphPad Prism 8 繪圖。在單因素方差分析（ANOVA）之后，進行事后Turkey HSD 檢驗，方差分析中P＜0.05 表明具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 硫酸銨質量分數對大蒜辣素提取量和多糖提取量的影響 由圖1可知，在固定相同提取條件下，隨著硫酸銨質量分數的增大，上相中大蒜辣素的提取量先呈現先下降后上升的趨勢，這與前期報道現象一致[23]，可能由于體系中硫酸銨的質量分數增加時，會與PEG 爭奪體系中的水分子，使大蒜辣素在上相的含量減少，導致提取量下降。當硫酸銨質量分數超過18%后，提取量顯著下降（P＜0.05）。下相中多糖的提取量呈現先上升后下降的趨勢，由于硫酸銨質量分數的增加，鹽溶效應不斷增強，下相水合能力增強從而吸水能力增強，加強了多糖在下相的析出作用[24]，當硫酸銨質量分數過高時，影響多糖結構表面的疏水性，改變了上下兩相體積比和分配系數，從而使得提取量降低[25]。由于硫酸銨質量分數為15%～21%時多糖提取量變化不顯著（P＞0.05），綜合考慮，選擇硫酸銨質量分數為18%作為后續提取條件。

圖1 硫酸銨質量分數對大蒜辣素和多糖提取量的影響Fig.1 Effects of ammonium sulfate concentration on extraction efficiency of allicin and polysaccharides

2.1.2 不同PEG 質量分數對大蒜辣素和多糖提取量的影響 由圖2可知，在固定相同提取條件下，隨著PEG 質量分數的增大，上相中大蒜辣素的提取量呈現先上升后下降的趨勢，且在PEG 質量分數為24%時達到最大，且與其它PEG 質量分數存在顯著性差異（P＜0.05）。下相中多糖的提取量呈下降的趨勢。由于PEG 質量分數的不斷增加，TPP 體系的黏度增加，成相物質分子之間空間位阻增大[26]，導致大蒜辣素和多糖在TPP 體系中分配減少，TTP 體系溶液黏度的增加不利于蒜漿的過濾分離，更不便于工業化生產。綜合考慮，選擇PEG 質量分數為24%作為后續提取條件。

圖2 PEG 質量分數對大蒜辣素和多糖提取量的影響Fig.2 Effects of PEG concentration on extraction efficiency of allicin and garlic polysaccharides

2.1.3 超聲溫度對大蒜辣素和多糖提取量的影響由圖3可知，在固定相同提取條件下，隨著超聲溫度的增大，上相、下相中大蒜辣素、多糖的提取量均呈現先上升后下降的趨勢。大蒜辣素和多糖的提取量分別在30 和70 ℃時達到最大。由于大蒜辣素在高溫下不穩定，易分解，提取溫度在30 ℃之后，上相中大蒜辣素提取量顯著降低（P＜0.05）。同時隨著體系溫度過高，硫酸銨的水解程度越大，不利于大蒜辣素和多糖的提取。綜合考慮，選擇超聲溫度30 ℃作為后續提取條件。

圖3 超聲溫度對大蒜辣素和多糖提取量的影響Fig.3 Effects of sonication temperatures on extraction efficiency of allicin and polysaccharides

2.1.4 超聲時間對大蒜辣素和多糖提取量的影響由圖4可知，在固定相同提取條件下，隨著超聲時間的增大，上相、下相中大蒜辣素、多糖的提取量均呈現先上升后下降的趨勢。大蒜辣素和多糖的提取量分別在40 和70 min 時達到最大。隨著超聲時間的增加，大蒜辣素由于發生分解，而多糖由于長時間處理破壞結構導致提取量顯著降低（P＜0.05）[27]。綜合考慮，選擇超聲時間為40 min 作為后續提取條件。

圖4 超聲時間對大蒜辣素和多糖提取量的影響Fig.4 Effects of sonication times on extraction efficiency of allicin and garlic polysaccharides

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 回歸模型建立與方差分析 選用超聲時間（A）、超聲溫度（B）、聚乙二醇質量分數（C）為自變量，大蒜辣素提取量（Y1）和多糖提取量（Y2）為響應值，進行三因素三水平的實驗設計（表2）。運用Design-Expert 8.0.6 軟件進行擬合分析，結果見表3、表4。

表2 響應面分析設計及結果Table 2 Design and results of response surface analysis

由表3可知：回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），表明回歸方程模擬可靠，不存在失擬因素。大蒜辣素提取量與各因素的擬合方程為：Y1（大蒜辣素提取量）=3.55+0.25A+0.019B-0.018C-0.31AB-0.30AC+0.36BC-0.69A2-0.64B2-0.96C2。R2=0.9897，說明該模型擬合度較好，數學模型穩定，可以對不同提取條件下大蒜辣素提取量結果進行預測。對各因素的P值和F值進行綜合分析，A、AB、AC、BC、A2、B2和C2對大蒜辣素提取量的影響極具顯著性。影響主次因素為超聲時間（A）＞超聲溫度（B）＞聚乙二醇質量分數（C）。各交互因素中對大蒜辣素提取量影響程度最大的為BC，影響程度最小的為AC。

表3 大蒜辣素提取量回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model for allicin extraction

由表4可知：回歸模型顯著（P＜0.05），失擬項不顯著（P＞0.05），表明回歸方程模擬可靠，不存在失擬因素。多糖提取量與各因素的擬合方程為：Y2（多糖提取量）=40.20+4.66A+2.39B-0.53C+2.64AB-0.26AC-0.17BC-4.16A2-1.11B2-0.87C2。R2= 0.8653，說明該模型擬合度良好，數學模型穩定，可以對不同提取條件下多糖提取量結果進行預測。對各因素的P值和F值進行綜合分析，A 和A2對多糖提取量的影響極具顯著性，B 的影響顯著。而各因素交互作用AB、AC、BC 的影響均不具有顯著性（P＞0.05）。影響主次因素為超聲時間（A）＞超聲溫度（B）＞聚乙二醇質量分數（C）。

表4 多糖提取量回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model for polysaccharide extraction

2.2.2 響應曲面圖分析 根據多元回歸方程獲得不同處理因素影響大蒜辣素提取量的等高線圖（圖5）。等高線密集，形狀趨于橢圓且對應的響應曲面走勢陡峭，表明交互作用的響應值的影響顯著。由此可知，超聲時間與超聲溫度、超聲時間與聚乙二醇質量分數和超聲溫度與聚乙二醇質量分數對大蒜辣素提取量的交互作用對響應值的影響顯著，這與方差分析結果一致。

圖5 不同處理因素交互作用對大蒜辣素提取量的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour plots showing the interactive effects on extraction efficiency of allicin

2.2.3 驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析優化，預測在穩定狀態下從大蒜中提取大蒜辣素、多糖最佳工藝條件為：PEG 質量分數為23.7%，超聲溫度為34.7 ℃，超聲時間為51.2 min。此條件下大蒜辣素、多糖的提取量理論上可達3.489、42.132 mg/g。結合實際情況，將上述工藝條件修正為：PEG 質量分數為24%，超聲溫度為34 ℃，超聲時間為50 min。并以此條件進行3次平行實驗，大蒜辣素、多糖提取量分別為3.564 mg/g（RSD=0.38%）、43.86 mg/g（RSD=0.57%），實驗結果與預測值十分接近，表明該模型有效可行，適用于大蒜辣素、多糖的同步提取。這與前期從大蒜中單獨提取大蒜辣素或多糖工藝研究[9,18,23]相比，TPP 法同步提取大大提高了提取效率，更能充分利用大蒜資源，具有極大的應用優勢。

2.3 大蒜辣素提取液穩定性試驗結果

由表5可知，大蒜辣素溶液在室溫放置下隨時間的延長而提取量降低，大蒜辣素溶液在4 h 內較為穩定，無顯著性差異（P＞0.05），在4 h 后顯著降低（P＜0.05）。因此，用此種方法提取后需要在4 h 內對大蒜辣素進行測定或冷凍干燥處理保存。

表5 大蒜辣素提取液穩定性試驗Table 5 Stability test of allicin capsaicin extract

3 結論

本研究采用響應面法優化三相分配體系同步提取大蒜中大蒜辣素和多糖，獲得的最佳提取工藝條件為：聚乙二醇質量分數24%，超聲溫度34 ℃，超聲時間50 min，此條件下按干燥品計算大蒜辣素和多糖的提取量可達3.564、43.86 mg/g。三相分配體系與其他提取方法相比具有明顯的優勢，提取條件溫和，操作簡便高效，不僅極大地保護了大蒜辣素的生物活性，又將多糖與蛋白質分開，獲得較高純度的多糖提取液，具有經濟和綠色雙重效應，實驗得到的最佳提取參數穩定可行，為后續進一步從大蒜中快速、廉價的提取、回收活性成分提供一定的指導作用。此外，還可將三相分配體系與酶輔助、高壓均質預處理、微波輔助等輔助工藝相結合，提高TPP 法的效率，發展更方便、快捷的三相分配體系。三相分配法在大蒜活性成分提取這一領域的應用有待于更加深入的研究。