9 種腹瀉性貝類毒素的高效液相色譜-串聯質譜測定方法的建立

王 婷，梁 瓊，趙曉野，王 儒

（海南省食品藥品檢驗所海口分所，海南海口 570311）

海洋生物毒素是一類存在于海洋生物體內的特殊高活性代謝產物，多存在于貝類及西甲魚類中，其生物結構為生物堿和多肽，按其毒素毒性作用機制可分為麻痹性貝類毒素、腹瀉性貝類毒素、失憶性貝類毒素及神經性貝類毒素。其中腹瀉性貝類毒素（Diarrhetic Shellfish Poisoning，DSP）是一類大環內酯或聚醚的脂溶性化合物，主要是由原甲藻類和鰭藻等藻類產生[1-4]。DSP 毒素包括：米氏裸甲藻毒素（Gymnodimine，GYM）、螺環內酯毒（Spirolides，SPXs）、軟海棉酸毒素（Okadaic acid，OA）及其衍生物鰭藻毒素（Dinophys-istoxin，DTX 毒素）、聚醚類毒素，如原多甲藻酸（Azaspir acid，AZAs），蛤毒素（Pectonotoxin，PTXs）和蝦夷扇貝毒素[5-6]。貝類等慮食性動物通過濾食有毒藻類而使得DSP 在體內富集，危害食用者健康。當人們誤食染毒的貝類后就會造成中毒，癥狀主要表現為腹瀉，與一些普通腹瀉癥狀相似，所以往往被人們忽視[7-8]。DSP 在全球沿岸海域均有分布，是世界范圍內具有最嚴重威脅的赤潮藻毒素之一。由于腹瀉性貝類中毒現象普遍存在，且分布較廣、致毒性強，故被列為世界食品衛生學重要問題之一。

目前貝類毒素檢測方法有小鼠生物測定法（MBA 法）、酶聯免疫吸附測定（ELASA）法、高效液相色譜-熒光法、高效液相色譜-串聯質譜法（HPLCMS/MS）等[9-14]。雖然MBA 法是腹瀉性貝類毒素最普遍的檢測方法，但該方法需大量使用小鼠，不符合“3R”的要求[15]，而且靈敏度低、準確性和重現性差，具有易出現假陽性和無法確定毒素的成分、結構和含量等缺點；ELASA 試劑盒雖靈敏度高、操作簡單，但其試劑盒昂貴，也有因類似物干擾作用，出現假陽性的情況[16]，不適合日常監測使用；高效液相色譜-熒光法是國內外目前常用的貝類毒素檢測方法，但是分析過程中使用的柱衍生試劑如ADAM 價格昂貴[17]，背景干擾對試驗結果影響大，操作繁瑣，重復性差，因此其應用受到一定的限制；HPLC-MS/MS 測定是近年興起的一種檢測技術，比其他方法重復性好，不會出現假陽性，是一種能夠準確定性定量，并能夠提供準確的分子結構信息的新型分離技術[18]。在眾多的分析測試方法中，HPLC-MS/MS 以其同時具備高特異性和高靈敏度的特點而被廣泛應用于生物毒素研究領域。

此次研究以可食用新鮮貝類為研究對象，針對其中可能存在脂溶性貝類毒素的污染情況，開發了適用于腹瀉性貝類毒素的檢測方法，通過快速、高效的QuEChERS 和分散固相萃取技術進行凈化，建立HPLC-MS/MS 法對9 種腹瀉性貝類毒素進行定性和定量測定，以獲得快速、準確的檢驗數據，為不安全貝類產品及其制品的毒素檢測提供依據，為監管部門提供可靠的技術支撐和參考價值，保障廣大消費者的生命健康安全。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菲律賓蛤仔、魁蚶、櫛江珧、波紋巴非蛤、華貴櫛孔扇貝、裂紋格特蛤、翡翠貽貝、鈍綴錦蛤、方斑東方螺、蟶子等，分別于海南省海口市、文昌市、瓊海市、三亞市、儋州市、東方市五個取樣點進行采樣；甲醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷 均為色譜純，德國默克公司；無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸 均為分析純，廣州化工；甲酸 色譜純，美國ACS 公司；乙酸銨 色譜純，美國Fisher 公司。

標準物質：大田軟海綿酸（Okadaic acid, OA）：8.4±0.4 μg/mL，鰭藻毒素1（Dinophys-istoxin, DTX1）：8.5±0.7 μg/mL，鰭藻毒素2（Dinophys-istoxin, DTX2）：3.83±0.25 μg/mL，扇貝毒素2（Pectonotoxin, PTX2）：4.4±0.13 μg/mL，原多甲藻酸貝類毒素1（Azaspir acid,AZA1）：1.3±0.07 μg/mL，原多甲藻酸貝類毒素2（Azaspir acid, AZA2）：1.22±0.06 μg/mL，原多甲藻酸貝類毒素3（Azaspir acid, AZA3）：1.18±0.25 μg/mL，米氏裸甲藻毒素（Gymnodimine, GYM）：2.5±0.13 μg/mL，螺環內酯毒素1（Spirolides, SPX1）：7.25±0.3 μg/mLNRC，加拿大海洋研究中心。

LC 1290-MS 6460 液相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫科技有限公司；Multi Reax（EU）渦旋振蕩器德國海道爾夫（Heidolph）公司；MS3 D S025 渦旋儀德國IKA 儀器設備有限公司；舒美KQ-50 超聲儀昆山儀器；3-18K 離心機 德國SIGMA 公司；TTLDCII 氮吹儀 同泰公司；MSE125P-CE（感量為0.00001 g）天平 德國Sartorius 公司；PL602-L 天平（感量為0.01 g） 瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q IQ7000 超純水系統 美國默克密理博公司；Prime HLB 固相萃取小柱（6 cc，200 mg）、MCX 混合型陽離子柱（6 cc，200 mg）、C18固相萃取柱（6 cc，200 mg）美國Waters 公司；C18粉美國Agela 公司；腹瀉性貝類毒素免疫親和柱（3 mL） 美正生物。

1.2 標準溶液配制

精確量取一定量標準物質溶液，用乙腈配制成1 μg/mL 標準儲備液；取1 mL 儲備液，用乙腈定容至10 mL，得到100 ng/mL 標準使用液。稱取陰性空白樣品，按照前處理過程處理樣品，得到空白基質。取一定量標準使用液，用空白基質配制成濃度梯度為0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL 的標準曲線[19-22]。

1.3 樣品制備

樣品用清水洗凈外部泥沙，去殼取出貝肉，再將貝肉用超純水清洗干凈，瀝干水分，將樣品剪碎后用均質機均質備用。樣品制備完成后，放置-20 ℃冷凍儲存，測定前將其室溫解凍。

1.4 樣品處理方法

樣品經80%乙腈水提取，利用QuEChERS 和分散固相萃取技術進行凈化，具體操作如下：稱取2.00 g 樣品，加入10 mL 80%乙腈水溶液，再加入1 g 無水硫酸鎂和0.5 g 氯化鈉，渦旋振蕩5 min，5000 r/min離心5 min，取上清液40 ℃氮吹近干，甲醇定容至1 mL，再加入125 μL 氫氧化鈉溶液（2.5 mol/L），于76 ℃下溫育40 min 后冷卻至室溫，再加入125 μL 鹽酸溶液（2.5 mol/L），所得水解液中加入0.05 g C18粉和0.1 g 無水硫酸鎂，渦旋振蕩，5000 r/min 離心5 min，過0.22 μm 有機濾膜，上機檢測。

1.5 分析條件

1.5.1 液相色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。流動相A相為5 mmol/L 乙酸銨0.1%甲酸水溶液，B 相為乙腈，梯度洗脫程序見表1。流速：0.3 mL/min。柱溫：30 ℃。進樣量：5 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program

1.5.2 質譜條件 離子源：AJS ESI；掃描方式：Positive/Negative；檢測方式：多重反應監測（MRM）；毛細管電壓：4000 V；霧化器壓力：35 psi；離子源溫度：300 ℃；氮氣作為鞘氣和碰撞氣，其中鞘氣為11.5 L/min，輔助氣為1.65 L/min。各組分監測的MRM 參數見表2。

表2 MRM 參數Table 2 MRM parameters

1.6 方法學驗證

本研究采用外標法進行定量，根據目標物所建立標準曲線，計算各目標化合物的線性范圍、檢出限。同時稱取空白樣品進行樣品加標回收實驗，每個樣品做6 個平行樣，計算目標物的回收率和精密度。

1.7 數據處理

本文圖譜采用安捷倫Qualitative Analysis B.07.00＞繪制。數據處理采用安捷倫QQQ Quantitative Analysis 軟件進行標準曲線建立、實驗結果計算、信噪比計算。提取液選擇中的回收率的計算、不同凈化方法回收率的計算均采用兩個平行樣品取平均值計算。精密度選擇三個濃度梯度，每個濃度梯度取連續采集6 針數據的峰面積進行相對標準偏差RSD值的計算。方法檢出限按照檢出限公式：檢出限=3×對照品濃度×樣品稀釋體積/信噪比/取樣量，計算出目標物檢出限。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

根據9 種DSP 的分子量以及化學電離性質，分別在正、負離子掃描模式下進行母離子全掃描，篩選相應較高的離子對。對目標物濃度為1 μg/mL 標準液進行一級離子掃描，掃描結果顯示OA、DTX-1、DTX-2 在負離子模式下響應更高，其余化合物在正離子模式下響應更優。在獲得分子離子峰后，進行二級質譜掃描，選擇多反應監測（MRM）掃描，對Fragmentor 電壓和碰撞能（Collision Energy）等質譜參數進行優化，最終得到表2 的質譜參數。在該儀器條件下對濃度為50 ng/mL 的9 種DSP 混合標準溶液進行測定，單個物質色譜圖如圖1～圖9所示，9 種DSP 總離子流圖如圖10所示，所有物質均在9 min 前完成出峰，響應值均在103以上。

圖1 大田軟海綿酸色譜圖Fig.1 Acid chromatogram of okadaic acid

圖2 鰭藻毒素1 色譜圖Fig.2 Acid chromatogram of dinophysistoxin-1

圖9 螺環內酯毒素1 色譜圖Fig.9 Acid chromatogram of spirolides

圖3 鰭藻毒素2 色譜圖Fig.3 Acid chromatogram of dinophysistoxin-2

圖4 扇貝毒素2 色譜圖Fig.4 Acid chromatogram of pectonotoxin-2

圖5 原多甲藻酸貝類毒素1 色譜圖Fig.5 Acid chromatogram of azaspir acid-1

圖6 原多甲藻酸貝類毒素2 色譜圖Fig.6 Acid chromatogram of azaspir acid-2

2.2 液相條件優化

DSP 屬于親脂性海洋生物毒素，在理化性質方面呈現多樣性，如其含有羧酸、磺酸、氨基和亞氨基官能團[23-28]。DSP 毒素有一定的復雜性，根據碳骨架結構將這些成分分為酸性成分、中性成分以及堿性成分[29-30]。因此，實驗過程中流動相選擇、樣品前處理和凈化洗脫都要考慮到目標物的屬性。

圖7 原多甲藻酸貝類毒素3 色譜圖Fig.7 Acid chromatogram of azaspir acid-3

圖8 米氏裸甲藻毒素色譜圖Fig.8 Acid chromatogram of gymnodimine

2.2.1 色譜柱選擇 本實驗采用了比較常見的C18反相色譜柱。研究比較了ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱和ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱分離效果的差異[31]。比較圖10 和圖11 發現，C18分離效果相較T3柱更好，因此選用Waters ACQUITY UPLC BEH C18的液相色譜柱對其余毒素進行采集分離。實驗中發現C18柱不僅對軟海棉酸（OA）類毒素的分離效果好，對其他DSP 也能夠完全分離，沒有毛峰，而且靈敏度也較高，滿足實驗需要。

圖10 C18 柱分離9 種DSP 混合物總離子流圖（50 ng/mL）Fig.10 Total ion flow diagram of separation of 9 DSP mixtures on C18 column（50 ng/mL）

圖11 T3 柱分離9 種DSP 混合物總離子流圖（50 ng/mL）Fig.11 Total ion flow diagram of separation of 9 DSP mixtures on T3 column（50 ng/mL）

2.2.2 流動相的選擇 因DSP 是一種脂溶性物質，且9 種目標物中存在酸性成分、中性成分和堿性成分。根據其不同的性質以及9 種目標物在質譜上正、負離子不同掃描模式不同，在流動相中添加甲酸，使得H+濃度增加，增強離子化效率，在正離子掃描模式下提高響應；同時在流動相中添加弱堿性的緩沖鹽溶液，增強分離度，提高負離子掃描模式下的響應。所以選擇5 mmol/L 乙酸銨水溶液（加0.1%甲酸）和乙腈為流動相，通過改變流動相的比例對DSP 混合標準溶液進行分離實驗，最終采用梯度洗脫方法將9 種DSP 毒素完全分開，并且靈敏度較高，峰形尖銳平滑對稱，最佳的洗脫條件見表1。

2.3 前處理步驟優化

2.3.1 提取液選擇 目前常用的提取劑有乙腈、甲醇、丙酮等[32-33]。本實驗對比純甲醇、80%甲醇水溶液、80%乙腈水溶液進行提取。在同一加標水平，三種提取液提取效果見表3。結果顯示純甲醇的總體回收率較差，因甲醇對脂肪具有一定的溶解性，會降低提取效果；80%乙腈水溶液比80%甲醇水溶液總體回收率略高，因乙腈比甲醇使蛋白質變性的能力更強，為降低基質影響，最后選擇80%乙腈水溶液作為提取液。

表3 不同提取液回收率比較Table 3 Comparison of recovery rates of different extracts

2.3.2 酯化態DSP（DTX-3）水解釋放 據所查閱資料，對DSP 提取方法研究大多數都未涉及到DTX-3。DTX-3 是OA、DTX-1、DTX-2 的酯化態形式，存在于貝類樣品中[33-34]，本身對人體無害，但其在堿性條件下可以水解釋放出有毒的OA、DTX-1、DTX-2，致人中毒。因此實驗前處理中加入水解一步，這樣更能準確定量貝類中DSP 的含量。

2.3.3 凈化方法的選擇 貝類樣品基質復雜，富含蛋白質和脂肪等，待測樣品凈化不足極易污染離子源，導致HPLC-MS/MS 的檢測易被雜質干擾，從而靈敏度下降，定量偏低，所以凈化方法對結果影響很大。為了降低基質效應，應選擇適當的凈化方法。本實驗比較了液液萃取、固相萃取（包括Prime HLB 固相萃取小柱、MCX 固相萃取小柱、腹瀉性貝類毒素免疫親和柱）和QuECHERS 凈化方法對DSP 的加標回收效果如下表4所示。

表4 不同凈化方法比較Table 4 Comparison of different purification methods

液液萃取技術試劑用量大，操作繁雜，并且實驗過程中容易產生乳化現象，降低提取效率；Waters Prime HLB 固相萃取小柱，無需活化，實驗步驟簡單易操作，并且凈化脂肪、蛋白質等大分子物質能力較強，通用能力較強，但是對毒素吸附性較強，不易洗脫干凈，導致大部分毒素回收率偏低至50%以下，對實驗準確度影響較大；Waters MCX 混合型陽離子交換柱，由于具有磺酸基基團，所以對堿性化合物具有很高的選擇性和靈敏度。交換柱對于GYM、SPX、OA、PTX2、AZA-1 凈化效果尚佳，回收率范圍為82.4%～107.3%，但對其他毒素凈化效果較差，回收率范圍為72.6%～79.7%，整體偏低；腹瀉性貝類毒素免疫親和柱回收率在90.2%～104.7%間，回收效果很好，但操作復雜，成本非常昂貴，不適合大批量檢測。

因C18可以有效去除脂類和碳水化合物，所以采用以C18粉和無水硫酸鎂的混合物對腹瀉性貝類毒素進行凈化的QuEChERS 方法。但過量使用C18也會降低回收率。多次試驗后發現，如果預先加入0.1 g無水硫酸鎂，再加入0.05 g 凈化吸附劑C18，即可獲得最高的回收率。9 種毒素回收率均在87%～112%的范圍為內，凈化效果較好。對于基質較為復雜的樣品，無需增加額外的處理，即可達到滿意的凈化效果，同時節省了實驗的時間和成本，因此實驗前處理選擇QuECHERS 凈化方法。

2.4 方法學驗證

2.4.1 方法的線性范圍和檢出限 為消除基質效應對分析結果的影響，將100 ng/mL 標準使用液用空白基質配制成線性范圍為0.5～50 ng/mL 的標準曲線。以各目標化合物的濃度（ng/mL）為橫坐標，響應值的峰面積為縱坐標建立標準曲線。將陰性樣品中添加9 種腹瀉性貝類毒素混合標準使用液，使得上機檢測理論濃度為0.5 ng/mL，在優化的色譜條件下進回收試驗，經測定信噪比（S/N）均大于3，按照檢出限公式：檢出限=3×對照品濃度×樣品稀釋體積/信噪比/取樣量，計算出目標物檢出限。相應的線性方程、相關系數和檢出限見表5。

表5 標準物質線性方程、相關系數、檢出限Table 5 Linear equation of reference material, decision coefficient, detection limit

由表5可知，9 種腹瀉性貝類毒素標準方程的線性相關系數均在0.996～0.999 之間，線性良好，可以滿足實驗要求。歐盟對于親脂性海洋生物毒素AZA-1、 AZA-2、 AZA-3、 OA、 DTX-1、 DTX-2、PTX-2 的限制濃度為160 μg OA 當量/kg，GYM 的限制濃度為200 μg OA 當量/kg，SPX1 的限制濃度為100 μg OA 當量/kg[33,35-37]，本方法的檢出限比歐盟管制毒素規定濃度的0.05 倍還低，仍可獲得大于3 的信噪比，說明檢測靈敏度良好。

2.4.2 方法的平均回收率和精密度 分別在空白樣品中加入不同濃度的9 種腹瀉性貝類毒素混合標準使用液，按照優化方法條件進行處理和檢測，每個目標物添加三個濃度梯度，重復測定6次，計算低、中、高三個濃度梯度的回收率和相對標準偏差，以考察方法的準確度和精密度（RSD）。

由表6 數據可知，9 種化合物三個濃度梯度的回收率在 87.2%～111.2%之間，相對標準偏差均小于10%，由此可以說明該方法的準確度和精密度均符合實際分析檢測的要求。

表6 回收率和精密度Table 6 Recovery rate and precision

2.5 實際貝類樣品測定

用本實驗建立的方法檢測海南省五個城市市售的菲律賓蛤仔、魁蚶、華貴櫛孔扇貝等約十個品種的貝類，對檢出率和超標率進行分析（表7）。我國大部分沿海海域，如廣東沿海、江浙海域均有DSP 的污染存在，個別海域超標率竟達77%[38-43]。此次實驗發現，海南省近岸海域貝類腹瀉性貝類毒素的污染概率較大，但是超標率不高。

表7 不同海域中DSP 的檢出率和超標率Table 7 Detection rate and over - standard rate of DSP in different sea areas

3 結論

貝類毒素種類繁多、結構復雜、樣本基質較為復雜，為盡量避免或減少假陽性結果出現，研究開發高分辨率質譜測定技術，能夠快速、準確進行大批量樣品檢測，多種毒素同時定性定量的檢測技術是非常必要的。本方法可同時檢測9 種DSP，OA、DTX1、DTX2、PTX2、GYM、SPX1、AZA1、AZA2、AZA3在質量濃度0.5～50 ng/mL 的范圍內，其線性相關系數均在0.996 以上，檢出限為1～10 μg/kg，遠遠低于歐盟立法機構所確定的限量要求，回收率為87.2%～111.2%，相對標準偏差為2.8%～9.2%。本方法的線性相關系數、檢出限、回收率、精密度均能滿足腹瀉性貝類毒素的日常檢測需要，并且一個樣品從前處理到上機檢測，最多只需要2 h 就可以完成。結果表明，在眾多方法中HPLC-MS/MS 可滿足多種毒素同時檢測需求，操作簡便快捷、特異性高、靈敏度較高、重復性好、準確性高，實驗過程中損失較小，穩定性重現性均良好，而且節約成本，適合大批量檢驗。