椴樹蜂蜜多糖和多花種蜂蜜多糖加工特性的比較

吳海濤，張藝瑋

（1.黑龍江八一農墾大學理學院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319）

多糖作為天然食品添加劑是安全的，被認為是改善產品品質的重要物質，此外，多糖化具有提升食品的營養價值，廣泛應用于醫學、食品等多個行業，對多糖加工特性的探究為其應用提供理論基礎。近年來，蜂蜜多糖被人們漸漸關注。蜂蜜多糖是存在于蜂蜜中罕見的微量物質，又稱作蜂蜜糊精，是蜂蜜的膠體成分，來源為花蜜和脂質[1]。有研究表明，蜂蜜含有低分子量多糖，可以抵抗宿主酶的降解，因此可作為腸道微生物菌群的營養來源[2-3]。總之，蜂蜜作為一種獨特的天然產物具有重要的研究價值。

蜂蜜多糖種類隨蜜源的不同而具備不同的特性。1965 年，Siddiqui 等[4]已對一些蜂蜜樣品中多糖成分含量進行了檢測，多糖組成中均含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和木糖，其中個別蜂蜜多糖中存在鼠李糖和微量的糖醛酸。Tonks 等[5]按分子大小對麥盧卡蜂蜜進行分餾，結果表明30 kDa 離心過濾器保留的物質中存在多糖，并且與大多數免疫細胞因子刺激活性相關，但是沒有進一步對其成分進行研究。Megherbi 等[6]對金合歡、山地多花和多花種蜂蜜進行了指紋圖檢測，發現痕量的多糖。王彤[7]采用水溶醇沉法得到多糖沉淀，通過脫蛋白、透析和冷凍干燥得到產率均在0.04%左右的10 種蜂蜜多糖，利用毛細管電泳-紫外檢測方法測定單糖組成和含量，結果表明10 種蜂蜜多糖均含不同比例的果糖和葡萄糖，天然多花種蜂蜜多糖和棗花蜂蜜多糖含鼠李糖，天然棗花蜂蜜多糖和蕎面花蜂蜜多糖含阿拉伯糖。關于多糖的熱力學研究是其生物應用的一個重要內容，多糖的熱穩定性可確定其在工業生產中質量的變化。流變特性是多糖作為增稠和穩定劑的必需研究指標，主要受溫度、pH 及多糖濃度的影響，如角叉菜聚糖和卡拉膠在一定溫度范圍內的抗粘度能力使其成為食品或化妝品添加劑的理想備選材料[1]。對水和脂肪的結合能力是食品配方和加工中最實用的功能特性，多糖通過水和油的相互作用與食品的質地直接相關[8]，具有高持油性（oil holding capacity，OHC）的多糖能使高脂肪食品和乳液更加穩定。多糖的晶體特性與其物理、化學性能有直接的關系[9]。膠凝性質的探究為其在食品工業中膠凝劑和增稠劑的原料應用提供理論依據[10]；黑孜然種子多糖發泡性的探究為其用于食品配方中的發泡劑提供數據支撐[11]。綜上，加工特性的探究是研究多糖特性的重要內容。然而，蜂蜜多糖作為一種新型多糖，其加工特性鮮有研究。亟需關于蜂蜜多糖的熱力學、流變學方面的研究，從而促進蜂蜜多糖的開發利用。

蜂蜜多糖作為珍貴的功能性物質，其成分的探究及開發具有一定的研究價值。為了開發有價值的蜂蜜多糖，本實驗選擇椴樹蜂蜜、多花種蜂蜜作為原材料進行蜂蜜多糖的制備及特性研究。采用熱重和差示掃描量熱分析進行熱力學測試，采用靜態和動態流變測試進行流變特性分析，測定蜂蜜多糖的持水性及持油性；以期為椴樹蜂蜜、多花種蜂蜜在保健產品中的利用提供科學依據，促進新型多糖的開發及利用，并且推動蜂蜜整個產業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

椴樹蜂蜜、多花種蜂蜜 購自黑龍江省哈爾濱市超市（天然原料蜜，保存在4 ℃）；其他試劑 均為國產分析純。

HH-4J 數顯恒溫攪拌水浴鍋 上海霓玥儀器有限公司；TDL-40B 高速大容量離心機 華威科創科技有限公司；Pilot10-15M 冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；SDT 650 同步熱分析儀、Discover-HR-1 旋轉流變儀 美國TA 公司；RE-2000A 旋轉蒸發儀 河南益源儀器有限公司；D8 ADVANCE 采用X-射線衍射儀 德國Bruker。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜂蜜多糖的制備 采用水溶醇沉法提取蜂蜜多糖[4,12]。100 g 蜂蜜加200 mL 蒸餾水于燒杯中，60 ℃溶解2 h，室溫下加3 倍體積95%的乙醇提取14 h。離心（6000×g，10 min）收集沉淀物，然后將沉淀物溶解在水中。采用Sevag 法去除蛋白，采用過氧化氫法脫色。使用旋轉蒸發儀進行濃縮。選擇分子截留量為8～14 kDa 的透析袋透析48 h，每6 h 換水。收集透析液，離心，凍干得到蜂蜜多糖。多糖含量通過苯酚-硫酸法測定[13]，以葡萄糖標準品為參照，標準曲線方程為Y=6.99X+0.00733（R2=0.99656），其中X 為葡萄糖質量濃度（mg/mL），Y 為吸光值。根據標準曲線計算蜂蜜多糖中粗多糖含量。

1.2.2 X-射線衍射測定 采用X-射線衍射儀進行蜂蜜多糖晶體結構的分析。室溫（20 °C）下，取微量樣品（2 mg），衍射角度2θ=5°～60°，步長為0.1°，掃描速度為每0.1 s/步。

1.2.3 熱力學特性分析 蜂蜜多糖的熱力學特性采用熱重-差熱同步熱分析儀進行分析，在升溫、恒溫或降溫過程中，觀察樣品的質量隨溫度或時間的變化。將10 mg 樣品放入鉑坩堝中，使用空鋁盤作為參考，在氮氣保護下以10 ℃/min 的速率從25 ℃升溫到700 ℃，得到熱重（TG）和導數熱重（DTG）；將儀器從室溫加熱到400 ℃進行DSC 分析測定，升溫速率同上。

1.2.4 流變特性測定 取5 mg/mL 的蜂蜜多糖溶液，水浴（60 ℃）攪拌2 h 后，密封，靜置過夜。使用旋轉流變儀測定蜂蜜多糖溶液的流變特性。

選用Steady-State flow 模式，測試溫度為25 ℃，測定多糖溶液在剪切速率為0.1～100 s-1條件下的表觀粘度和應力。

選用Oscillation-Frequency 模式，測試溫度為25 ℃，掃描頻率為0.1～100 Hz，振蕩應變固定為2%，研究多糖隨振動頻率變化的粘彈性質，得到儲能模量、損耗模量及相位角tanδ。

流變儀設定溫度掃描范圍為20～90 ℃，升溫速率為2 ℃/min，頻率固定為1 Hz（6.28 rad/s），記錄溫度對多糖流變特性的影響。

1.2.5 持水性與持油性測定 蜂蜜多糖的持水量（Water holding capacity，WHC）和持油量（Oil holding capacity，OHC）根據Yuan 等報道的方法稍作改動進行測定[14]。

持水量的測定：將50 mg 蜂蜜多糖（精確到0.001 g）放入離心管中，稱重，分散到5 mL 蒸餾水中。在室溫下混勻，每15 min 振搖5 s，1 h 后將其離心（4000×g，20 min），除去上層水分，游離水的質量為m。WHC 表示為每克多糖所含的水克數，計算公式如下：

持油量的測定：將50 mg 蜂蜜多糖（精確到0.001 g）放入離心管中，稱重，然后加入5 mL 大豆油。在室溫下孵育60 min，每15 min 將懸浮液渦旋混合5 s。1 h 后將其離心（4000×g，20 min），除去上層相，將與多糖分離的油的質量測定為m0。OHC 表示為每克多糖中所含油的克數，計算公式如下：

1.3 數據處理

數據采用平均值±標準偏差的形式。使用SPSS 26.0 軟件進行方差分析，使用Origin 9.65 繪圖處理。所有試驗至少重復三次。

2 結果與分析

2.1 X-射線衍射分析

多糖的晶體和半晶體結構直接影響其物理性質[15]。蜂蜜多糖的X-衍射記錄見圖1。

圖1 蜂蜜多糖的X-射線衍射圖Fig.1 X-ray diffraction spectrum of honey polysaccharides

如圖1所示，兩種蜂蜜多糖的X-射線衍射出現不明顯的凸起，并無任何典型或尖銳的強烈峰，表明均為典型的無定形性質，MHP 分別在2θ=20°處有較弱的衍射峰出現，說明可能存在晶體結構，結晶度較小，與川貝母多糖的X-射線衍射分析相似[16]，而LHP 的X-衍射峰較MHP 更弱。X-衍射表明蜂蜜多糖既有結晶性又有無定形狀態。

2.2 熱力學特性

2.2.1 熱重分析 多糖的熱穩定性是多糖應用的重要特征，通過熱重分析（TG）、導數熱重分析（DTG）和示差掃描量熱（DSC）分析蜂蜜多糖的熱力學性質。TG 可測量溫度變化過程中產品的重量損失和熱降解溫度[17]，見圖2。如圖2所示，蜂蜜多糖的熱分解分成兩個階段，第一階段為水分的流失，第二階段為蜂蜜多糖的化學分解。蘭莖粉多糖[18]和綠豆皮多糖[19]等天然多糖也有兩個熱分解階段。通過分析可知，LHP 和MHP 的重量損失分別為85.05%和81.30%，熱降解溫度分別為236.7 和322 ℃。LHP 失重比MHP 多，MHP 具有更強的熱穩定性和更穩定的結構，這種熱穩定性的差異可能是由多糖的結構、分子量大小引起的[20]。

圖2 蜂蜜多糖的TG、DTG 曲線圖Fig.2 TG and DTG curve of honey polysaccharides

2.2.2 示差掃描量熱分析 DSC 用于確定蜂蜜多糖隨著溫度升高而發生的吸熱或放熱變化[21]，見圖3。如圖3所示，LHP 和MHP 均表現出一個較寬的放熱反應峰，分別在75 和72 ℃附近，該范圍蜂蜜多糖為失重狀態，可能發生分解反應，而在400 ℃后可能存在特征峰-吸熱峰。川貝母多糖的DSC 分析在231.9 和300.1 °C 出現放熱谷，多糖熱穩定性的差異可能是由提取方法、多糖的化學組成和結構之間的差異引起[22]。總體來看，LHP 和MHP 的熱穩定性較強，可在正常操作溫度下保持穩定。

圖3 蜂蜜多糖的DSC 曲線圖Fig.3 DSC curve of honey polysaccharides

2.3 流變特性

2.3.1 靜態流變學測試 如圖4所示，顯示了蜂蜜多糖溶液（0.5%）的穩態剪切流動曲線。圖4 中兩種蜂蜜多糖溶液均表現出剪切變稀行為。隨剪切速率的增大，表觀粘度逐漸降低，符合非牛頓流體特征，即為剪切稀化的假塑性流體，此現象與黑穗醋栗多糖的流變特性相同[23]。剪切變稀的主要原因是分子在流動方向的取向、柔性鏈的變形和分子間相互作用的減少[24-25]。LHP 和MHP 在高剪切速率下粘度分別在1.3 和1.2 mPa·s 保持不變，LHP 的分子量大，阻力大，進而粘度相對較大，而粘度較低的多糖，意味著可以在較低的能量下運行，能夠減少機械運轉過程中的能損耗，利于工業化生產[26]。

圖4 蜂蜜多糖隨剪切速率的流變學變化Fig.4 Rheological changes of honey polysaccharides with shear rate

2.3.2 動態流變學測試 0.5%的LHP 和MHP 的頻率掃描變化見圖5。儲能模量（G'）反映了蜂蜜多糖溶液的彈性性質，損耗模量（G″）反映了蜂蜜多糖溶液的粘性性質[27]。如圖5所示，LHP 和MHP 在頻率為0.1～100 Hz 內G″＜G'，且兩條曲線接近于平行變化，表現為弱凝膠行為，刺梨多糖也得到了類似的結果[28]。

圖5 蜂蜜多糖的流變特性隨頻率的變化Fig.5 Changes of rheological properties of honey polysaccharides with frequency

蜂蜜多糖溶液（0.5%）從20 ℃升溫到90 ℃的粘度和應力變化見圖6，如圖6a所示，兩種蜂蜜多糖溶液的粘度在溫度20～63 ℃范圍內幾乎沒有變化，并在很寬的溫度范圍內保持穩定（見圖6b）。綠藻胞外多糖也得到了類似的結果[7]。結果表明，在一般溫度范圍內，LHP 和MHP 的粘度不受影響，是食品或化妝品添加劑的理想選擇。

圖6 蜂蜜多糖隨溫度影響的流變變化圖Fig.6 Rheological changes of honey polysaccharides with temperature

2.4 持水性與持油性

保水和結合脂肪的能力是食品配制和加工中最實用的功能特征，通過水和油之間的相互作用直接與產品質地相關[2]。結果如表1所示，LHP 和MHP 的持水量分別為(1.60±0.09) g 水/g 和(0.40±0.02) g 水/g，低于杏仁多糖1.95 g 水/g[28]。LHP 和MHP 的持油量分別為(18.80±1.05) g 油/g 和(11.4±0.89) g 油/g，高于綠藻酸性多糖的持油量（15.09 g 油/g）[15]，高OHC的多糖對高脂食品和乳液的穩定性能更強。蜂蜜多糖具有理想的脂肪結合力，因此，蜂蜜多糖在功能性食品工業中具備潛在的應用基礎。蜂蜜多糖作為水溶性多糖，其表現出的持水持油特性是多糖與其所合有的蛋白質共同作用的結果，即蛋白質作為疏水結構存在，而多糖鏈作為親水性結構存在。

表1 蜂蜜多糖的持水性和持油性Table 1 Water holding capacity and oil holding capacity of honey polysaccharides

3 結論

本文利用X 射線衍射研究椴樹蜂蜜多糖和多花種蜂蜜多糖的晶體結構，也通過熱力學特性、流變學特性、持水性和持油性來研究其加工特性。結果表明，MHP 具有更好的熱穩定性；兩種多糖溶液在高頻率剪切下表現為弱凝膠行為；剪切速率變化下，表現為剪切稀化行為；且溫度對蜂蜜多糖的流變特性不具有很大程度的影響。根據流體力學，多糖加熱后，分子無規則運動增加，分子間距增大，減弱了多糖分子鏈之間的相互作用，多糖鏈更易于運動，溶液粘度降低，剪切稀化現象明顯。根據本文結果，可以利用蜂蜜多糖熱重分析，對不同溫度下的蜂蜜多糖開發利用。同時，蜂蜜多糖具有較好的水和脂肪結合能力。多糖加工特性的研究應從熱力學特性和流變學特性等方面結合物理加工特性進行全面研究，進而為其在工業和功能性食品中的應用打下基礎。