基于氣相色譜質譜法測定茶葉中噠螨靈等9 種農藥殘留量的測量不確定度評定

李 俊，蔡 滔，代虹鏡，蘇美丞，祝 愿，王 震,

（1.貴州省農產品質量安全監督檢驗測試中心，農業部農產品質量安全風險評估實驗室，貴州貴陽 550004；2.黔南民族師范學院化學化工學院，貴州都勻 558000）

茶葉是我國重要的農產品之一，具有幾千年的生產歷史。茶葉生產和銷售拉動了內需消費，促進了經濟的可持續發展[1]。農藥在茶樹生產中具有防治病蟲害、提升產量和改善產品品質等重要作用[2-5]，同時茶葉中農藥殘留問題成為茶葉質量安全關注的焦點之一[6]。為了保證茶葉質量安全，靈敏、準確的農藥殘留檢測技術必不可少[7-8]。2021 年9 月實施的《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》[9]規定了茶葉中農藥最大殘留限量有106 項限量要求，存在一個農藥規定了幾種檢測方法的現象，比如噠螨靈、氯菊酯、氯唑磷等農藥可采用GB/T 23200.113 或GB/T 23204-2008 方法檢測。

在檢驗檢測工作中，取樣的代表性、溶液的配制以及樣品處理過程等方面，都會導致檢測結果產生一定的不確定性，對檢測結果不能肯定的程度即為不確定度。不同方法引入的不確定度因方法差異而不同，為保證檢測結果的準確度和可信性，有必要采用適當的檢測方法，并對其測量不確定度進行合理評定[10-12]。測量不確定度是與測量結果相聯系的參數，代表檢測值的可信區間，是衡量實驗室檢測質量的重要指標，是實驗室提高檢驗結果可靠性的重要保障[13-16]；當不確定度越小，檢測結果可信度越高；反之越低。通過不確定度來源分析和分量評定，掌握影響檢測質量的關鍵步驟，從而可提高檢測實驗室的數據質量[17-21]。

本研究分別采用國家標準《茶葉中519 種農藥及相關化學品殘留量的測定 氣相色譜-質譜法》[22]和《植物源性食品中208 種農藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質譜聯用法》[23]方法定量檢測茶葉中噠螨靈等9 種農藥殘留量，依據《測量不確定度評定與表示》[24]和《化學分析測量不確定度評定》[25]，分析評定兩個不同檢測方法檢測過程中各不確定度分量的來源，給出擴展不確定度，以期為農藥殘留檢測實驗室評定不確定度提供參考范例，為實驗室選擇更適應的檢測方法，為檢測結果的合理判定提供科學依據[26-27]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈、甲苯 色譜純，美國天地；氯化鈉、正己烷、乙酸乙酯 分析純，國藥集團；PSA 吸附劑、C18 吸附劑、GCB 粉末 色譜純，美國安捷倫；固相萃取柱Cleanert TPT 10 mL 2.0 g Agela 公司；9 種農藥標準品：噠螨靈（pyridaben）、氟氯氰菊酯（Cyfluthrin）、甲拌磷（phorate）、甲基對硫磷（parathionmethy）、氯菊酯（Permethrin）、氯氰菊酯（Cypermethrin）、氯唑磷（isazofos）、氰戊菊酯（fenvalerate）、水胺硫磷（isocarbophos） 濃度均為1000 mg/L，農業部環境質量安全監督檢驗測試中心（天津）。

GC-MS/MS 聯用儀Trace GC Ultra-TSQ MS/MS美國賽黙飛世爾公司；IKA T18 高速勻漿機 德國IKA 公司；IKA VRTEX2 渦旋混合器 德國IKA公司；BUCHI R-200 旋轉蒸發儀 瑞士BUCHI 實驗儀器公司；Organomation N-EVAP 美國OI 分析儀器公司；TSL-5-A 離心機 上海安亭科學儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準品的配制

1.2.1.1 單標標準儲備液的配制 準確吸取9 種農藥標準和內標溶液各1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，用丙酮溶液稀釋到刻度，得到100.0 mg /L 標準單標儲備液。

1.2.1.2 混合標準儲備液的配制 準確吸取適量的100.0 mg/L 單標儲備液于50 mL 容量瓶中，用丙酮稀釋配制成2～4 mg/L 混合標準儲備液。內標物配制為10 mg/L 的標準儲備液。

1.2.1.3 基質匹配混合標準工作溶液配制 取不含待測物的茶葉樣品，按相應的前處理方法制得空白基質溶液，準確吸取適量的混合標準儲備液和1 mL 內標于10 mL 容量瓶中，用空白基質溶液定容配制成所需的標準工作液。混合標準工作溶液系列配制見表1。

表1 混合標準系列溶液Table 1 Preparation of mixed standard series solution

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 方法選擇 分別參照方法1：GB 23200.113-2018《食品安全國家標準 植物源性食品中208 種農藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質譜聯用法》QuEChERS 部分；方法2：GB/T 23204-2008 《茶葉中519 種農藥及相關化學品殘留量的測定氣相色譜-質譜法》進行樣品前處理。供試茶樣購置于市場，茶葉樣品粉碎后過60 目篩，待分析。

1.2.2.2 樣品提取 方法1：準確稱取2 g 試樣（精確至0.01 g）于50 mL 塑料離心管中，加10 mL 水渦旋均勻，靜置30 min。加入15 mL 乙腈-醋酸溶液、6 g無水硫酸鎂、1.5 g 醋酸鈉及1 顆陶瓷均質子，劇烈振蕩提取1 min，4200 r/min 離心5 min，吸取8 mL上清液，待凈化。

方法2 ：準確稱取5 g 試樣（精確至0.01 g），于80 mL 離心管中，加入15 mL 乙腈，15000 r/min 均質提取1 min，4200 r/min 離心5 min，取上清液于200 mL雞心瓶中。殘渣用15 mL 乙腈重復提取一次，離心，合并二次提取液，40 ℃水浴旋轉蒸發至1 mL 左右，待凈化。

1.2.2.3 樣品凈化 方法1：吸取8 mL 上清液加到內含1200 mg 硫酸鎂、400 mg PSA，400 mg C18及200 mg GCB 的15 mL 塑料離心管中，渦旋混勻1 min。4200 r/min 離心5 min，準確吸取2 mL 上清液于10 mL 試管中，40 ℃水浴中氮氣吹至近干。加入100 μL的內標溶液，加入1 mL 乙酸乙酯復溶，過微孔濾膜，待氣相色譜質譜測定。

方法2：用10 mL 的v（乙腈）:v（甲苯）=3:1 混合洗液預洗Cleanert TPT 固相萃取柱（柱中加入約2 cm高無水硫酸鈉），加入待凈化樣品濃縮液轉移至固相萃取柱中，用2 mL 混合洗液洗滌樣液瓶，重復三次，并將洗滌液移人柱中，再用25 mL 乙腈-甲苯洗滌小柱，收集上述所有流出液于雞心瓶中，40 ℃水浴中旋轉濃縮至約0.5 mL。加入5 mL 正己烷進行溶劑交換，重復兩次，最后使樣液體積約為1 mL，加入100 μL 內標溶液，過微孔濾膜，待氣相色譜質譜測定。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 氣相色譜條件 方法1：色譜柱：DB-1701MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫條件為；程序升溫：初溫40 ℃，以40 ℃/min 升溫至120 ℃，再以5 ℃/min 升溫至240 ℃，再以12 ℃/min 升溫至300 ℃，保持6 min；載氣為He，流速1.0 mL/min；進樣口溫度（280.0 ℃）；進樣量1.0 μL；不分流進樣。方法2：色譜柱：DB-1701MS 石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫條件為；程序升溫：初溫40 ℃，以30 ℃/min 升溫至130 ℃，再以5 ℃/min 升溫至250 ℃，再以10 ℃/min 升溫至300 ℃，保持5 min；載氣為He，流速1.0 mL/min；進樣口溫度（290.0 ℃）；進樣量1.0 μL；不分流進樣。

1.2.3.2 質譜條件 方法1：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；氣相色譜-質譜傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度280 ℃；多反應監測（MRM）模式掃描，碰撞反應氣壓力（Ar，2×10-4kPa）；溶劑延遲3 min。

方法2：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；氣相色譜-質譜傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；選擇性離子監測（SIM）模式掃描；溶劑延遲5 min。

1.3 不確定度分析

1.3.1 數學模型的建立 根據GB/T 23200.113-2018和GB/T 23204-2008 方法（表2），茶葉中被測農藥殘留含量（w）按式（1）計算：

表2 GB/T 23200.113-2018 與GB/T 23204-2008 標準比較Table 2 Comparison Table of GB/T 23200.113-2018 and GB/T 23204-2008 standards

式中：w：茶葉中被測農藥殘留含量（mg/kg）；c：由標準曲線計算出測試樣液的濃度（mg/L）；v：樣液定容體積（mL）；m：樣品稱樣量（g）；f：稀釋因子（GB/T 23200.113-2018 為 7.5、GB/T 23204-2008為1.0）。

1.3.2 不確定度來源分析 按規范方法抽樣和制備樣品樣品均勻性引入的不確定度忽略不計[26]。從數學模型和測定過程可知，不確定度分量包括以下幾個方面：標準物質及其配制過程中引入的不確定度cs；內標物質使用引入的不確定度csi；樣品稱量引入的不確定度m；前處理過程中液體體積量取引入的不確定度v；標準工作液測量不確定度（Rrec）；樣品溶液液中被測組分與內標峰面積比（Ai/Asi）；檢測回收率（Qrec）等方面；不確定度分量來源見圖1。

圖1 測量不確定度分量魚骨圖Fig.1 Fishbone diagram of measurement uncertainty component

1.4 數據處理

通過Excel2010 與SPSS22.0 進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 標準溶液配制引入不確定度urel（c）

實驗室通常選擇購買100 或1000 mg/L 的有證標準物質。通過配制成農藥單標儲備液、混合標準儲備液、混合標準工作溶液、混合標準工作測試液。每一步都會有不確定度的帶入，分析不確定帶入因子詳見表3。

表3 標準溶液配制引入不確定度Table 3 Introduction uncertainty of standard solution configuration

2.1.1 標準物質純度引入不確定度urel（c1） 本研究中噠螨靈、氟氯氰菊酯、甲拌磷等9 個標準品的質量濃度均為1000 mg/L，其擴展不確定度[u95（c1）]為7 mg/L，包含因子（k）為2，則由標準品純度引入的相對不確定度urel（cs-1）為：

某品牌標準品生產廠家生產標準品質量濃度均為1000 mg/L 時，其擴展不確定度[u95（c1）]為20 mg/L，其引入的相對不確定度urel（c1）為1.41%。

2.1.2 標準儲備液配制引入不確定度urel（c2） 實驗室儲備液的配制包括單一標準儲備液和混合標準儲備液。先用1 mL A 級吸量管移取1.0 mL 1000 mg/L的標準溶液于10 mL 容量瓶中，用丙酮定容并配成100 mg/L 的單一標準儲備液。然后再分別吸取1 mL單一標準儲備液于50 mL 容量瓶中，用丙酮定容并配成2 mg/L 的混合標準儲備溶液。過程中涉及溫度變化對試劑膨脹的影響、人員量取誤差及吸量管、容量瓶引入的不確定度。

丙酮膨脹引入分量，實驗室溫度通常為（20±5）℃，丙酮的膨脹系數為0.00143 ℃-1，由溫度效應產生的丙酮體積變化為：u（v丙酮）=±（0.00143 mL×5×v）=±0.00715×v mL，服從矩形分布，則溫度對丙酮體積變化的不確定度[urel（v丙酮）]為：

利用式（3）計算出標準儲備液配制中，丙酮膨脹引入的不確定度[urel（v丙酮）]，為0.41%，引入4次。

人員吸量管使用量取誤差引入分量，采用統計方法評定不確定度，通過在重現性、重復性條件下使用同一吸量管，重復量取純水，利用電子天平測量，得到n=9次測量值（x），標準偏差s（x）利用貝塞爾式（4）計算，不確定度urel（x）按式（5）計算。

利用式（5）計算出標準儲備液配制中，使用1 mL的A 級吸量管移取1.0 mL 樣液時引入的人員測量不確定度[urel（s1）]，為0.13%，對于每一個組分引入2次。

量具允許誤差引入分量：A 級1 mL 吸量管允許誤差為±0.008 mL[27]，滿足三角形分布，則由吸量管量取1.0 mL 溶液引入的不確定度[urel（v1）]為:

利用式（6）計算出標準儲備液配制中，使用1 mL的A 級吸量管移取1.0 mL 樣液引入的不確定度[urel（v1）]，為0.33%，對于每一個組分引入2次。

A 級10、50 mL 容量瓶的允許誤差分別為±0.02 和±0.05 mL，讀數重復性偏差分別為±0.01和±0.025 mL，均服從三角形分布。利用（6）式計算，則由10 mL 容量瓶允許誤差帶來的不確定度[urel（v2）]為0.082 %和讀數誤差帶來的不確定度[urel（v3）]為0.041%；由25 mL 容量瓶允許誤差帶來的不確定度[urel（v4）]為0.041%和讀數誤差帶來的不確定度[urel（v5）]為0.020 %。

利用式（7）計算可得由標準儲備液配制帶來的不確定度[urel（c2）]為0.97%。

2.1.3 混合標準工作液配制引入不確定度urel（c3）

混合標準工作液是通過使用混合標準儲配液稀釋，本實驗中的混合標準工作液按表1 中濃度配制，分別吸取混合標準儲備液于10 mL 容量瓶內，加入1 mL內標溶液，丙酮定容得到所需標準工作液。過程中涉及溫度變化對試劑膨脹的影響、人員量取誤差及吸量管、容量瓶引入的不確定度。標液和樣液中內標物是采用同一瓶內標物質添加，故不考慮內標物質在配制過程中的不確定度的引入，僅考慮內標物添加時，體積引入的那部分不確定度。

丙酮膨脹引入分量，利用式（3）計算出標準工作溶液配制中，丙酮膨脹引入引入的不確定度[urel（v丙酮）]為0.41%，對每一個濃度點引入3次（標液量取、內標量取、容量瓶定容）。

人員吸量管使用量取誤差引入分量，利用式（5）計算出標準工作溶液配制中，使用1 mL 的A 級吸量管移取0.5 mL 混合儲備液配制濃度點1 時引入的人員測量不確定度[urel（s1）]為0.14%。濃度點2時引入的人員測量不確定度[urel（s2）]為0.13%。濃度點3 時引入的人員測量不確定度[urel（s3）]為0.26%。濃度點4 時引入的人員測量不確定度[urel（s4）]為0.59%。濃度點5 時引入的人員測量不確定度[urel（s5）]為0.50%。濃度點6 時引入的人員測量不確定度[urel（s6）]為0.49%。濃度點7 時引入的人員測量不確定度[urel（s7）]為0.76%。使用1 mL 的A 級吸量管移取1.0 mL 內標溶液時引入的人員測量不確定度[urel（si）]為0.13%。

量具允許誤差引入分量，A 級1、2、5、10 mL 吸量管，A 級10 mL 容量瓶允許誤差與讀數重復性偏差引入不確定度。

A 級1、2、5、10 mL 吸量管，A 級10 mL 容量瓶的允許誤差分別為±0.008、±0.012、±0.025、±0.050、±0.02、讀數重復性偏差分別為±0.004、±0.006、±0.01、±0.025、±0.01mL。利用式（6）計算，濃度點1 使用A 級1 mL 吸量管吸取0.5 mL 混合標液和1 mL 內標物，引入的不確定度[urel（v1）]：

A 級1 mL 吸量管允許誤差帶來的不確定度[[urel（v1-1）]為0.653%和讀數誤差帶來的不確定度[urel（v1-2）]為0.327%；10 mL 容量瓶帶來的不確定度[[urel（v1-3）]為0.082%和讀數誤差帶來的不確定度[urel（v1-4）]為0.041%；內標物對每個濃度點不確定度均為A 級1 mLA 級1 mL 吸量管允許誤差帶來的不確定度[[urel（v1-5）]為0.327%和讀數誤差帶來的不確定度[urel（v1-6）]為0.163%。按式（8）計算，濃度點1 引入的不確定度[urel（v1）]為0.822%。

利用式（8），計算其他濃度點不確定度[urel（v2）]為0.525、[urel（v3）]為0.466%、[urel（v4）]為0.525%、[urel（v5）]為0.450%、[urel（v6）]為0.436%、[urel（v7）]為0.473%。

混合標準工作液每個濃度點引入不確定度[urel（c3-x）]，利用式（9）計算出混合標準工作溶液濃度點1[urel（c3-1）]不確定度為1.15%。

利用式（9），計算其他濃度點不確定度[urel（c3-2）]為0.902%，[urel（c3-3）]為0.898%，[urel（c3-4）]為1.07%，[urel（c3-5）]為0.987%，[urel（c3-6）]為0.975%。

利用式（10），計算可得由混合標準工作液配制帶來的不確定度[urel（c3）]為2.21%。

綜上，在標準品配制中，單標儲備液、混合標準儲備液、混合標準工作液配制引起的合成不確定度[urel（c）]為：

利用式（11），計算可得標準溶液配制步驟帶來的不確定度[urel（c）]為2.46 %。

2.2 樣品前處理引入不確定度urel（P）

2.2.1 樣品質量稱取引入的相對標準不確定度urel（m）

由天平允許誤差不確定度urel（m1）、天平示值誤差不確定度urel（m2）、稱量重復性不確定度urel（m3）引入。

方法1，采用百分之一天平稱取2 g 樣品，天平的允許誤差為0.01g、示值誤差為0.005 g，符合矩形分布，則天平允許誤差不確定度urel（m1）、天平示值誤差不確定度urel（m2）分別為：

稱樣重復性（n=9）,用標準偏差S（x）利用貝塞爾公式（4）計算，不確定度urel（m3）按公式（5）計算為1.07%。

利用式（14），計算可得方法1 由稱樣帶來的不確定度[urel（m）]為1.16 %，方法2 由稱樣帶來的不確定度[urel（m）]為1.10%。

2.2.2 樣品提取引入的相對標準不確定度urel（v1）

樣品在提取、分取步驟過程中，方法1 僅考慮樣品提取引入的相對標準不確定度urel（v1），由乙腈膨脹引入不確定度urel（v1-1）、吸量管引入不確定度urel（v1-2）、量取重復性引入不確定度urel（v1-3），吸取8 mL 上清液待凈化，體積不直接帶入不確定度，故不考慮不確定度引入。方法2 中提取液全部轉入雞心瓶40 ℃水浴旋轉蒸發至1 mL 左右，待凈化，無分取步驟，不考慮該步驟的不確定度引入。但無水硫酸鎂、醋酸鈉等試劑的多少、提取時間、均值轉速等因素帶入的不確定度均體現在樣品的加標回收上，在后文回收率分量進行評定。

提取步驟是用A 級25 mL 吸量管量取15 mL乙腈試劑。乙腈膨脹引入分量，實驗室溫度通常為（20±5）℃，乙腈的膨脹系數為0.00137 ℃-1，由溫度變化引起試劑膨脹帶來的不確定度服從矩形分布，不確定度[urel(v1-1）]為0.395。A 級25 mL 吸量管最大允許誤差±0.1 mL，讀數重復性偏差為±0.05 mL，量器量取偏差服從三角形分布，故25 mL 吸量管量取15 mL 乙腈，允許誤差和讀數重復性引起的不確定度分別為[urel（v1-2）]為0.272%、[urel（v1-3）]為0.136%。

利用式（15），計算可得方法1 由提取步驟帶來的不確定度[urel（v1）]為0.499%。

2.2.3 樣品凈化、定容引入的相對標準不確定度urel（v2） 樣品凈化、定容步驟過程中，兩個方法的凈化過程，方法1 中各填料的稱取量、振動的頻率和時間、離心的轉速和時間、樣品定容等均不直接帶入不確定度，僅與量取2 mL 凈化后樣液和內標溶液的量取引入的相對標準不確定度[urel（v2）]；方法2 中洗液的量取、洗脫的速度、樣品定容等均不直接帶入不確定度，僅與內標溶液的量取有關；

凈化步驟，方法1 用A 級2 mL 吸量管分取2 mL凈化后樣液，再用100 μL 單通道移液器量取100 μL內標，約用1 mL 乙酸乙酯復溶，待測。

乙腈試劑膨脹引起的相對不確定度[urel（v2-1）]為0.395%，A 級2 mL 吸量管最大誤差為±0.012 mL，其相對不確定度[urel（v2-2）]為0.245%，讀數重復性偏差為土0.006 mL，其相對不確定度[urel（v2-3）]為0.122%。

丙酮試劑膨脹引起的相對不確定度[urel（v2-4）]為0.41%，A 型100 μL 單通道移液器最大誤差為±0.8 μL，其相對不確定度[urel（v2-5）]為0.327%。

利用式（16），計算可得方法1 由凈化步驟帶來的不確定度[urel（v2）]為0.711%，方法2 由凈化步驟帶來的不確定度[urel（v2）]為0.327%。

綜上，在樣品前處理中，提取液量取、分取、定容、內標量取引起的合成不確定度[urel（P）]為：

利用式（17），計算可得方法1 由樣品前處理步驟帶來的不確定度[urel（P）]為1.45 %，方法2 由樣品前處理步驟帶來的不確定度[urel（P）]為1.15%。

2.3 標準曲線擬合引入不確定度urel（R）

按1.2.3 配制好混合標準工作溶液，氣質聯用儀檢測，每個濃度點測量5次，標準溶液化合物與內標物濃度比與標準溶液化合物與內標物峰面積比數據見表4。利用SPSS20.0 軟件對表中數據作最小二乘法線性回歸處理。擬合曲線和確定系數見表5。

表4 農藥標準曲線測量結果Table 4 Measurement results of pesticide standard curve

利用式（18）計算出標準擬合曲線標準偏差SA，yi為第i次測量的溶液化合物與內標物峰面積比；a 為截距；b 為斜率；xi為第i次測量的標準溶液化合物與內標物濃度比；n 為標準溶液的測定總次數（n=30）。線性關系及擬合曲線的確定系數見表5。

利用式（19）計算擬合曲線引入的不確定度U（R）。SA為準曲線的標準差；p 為樣品的測定次數（p=10）；n 為標準溶液的測定總次數（n=30）；b 為標準曲線的斜率為由標準曲線求得的樣品溶液濃度平均值（見表5）；為各標準系列溶液濃度的平均值，為0.517 mg/L；xi為第i次測量的標準曲線濃度。

標準曲線擬合引入不確定度為A 類評定，樣液測定濃度在0.17～0.235 mg/L，每個樣品重復10次測定，標準曲線擬合引入不確定度和相對相對不確定度計算結果見表5。由結果可知氯氰菊酯在測定濃度為0.172 mg/L 時，引入測量不確定度為7.93 %，水胺硫磷、氯唑磷、甲基對硫磷引入測量不確定度均大于5.0%。

表5 標準曲線引入的相對標準不確定度Table 5 Relative standard uncertainty introduced by the standard curves

假設1：在同一條件下測定同一樣品n次，考察了測量次數與不確定度的關系，利用測量次數和相對不確定度作圖2。隨著測量次數的增加，樣品測量由標準曲線擬合引入的不確定度降低，樣品測量次數在3～4次時，不確定度的變化不明顯。結果說明，在檢測工作中，測量結果如出現陽性檢出時，樣品需要平行測量3次以上才能得到較可靠的結果。

圖2 樣液測量次數與標準曲線擬合引入相對不確定度的關系Fig.2 Relationship of the relative uncertainty resulting from the measurement times of the sample liquid and the fitting of the standard curve

假設2：在同一條件下測定不同陽性樣品，每個樣品重復10次，考察了測量不同樣液檢出濃度（0.05～1 mg/L）與不確定度的關系，利用測量濃度和相對不確定度作圖3，隨著檢測濃度的增加，標準曲線引入的相對不確定度urel（R）降低，當樣液測定濃度為0.3 mg/L 時，各化合物urel（R）均小于5.0%，但樣液測定濃度為0.05 mg/L 時，由各化合物urel（R）相對較高。并不是樣液測定濃度越高測定結果越可靠，當樣液濃度繼續升高，設備單位檢測靈敏性會下降或者檢測器出現過載，樣液濃度和檢測器信號成下拋弧線，造成測量結果偏低的風險。

圖3 樣液檢出濃度與標準曲線擬合引入相對不確定度的關系Fig.3 Relationship of the relative uncertainty introduced by the detected concentration of the sample solution and the standard curve fitting

結果說明，在測定中，樣液測定濃度在標準曲線平均濃度附近時，檢測結果較可靠，不同濃度的樣品要使用合適的標準曲線定量或者通過樣品稀釋、濃縮等方式讓樣液檢測濃度在合適的范圍內進行測定。

2.4 樣液峰面積測定重復性引入的不確定度urel（A）

方法采用內標法定量，進樣量的體積誤差不會對檢測帶來測量不確定度，主要考慮儀器對各組分的測量穩定性，分析各目標物與內標物峰面積的比值的測量偏差，用來評定儀器測量重復性引入的不確定度的程度。

茶葉樣品經過1.3 步驟處理成樣液后，添加加入一定量農藥成分，制備成模擬陽性檢樣品，上機樣液溶度為0.1～0.3 mg/L 為宜，采用統計方法評定不確定度，通過在重現性、重復性條件下，連續重復測試農藥分面積與內標物分面積比10次，利用貝塞爾式（4）計算出峰面積比標準偏差S（A）、式（5）計算出不確定度urel（A），結果見表6。

表6 樣品溶液峰面積測定重復性引入的不確定度Urel（A） （n=10）Table 6 Uncertainty Urel (A) of repetitive ability (n=10)

結果可知，甲拌磷、氯唑磷等9 個農藥由樣品溶液峰面積測定重復性引入的不確定度為0.5%～2.56%，其中菊酯類農藥引入不確定度較大，氯氰菊酯引入的不確定度達2.56%。分析可知峰面積測定重復性引入的不確定度主要和儀器的穩定性、靈敏度有關，也和農藥的自身性質有關。比如氯唑磷和水胺硫磷這兩個農藥的穩定性不如其他農藥，在檢測分析中容易發生分解，增加了不確定度的引入；再比如氯氰菊酯、氰戊菊酯等菊酯存在異構體，工作站對異構體積分計算峰面積加和時也會引入不確定度；儀器的狀態，如進樣口襯管、色譜柱柱效、離子源污染程度都會引起峰面積的測量不確定度的增加。

2.5 檢測回收率urel（Q）

添加回收率引入不確定度為A 類評定，采用在茶葉中分別加入濃度為方法1（0.10、0.20、0.50 mg/kg），方法2（0.02 、0.05 、0.10 mg/kg）的目標分析物，每個添加水平重復6次。為扣除標準曲線擬合帶入的不確定度，采取使用標準曲線上濃度值較接近點濃度單點定量，計算回收率，結果見表7。

表7 回收率引入的相對標準不確定度Table 7 Relative standard uncertainty introduced in the recovery rate

利用式（21）計算回收率引入的相對不確定度[urel（Q）]，式中n 為回收率獨立樣本個數18，S（Q）為回收率標準偏差為回收率平均值。按式（22）對上述結果進行顯著性檢驗，在95%置信區間，自由度為17 時，t分布臨界值t0.95（17）=2.110，當檢驗值t≥2.110 時，則與回收率有顯著性差異，需要使用回收率修正結果，反之不需要[20]。

2.6 相對不確定度的合成

統計上述各不確定度分量，結果見表8～表9，各農藥的合成相對不確定度urel（X）由各分量相對不確定度按公式（23）計算合成而得，結果見表8。

由表8～表9可知，兩個方法的合成不確定度引入量有差異，其中B 類不確定度分量中，由于前處理不同而引入不同量，A 類不確定度分量中主要是方法的原理不一樣，由于方法中農藥的提取效率，基質影響等因素造成回收率引入不確定度的差異。

表8 B 類評定不確定度的構成Table 8 Composition of class B

表9 A 類評定不確定度的構成和合成相對不確定度Table 9 Composition and synthesis of class A

從整個合成不確定度過程分析來看，各分量合成不確定度貢獻最大的是標準曲線擬合引入不確定度、回收率引入不確定度和標準溶液配制引入；標準溶液配制引入不確定度分量主要為混合標準工作液配制引入引起，標準品的配制過程不容忽視；通過測算，樣液的測量濃度很低時，標準曲線擬合引入貢獻很大；回收率引入不確定度最為重要，它也是我們在日常檢測工作的質控手段之一，通過它的值來評價方法的準確度，回收率的好壞受方法原理、農藥性質、人員操作、試劑耗材等多方面的影響。農藥殘留檢測值即使不折算回收率，其對檢測結果的準確度也存在影響，原因是回收率折算的是平均殘留值，但其對檢測結果的偏差無法被忽略[19]。

2.7 不確定度的表示

根據測量不確定度評定指南要求，在95%置信水平時，取子k=2，在0.15 mg/kg 添加水平下，每個水平重復6次，當回收率在滿足方法要求時，各農藥在茶葉樣品中的擴展不確定度[28]，見表10。

表10 茶葉中9 種農藥殘留的檢測結果不確定度Table 10 Uncertainty of 9 pesticide residues in tea leaves

2.8 實際樣品分析中不確定度評定

在實際樣品檢測中，對于農藥殘留值為最大允許殘留值附近時，測量不確定的正確引入可決定該樣品是否超標，這對實驗室和企業都非常重要。在分析檢測中，方法GB/T 23204-2008 和方法GB/T 23200.113-2018 都為茶葉中農藥殘留檢測的推薦方法，方法的選擇可能會影響檢測結論。GB/T 23200.113-2018 由于具有簡單、快速、高效且成本低的特點，廣泛被作為實驗室的第一方法來使用，由表11可知，由于方法的稀釋倍數為7.5，甲拌磷、氯唑磷、甲基對硫磷、氰戊菊酯5 個農藥，如果檢出濃度為MRLs時，樣液的理論檢測濃度在0.027 mg/L 以下，最低至0.0027 mg/L，在實際檢測分析中，由于儀器靈敏度和回收率的影響，樣品檢測結果的不確定度很大，對檢測結果的判定存在很大的風險，建議這5 個藥使用GB/T 23204-2008 檢測分析。

表11 方法GB/T23204 和方法GB/T 23200.113-2018 比較Table 11 Comparison of method GB/T23204 and the method GB/T 23200.113-2018

噠螨靈、氯菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯在GB 2763-2021 食品中農藥最大殘留限量上的允許最大殘留較高，分別為5、20、20、1 mg/kg。較高濃度的樣液進入儀器后會造成色譜柱的過載、檢測器過載，產生測量誤差，建議使用GB/T 23200.113-2018 方法，同時采用增加乙酸乙酯的復溶體積和內標物的添加量，控制內標物濃度和標液中內標物濃度基本一致為宜。

3 討論

通過氣相色譜質譜聯用法，采用不同方法分析評估茶葉中噠螨靈等9 種農藥殘留含量測定過程中的不確定度，實驗過程中對標準物質的配制、樣品稱量、樣品提取、凈化、測量等過程會引入不確定度進行分析，分析評定合成不確定度過程，可知不確定度貢獻主要來自標準曲線擬合、樣品添加回收率和標準溶液配制，對實驗結果的影響較大，其次是樣品測量重復性，在極低測量濃度時，影響最為明顯。

在分析檢測中，方法GB/T 23204-2008 和方法GB/T 23200.113-2018 都為茶葉中噠螨靈等9 種農藥殘留檢測的推薦方法，方法的選擇可能會影響檢測結論。建議甲拌磷、氯唑磷、甲基對硫磷、氰戊菊酯5 個農藥，使用GB/T 23204-2008 檢測分析；噠螨靈、氯菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊4 個農藥，使用GB/T 23200.1134-2018 檢測分析。可通過方法優化，調節合適的檢測濃度，如：茶葉中氰戊菊酯和氯唑磷在MRLs 值檢出時，可適當增加樣品稱樣量或減少定容液體積；氯菊酯和氯氰菊酯在MRLs 值檢出時，可增加提取液的體積和增加定容液體積。

標準曲線擬合引入的不確定度大小與樣品測量次數呈相關性，隨著測量次數的增加，樣品測量由標準曲線擬合引入的不確定度降低，樣品測量次數在3～4次時，不確定度的變化不明顯。結果說明，檢測工作中，測量結果如出現陽性檢出時，樣品需要復測3次以上計算平均值才能得到較可靠的結果。測定中，樣液測定濃度在標準曲線平均濃度附近時，檢測結果較可靠，不同濃度的樣品要使用合適的標準曲線定量或者通過樣品稀釋、濃縮等方式讓樣液檢測濃度在合適的范圍內進行測定。結果表明，選擇合適的校準曲線和增加樣品的測量次數，可以降低標準曲線擬合引入的不確定度影響。

回收率引入不確定度最為重要，它也是我們在日常檢測工作的質控手段之一，通過它的值能夠評價方法的準確度。回收率的好壞受方法原理、農藥性質、樣品基質、人員操作、試劑耗材等多因素干擾，造成測量結果不確定度數值增大。

4 結論

在采用氣相色譜質譜法測定茶葉中的農藥殘留量時，需要選擇合適的前處理方法，保障實驗室溫濕度環境條件，提高實驗人員的操作水平，使用滿足實驗需要的量具精度，試劑耗材的純度，做好儀器調試準備工作，以滿足檢驗檢測的需求。樣品前處理中應嚴格控制的各個步驟，操作精確，減少樣品稱樣量、提取液體積、定容溶液體積等引入的不確定度。使用合適的標準曲線濃度點范圍，在定量軟件中調整標準曲線濃度點的權重，獲得更好的擬合結果，提高在MRL 值附近的測量準確度。測量結果如出現陽性檢出時，樣品需要復測3次以上計算平均值才能得到較可靠的結果，從而降低測定結果的不確定度，確保檢測結果的置信度。