增強型固相萃取凈化-高效液相色譜-串聯質譜法測定鱸魚中18 種磺胺類藥物的殘留量

王東鵬，葉 誠

（武漢海關技術中心，湖北武漢 430050）

磺胺類藥物（sulfonamides，SAS）是含有對氨基苯磺酰胺結構的人工合成的抗菌藥物[1-2]，因抗菌譜廣[3]、抗菌效應強、成本低[4]以及化學性質穩定等優點而廣泛應用于臨床及畜牧業和養殖業[5-6]。然而，磺胺類藥物在體內代謝緩慢，長期大量使用容易導致該類藥物在動物體內殘留，進一步通過食物鏈在人體內蓄積，引發腎毒性、胃腸道出血、再生障礙性貧血[7]、過敏反應、以及細菌耐藥性和致癌性等[4,8-10]，嚴重危害人類健康。許多國家對動物源性食品中磺胺類藥物的最大殘留量有明確規定，國際食品法典委員會（Codex Alimentarius Commission，CAS）規定動物源性食品中磺胺類藥物最大殘留量為100 μg/kg[11]。我國在GB31650-2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》中規定，除牛奶外，動物源性食品中磺胺類藥物最大殘留量為100 μg/kg[12]。值得注意的是，盡管多個國家和地區明確規定磺胺類藥物的最大殘留量，但農戶為追求更高的商業價值，磺胺類藥物的濫用現象仍然存在。因此，建立高效、準確、快速的磺胺類藥物檢測方法對食品安全至關重要。

目前，高效液相色譜-串聯質譜法、毛細管電泳法、高效液相色譜法、放射性免疫法、免疫傳感器法、酶聯免疫吸附法和膠體金免疫層析法是磺胺類抗菌藥物常用的檢測方法[4,13]，高效液相色譜-串聯質譜法因具有靈敏度高、準確性好等優點，是目前動物源性食品中抗生素殘留最主要的檢測方法。樣品前處理方法直接影響檢測結果，磺胺類藥物常用的提取溶劑為乙腈、二氯甲烷或混合溶劑，在提取溶劑中加入酸或堿可增加提取效果。QuEChERS 凈化法[14]、固相萃取法[15-16]、固相微萃取法、基質固相分散法[17]、加壓液體萃取法、免疫親和色譜法[18]和液液萃取法[19]是常用的提取方法。動物源性食品常含有大量脂肪、蛋白質等大分子化合物，對樣品檢測干擾較大，傳統的前處理方法操作復雜、耗時長、溶劑消耗大，提取液中較高含量的脂肪和蛋白質仍然是其主要缺點[19]，新型增強型脂質去除凈化柱（Captiva EMRLipid）通過體積排阻和疏水作用，可有效地去除脂質，最大程度地減少分析物的流失，方法的可靠性和耐用性顯著提高。目前增強型脂質去除固相萃取凈化柱在動物源性食品中磺胺類藥物檢測中應用較少。

本研究擬采用新型增強型脂質去除固相萃取柱結合高效液相色譜-串聯質譜法建立鱸魚中18 種磺胺類抗菌藥物高效、靈敏、快速的檢測方法，旨在為鱸魚等動物源性食品中磺胺類抗菌藥物的快速檢測提供新的依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大口黑鱸魚樣品 購于超市；磺胺醋酰、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺噻唑、磺胺氯噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺異噁唑、磺胺嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、苯甲酰磺胺（濃度100 μg/mL） 天津阿爾塔科技有限公司；甲氧芐啶（濃度100 μg/mL）北京壇墨質檢科技有限公司；2 種內標（磺胺間二甲氧嘧啶-D6 和磺胺鄰二甲氧嘧啶-D3） 純度≥98.9%，上海安譜璀世標準技術服務有限公司；甲醇色譜純，武漢弗頓控股有限公司；乙酸乙酯 色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司；乙腈 色譜純，美國Honeywell 公司；甲酸銨 色譜純，德國CNW 公司；甲酸 分析純，廣東光華科技股份有限公司；氯化鈉、無水硫酸鈉 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水 為超純水。

Agilent1200 高效液相色譜儀配二元高壓泵、自動進樣器和柱溫箱，Captiva EMR-Lipid 3 mL/300 mg固相萃取柱 美國Agilent 公司； Poly-Sery MCX 3 mL/60 mg 固相萃取柱、CNW Athena C18-WP 色譜柱（2.1 mm×100 mm，3 μm） 德國CNW 公司；AB SCIEX API 4000Q 質譜聯用系統配電噴霧離子源（ESI） 美國AB SCIEX 公司；Neofuge1600R 臺式冷凍離心機 上海力申科學儀器有限公司；BS210S萬分之一電子天平 德國賽多利斯儀器系統有限公司；DMT-2500 渦旋振蕩儀 杭州米歐儀器有限公司；HGC-24A 氮氣吹干儀 天津恒奧科技發展有限公司；KQ-500 超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；優普超純水制造系統 四川優普超純科技有限公司；GM200 刀式搗磨儀 德國RETSCH 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準品溶液的配制 準確移取18 種磺胺標準儲備液（100 μg/mL）各1 mL，用10%甲醇水溶液定容至10 mL，配制成濃度為10 μg/mL 的標準中間液。移取各標準中間液1 mL，用10%甲醇水溶液配制成濃度為1 μg/mL 的混合標準中間溶液。此外，配制1 μg/mL 磺胺間二甲氧嘧啶-D6 和磺胺鄰二甲氧嘧啶-D3 內標工作液。用10%甲醇水溶液逐級稀釋配制成質量濃度為5、10、20、50、100、200 ng/mL的標準工作液，同時，在每個濃度點添加50 μL 內標工作液，內標濃度為10 ng/mL。

1.2.2 樣品前處理 取鱸魚去鱗去鰓后，清洗干凈取鱸魚可食用肌肉部位，用刀式搗磨儀充分混勻粉碎。精密稱取魚肉樣品5 g 于50 mL 離心管中，加入50 μL內標工作液，加入10 mL 乙腈溶液（含1%甲酸），再渦旋2 min，加入1 g 氯化鈉和4 g 無水硫酸鈉，渦旋5 min，振蕩30 min，超聲15 min，8500 r/min 離心5 min，取上清液于另一50 mL 離心管。

取2 mL 上清液過增強型脂質去除凈化柱，重力自流，收集流出液，在45℃水浴下氮吹至近干，用10%甲醇水溶液定容至1 mL，過0.22 μm 微孔濾膜,待測。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：CNW Athena C18-WP（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流動相A 為0.1%甲酸水溶液，B 為甲醇；流速為0.3 mL/min；進樣體積為10 μL；柱溫30 ℃；洗脫梯度：0～0.5 min，90% A；0.5～2.0 min，90%～60% A；2.0～11.0 min，60%～10% A；11.0～11.1 min，10%～90% A；11.1～15.0 min，90% A。

1.2.4 質譜條件 電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；多反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM）；正離子模式；離子源溫度（TEM）：500 ℃；氣簾氣（CUR）10 psi；噴霧電壓（IS）5000 V；霧化氣40 psi；輔助氣50 psi。其他參數見表1。

表1 18 種磺胺類藥物和內標的質譜參數Table 1 Mass spectrum parameters of 18 sulfonamides and internal standard

1.2.5 線性范圍、檢出限與定量限測定 配制質量濃度為5、10、20、50、100、200 ng/mL 的標準工作液，分別以進樣濃度X（ng/mL）和峰面積Y 為橫坐標和縱坐標，繪制標準曲線，并計算回歸方程和相關系數。以信噪比為3（S/N=3）作為檢出限（limits of detection，LOD），以信噪比為10（S/N=10）作為定量限（limits of quantification，LOQ）。

1.2.6 回收率與精密度實驗 在陰性魚肉樣品中各添加質量濃度為5、10、50 μg/kg 三水平的混合標準溶液，重復測定6次，計算各磺胺類藥物回收率和精密度。

1.3 數據處理

采用統計軟件Excel 2016、GraphPad Prism 6和Analyst 1.6.2 軟件對采集和檢測結果進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優化

2.1.1 色譜條件的優化 根據中華人民共和國國家標準GB/T 21316-2007[20]、農業農村部1025 號公告-23-2008 及文獻報道，磺胺類化合物常用的流動相為乙腈[21-22]和甲醇[23-25]。此外，磺胺類化合物在酸性條件下具有較高的較穩定性和溶解性[19]，因此，本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液對18 種磺胺類化合物的分離度、峰形及靈敏度的影響。結果表明，以甲醇-水和乙腈-水為流動相時，化合物峰形差，對于待測組分中存在的同分異構體，基線無法實現完全分離。通過比較甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液發現，在水相中加入0.1%甲酸時，待測組分峰型尖銳，拖尾現象有所改善，同時甲酸有利于提高待測物在正離子掃描模式中的離子化效率，進一步提高了靈敏度。與乙腈相比，采用甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫時，待測物可以實現良好的基線分離。

研究發現加入甲酸銨或乙酸銨可以穩定水相，改善峰型，對同分異構體實現更好的分離效果[13,26]，然而本研究通過比較甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸-5 mmol/L 甲酸銨水溶液對待測物峰型及分離度的影響，發現加入甲酸銨對待測物峰型及分離度影響較小，因甲酸銨屬于鹽類化合物，考慮到試劑的消耗以及鹽類流動相殘留對色譜柱和儀器使用壽命的影響，因此本研究最終選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相。18 種磺胺類化合物的總離子流圖如圖1。

圖1 混合標準品溶液總離子流圖Fig.1 TIC chromatograms of mixed standard solution

2.1.2 質譜條件的優化 通過在離子源正負離子模式下對18 種磺胺類藥物掃描，發現18 種磺胺類藥物在正離子模式下響應較好，因此選擇離子源正離子模式對磺胺類藥物母離子全掃，確定目標化合物的母離子。再進一步通過二級質譜優化磺胺類抗菌藥物的子離子、碰撞能以及去簇電壓等參數（見表1）。采用優化后的色譜和質譜參數對18 種磺胺類藥物采集，如圖1所示，結果表明化合物具有良好的分離度和靈敏度，優化的儀器參數可滿足磺胺類抗菌藥物分析。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 提取條件的優化 動物源性食品中磺胺類化合物常用的提取溶劑為乙酸乙酯、甲醇[27]和乙腈[28-31]，本研究考察了上述3 種溶劑的提取效果，結果表明，甲醇提取液含有白色渾濁物，且難以通過增強型脂質去除固相萃取凈化柱。乙酸乙酯和乙腈提取液較澄清透明，且易通過增強型脂質去除固相萃取凈化柱。與乙酸乙酯相比，采用乙腈作為提取溶劑時，回收率相對較高。此外，磺胺類化合物結構中因含有芳伯氨基而呈現弱堿性，研究發現，使用酸化有機試劑提取，磺胺類化合物溶解度更高，提取效率較好[18,31]，與甲醇相比，乙腈極性與待測物極性相近，因動物源性食品中含有大量的脂肪和蛋白質，考慮到乙腈具有較好的蛋白沉淀效果，因此本研究在參考趙巧靈等、容裕棠等方法[8,14]基礎上，最終選用1%甲酸乙腈為提取溶劑。

2.2.2 凈化方式的優化 樣品中大量的脂肪和蛋白質對檢測結果影響較大，本研究在提取過程中加入氯化鈉和無水硫酸鈉，通過鹽析使蛋白質沉淀，進一步減少了蛋白質對樣品檢測的干擾。盡管蛋白質可通過鹽析后離心去除，而樣品中的脂肪和磷脂等仍然會干擾待測物的檢測，因此，本研究比較了新型Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱與Poly-Sery MCX 固相萃取柱的凈化效果及對磺胺類藥物回收率的影響。由圖2 可以看出，采用Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱凈化時，化合物回收率高，且相對穩定。此外，如圖3所示，在凈化過程中該凈化柱無需活化、淋洗等過程，通過重力自流即可完成凈化，極大地簡化了樣品前處理步驟，在減少有機試劑消耗的同時，有效縮短了凈化時間，簡便易用，省時省力，顯著提高了方法的可操作性和便利性。該方法最大的優點在于采用的Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱結合了體積排阻和疏水相互作用，在高選擇性和高效去除脂質的同時，能最大程度地減少待測物的流失，從而有利于改善方法的耐用性及可靠性。

圖2 不同凈化柱對18 種磺胺回收率的影響Fig.2 Effects of different purification columns on recovery rates of 18 sulfonamides

圖3 不同固相萃取柱對磺胺類藥物凈化效果的影響Fig.3 Effect of different solid phase extraction columns on the purification effect of sulfonamides

2.3 方法學考察

2.3.1 線性范圍、檢出限與定量限 配制質量濃度為5、10、20、50、100、200 ng/mL 的標準工作液，按照1.2 步驟測定。以信噪比為3（S/N=3）作為檢出限（LOD），以信噪比為10（S/N=10）作為定量限（LOQ）。結果表明，18 種磺胺類抗菌藥物在5～200 ng/mL 范圍內具有良好的線性關系，相關系數r≥0.9962，方法的檢出限為0.11～0.47 μg/kg，定量限為0.37～1.57 μg/kg（見表2）。

表2 18 種磺胺類抗菌藥物的線性范圍、相關系數、回歸方程、檢出限和定量限Table 2 Linear range, correlation coefficients, regression equations, limits of detection and limits of quantification of 18 sulfonamides

2.3.2 回收率與精密度 按1.2.6 項下方法，向陰性魚肉樣品中分別添加濃度為5、10、50 μg/kg 三水平的回收率試驗，每個添加水平重復測定6次。結果表明，3 個添加水平下鱸魚樣品中18 種磺胺類抗菌藥物的平均回收率為73.30%～116.9%，相對標準偏差為0.29%～7.74%。結果表明該方法回收率和精密度良好，可滿足鱸魚中18 種磺胺類抗菌藥物殘留檢測的需求（見表3）。

表3 18 種磺胺類抗菌藥物在魚肉中的回收率和相對標準偏差（RSD）（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 18sulfonamidesin fish meat (n=6)

續表 3

2.4 實際樣品的測定

采用本研究建立的檢測方法測定當地市售的15 份鱸魚樣品，結果顯示，18 種磺胺類藥物在15 份鱸魚樣品均未檢出。

3 結論

本研究采用新型的增強型脂質去除凈化柱結合高效液相色譜-串聯質譜法以內標法定量，建立了鱸魚樣品中18 種磺胺類藥物殘留的檢測方法。通過對色譜、質譜條件以及提取溶劑和凈化方式的優化，樣品以1%甲酸乙腈提取，采用新型的增強型脂質去除固相萃取柱凈化，可以有效去除脂質和蛋白質等干擾物，有效提高了回收率，達到了更好的凈化效果。該方法操作簡單，無需活化、淋洗和洗脫等過程，在減少有機試劑消耗的同時，省時省力，線性關系良好，回收率和精密度均可滿足檢測分析的需求，適用于以鱸魚為主的多種水產品中磺胺類藥物殘留的檢測分析。