太子參多糖的純化、組成及對LPS 損傷Raw264.7 巨噬細胞的保護作用

謝美林，徐海清 ，李景明，查道喜，王學瑛，陳 洋，朱啟法

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.安徽皖南煙葉有限責任公司，安徽宣城 242000）

太子參是石竹科植物孩兒參Pseudostellaria heterophylla（Miq.） Pax ex Pax etHoffm.干燥后的塊根，具有益氣、健脾潤肺之功效[1]。近30 年，太子參的年需求量表現出強勁的增長趨勢，支撐其市場需求不斷攀升的背后，是太子參較為穩定、溫和的功能性。現有研究表明，太子參有抗腫瘤[2-3]、免疫調節[4-5]、降血糖[6-7]、抗氧化應激[8]、保護心肌[9]等保健功效。目前公認多糖是太子參中最主要的活性物質之一，然而有關太子參多糖的研究大多集中在粗多糖的功能活性評價上，缺乏前期的純化工藝、理化性質研究基礎，其功能、藥理活性的物質基礎和指標性成分不夠明確[10-11]，這給太子參多糖資源的開發和利用帶來了局限。

免疫系統是一個錯綜復雜又重要的生理體系，伴隨著免疫系統的鈍化和免疫應答的失衡，各種疾病接踵而至[12]，通過調節免疫來預防或治療疾病已成為研究熱點之一。已有研究表明太子參在免疫調節方面表現出潛力，陳耀金等[4]利用太子參膠囊粉灌胃小鼠，結果表明其對免疫功能低下小鼠的免疫力有增強效果；并且張炎達等[5]從太子參須獲得的粗提物也表現出顯著改善小鼠免疫功能。由于小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（Raw 264.7）體外培養過程中也具備對抗原的較強吸附與吞噬能力，并釋放相關的免疫調節因子，在一定程度上能夠模擬體內巨噬細胞有關的免疫調節作用，是該類研究中常用的模型細胞[13]。因此，本研究提純了太子參多糖，并測定了太子參多糖的分子量與組成以及初步表征其結構，以此基礎利用Raw 264.7 細胞模型初探了太子參多糖對脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）損傷Raw264.7 巨噬細胞的保護作用，以期促進太子參資源的開發應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

太子參 安徽皖南煙葉公司太子參種植基地提供，采收年份為2019 年，經曬干后直接運回實驗室，于-20 ℃保存留用；小鼠單核巨噬細胞系Raw 264.7中國科學院細胞庫提供；DEAE Cellulose-52 北京拜爾迪生物技術有限公司；單糖標準品（葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、核糖、N-乙酰-氨基葡萄糖、N-乙酰-氨基半乳糖） 上海源葉生物科技有限公司；葡聚糖分子量標準品（1、3、12、70、126、287 kDa）、青霉素-鏈霉素雙抗（100×）、噻唑藍（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）北京索萊寶科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） Sigma 公司；DMEM 高糖培養基美國Gibco 公司；類胎牛血清 美國HyClone 公司。

紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；IR Tracer-10 傅里葉變換紅外光譜儀 島津企業管理（中國）有限公司；U3000 高效液相色譜儀賽默飛世爾科技公司；Agilent 1206 高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；XSP-C204 光學顯微鏡CIC 公司；RT-6100 酶標儀 雷杜生命科學股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 太子參粗多糖的提取 參考Hu 等[14]的方法，并稍作修改：太子參破碎成粉，過40 目篩，以蒸餾水為溶劑，100 ℃水浴提取120 min（1:8，m/v），8000 r/min離心15 min，取上清液備用，殘渣按照相同方法反復提取共3次，合并上清液。旋蒸濃縮、Sevag 法除蛋白后加入無水乙醇配成終濃度為80%的乙醇溶液，于4 ℃條件下沉淀過夜12 h，8000 r/min 離心5 min后，收集沉淀，冷凍干燥，得太子參粗多糖。

1.2.2 太子參粗多糖的純化工藝優化 DEAE Cellulose-52 是一種弱堿性陰離子填料，當粗多糖溶液通過時，中性多糖可以流出，酸性多糖吸附在色譜物質中，從而實現對中性與酸性多糖的有效分離[15]。因此，本研究使用DEAE Cellulose-52 填料進行粗多糖的純化，參考雷思敏等[16]的方法，并稍作修改：以DEAE Cellulose-52 為柱填料，Tris-HCl 緩沖液溶解粗多糖上樣，上樣粗多糖濃度為1 mg/mL，采用NaCl鹽溶液進行洗脫，流速為2.0 mL/min，10 mL/tube 收集，苯酚-硫酸法跟蹤檢測洗脫液，繪制洗脫曲線。

1.2.2.1 pH 的選擇 預實驗測定了緩沖液環境為pH7.2～7.8 的洗脫效果，其中pH7.6 的效果較佳。在預實驗結果的基礎上，準確稱取太子參粗多糖樣品25.0 mg，分別溶于25 mL pH 7.4、7.6、7.8 的Tris-HCl 緩沖液中，0.45 μm 微孔濾膜過濾后緩慢上樣，吸附15 min，用0～0.3 mol/L NaCl 的Tris-HCl 緩沖液洗脫。

1.2.2.2 洗脫鹽濃度的選擇 參考1.2.2.1 中步驟，參數加以修改：pH7.6 緩沖液條件下，分別含0～0.1（0、0.1）、0～0.3（0、0.1、0.2、0.3）、0～0.5（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5）mol/L NaCl 的Tris-HCl 緩沖液梯度洗脫，濃度梯度為0.1 mol/L。

1.2.3 太子參多糖（PHP）的理化特征及結構表征

1.2.3.1 紫外光譜掃描 稱取適量冷凍干燥后的PHP，用去離子水配制成100 μg/mL 的PHP 溶液，在25 ℃，波長190～400 nm 范圍的紫外掃描儀中進行掃描。

1.2.3.2 紅外光譜掃描 稱取2 mg 冷凍干燥后的PHP，與100 mg 經120 ℃烘干4 h 的溴化鉀研磨混合后壓片，在4000～400 cm-1的范圍進行紅外光譜掃描[17]。

1.2.3.3 分子量檢測 采用凝膠滲透色譜（Gel permeation chromatography，GPC）測定PHP 的分子量分布[18]。具體如下：色譜儀為Agilent 1206，選用Agilent PL aquageL-OH MIXED-M 色譜柱（7.5 mm×300 mm,8 μm），檢測器為示差折光檢測器，進樣量為20 μL，流動相為0.1 mol/L NaNO3溶液，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。

1.2.3.4 單糖組成 采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生化結合U3000 高效液相色譜（HPLC）法檢測PHP 的單糖組成。參考戴軍等的方法[19]，并稍作修改。PMP衍生：準確吸取250 μL 混合對照溶液到5 mL EP 管中，加入250 μL 0.6 mol/L NaOH，500 μL 0.4 mol/L PMP-甲醇，70 ℃反應1 h。冷水中冷卻10 min；加入500 μL 0.3 mol/L HCl 中和，再加入1 mL 氯仿漩渦1 min，3000 r/min 離心10 min，小心取上清，萃取3次。上清用HPLC 進行檢測。檢測條件：色譜儀為賽默飛U3000，選用Xtimate C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），進樣量為20 μL，流動相為0.05 mol/L的磷酸二氫鉀溶液:乙腈（83:17），流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為250 nm。

1.2.4 PHP 對Raw 264.7 巨噬細胞的保護作用

1.2.4.1 PHP 對Raw264.7 巨噬細胞的毒性作用濃度 細胞種板、培養參考Lee 等[20]的方法。取對數生長期細胞以1.0×105個/孔接種于96 孔培養板，每孔體積100 μL，37 ℃、5% CO2培養箱中培養12 h，待細胞貼壁后，棄去上清液，分別加入含80、160、320、640、960 μg/mL PHP 的饑餓培養基（含2% 胎牛血清）100 μL，空白對照組為相同體積的饑餓培養基，同一處理設置6 個平行復孔。24 h 后采用MTT法檢測細胞存活率，用酶標儀檢測各孔在492 nm 下的吸光值。

1.2.4.2 PHP 對LPS 誘導傷害的細胞存活率影響LPS 誘導的免疫損傷是研究免疫調節作用的常用模型。參考Jin 等[21]的方法，并稍作修改。取對數生長期細胞1.0×105個/孔接種于96 孔培養板，每孔體積100 μL，37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，待細胞貼壁后，棄去上清液，分別加入含80、160、320、640 μg/mL PHP 的饑餓培養基100 μL，空白對照組和陽性對照組均加入相同體積饑餓培養基。處理4 h后，更換培養液，除空白對照組外均加入含1 μg/mL LPS 的饑餓培養基100 μL，繼續培養20 h。同一處理設置6 個平行復孔，隨后采用MTT 法檢測各孔在492 nm 下的吸光值，計算細胞存活率，并采用光學顯微鏡對培養結束后的細胞形態進行觀察。

式中：A2表示實驗組的吸光值；A1表示對照組吸光值；A0表示空白組吸光值。

1.2.5 太子參多糖的測定 采用苯酚-硫酸法測定太子參多糖[22]。具體如下：準確稱取無水葡萄糖10 mg，用蒸餾水定容至100 mL，搖勻后即得100 mg/L 的葡萄糖標準溶液。分別量取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mL 于試管中，加蒸餾水定容至2 mL。先加入1 mL 5%苯酚，振蕩搖勻后再加入5 mL 濃硫酸，振蕩搖勻后于100 ℃沸水浴中先加熱15 min，后冰浴5 min，于490 nm 波長處測定吸光度。以2 mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白對照。分別以葡萄糖含量（μg）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。太子參粗多糖得率及純度計算公式如下：

式中：m 表示由標準曲線計算出的多糖質量，mg；M1表示提取時太子參粉的質量，mg；M2指太子參粗多糖的質量，mg；n 表示稀釋倍數。

1.3 數據處理

測定結果采用平均值±標準差表示，數據采用SPSS Statistics 23 軟件進行單因素方差分析，采用Excel、Origin 2017 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 太子參多糖的測定

由圖1可知，葡萄糖標準曲線方程為y=0.0067x-0.0667，其R2=0.9987，表明在32～138 μg 的質量范圍內具備良好的線性關系。通過水提醇沉法對太子參粗多糖進行提取，由苯酚-硫酸法檢測得知太子參多糖得率為8.23%±0.78%，多糖純度為51.47%±2.59%。與Hu 等的文獻相比，多糖純度提高了7.07%[14]。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 太子參多糖的純化工藝優化

2.2.1 pH 條件優化 DEAE Cellulose-52 是一種陰離子交換樹脂，在堿性條件下有利于交換發生。基于此，本研究首先對比了太子參粗多糖在不同弱堿性（pH 為7.4、7.6、7.8）環境下的洗脫效果，以確定洗脫液的最佳pH。由圖2可知，該粗提物中性多糖含量高，酸性多糖含量相對較低。并且不同pH 的洗脫液處理時，表現出不同分離效果；當pH 為7.4（圖A）時，前半段分離效果比較好，而后三個峰存在連續拖尾現象；當pH 為7.6（圖B）時，洗脫峰分離度高，無拖尾現象，主要峰的吸光值最高，洗脫效果較好；當pH 為7.8（圖C）時，雖然峰形明顯，但峰形不夠尖銳。因此，選擇pH 為7.6 作為太子參多糖純化的pH 條件。

圖2 不同pH 下的離子交換洗脫曲線Fig.2 Ion exchange elution curve at different pH

2.2.2 梯度洗脫鹽濃度的選擇 進一步對比了不同鹽濃度（0～0.1、0～0.3、0～0.5 mol/L，NaCl）的洗脫液對太子參粗多糖的洗脫效果。由圖3可知，在0～0.1 mol/L 的NaCl 條件下，峰分離度高，但峰數少，具有一定分離效果；在0～0.3 mol/L 的NaCl 條件下，多糖被主要分成5 個峰，其中前3 個分離度好，且吸光值高。在0～0.5 mol/L 的NaCl 條件下，多糖被分成更多級分，但分離度差，拖尾現象嚴重，不利于選擇組分進行收集。因此本實驗選擇0～0.3 mol/L 的NaCl 作為太子參多糖純化的鹽濃度洗脫條件。

圖3 不同洗脫鹽濃度的離子交換洗脫曲線Fig.3 Ion exchange elution curve at different salt concentrations

綜上，以pH7.6 的Tris-HCl 緩沖液上樣，選擇0～0.3 mol/L NaCl 的鹽溶液進行洗脫，收集第1 個主峰，旋蒸濃縮，透析除鹽，冷凍干燥，即得太子參多糖。采用苯酚-硫酸法檢測其純度為80.52%±1.84%，相比于現有文獻，用于功能研究的太子參的多糖提取物，純度提高了17.02%[23]。

2.3 PHP 的結構表征

2.3.1 紫外光譜掃描 如圖4所示，曲線整體呈先上升再下降的趨勢，在210 nm 左右有最大吸收，且吸光值高達2.000，而210 nm 為多糖的特征吸收峰[24]，此處吸光值高說明PHP 的主要成分為多糖。圖中在240～290 nm 處有一個較寬的小吸收峰，吸光值低于0.500。260 和280 nm 分別是核酸和蛋白質的特征吸收波長[25]，這說明純度為80.52%的PHP 的雜質主要可能為蛋白質和核酸。

圖4 PHP 的紫外全掃描圖譜Fig.4 UV spectra of PHP

2.3.2 紅外光譜掃描 紅外圖譜常常用來鑒定多糖的初級結構。在中紅外圖譜解析中，一般將波數4000～1300 cm-1稱為特征區，可以根據分子官能團和基團吸收峰來判斷物質類別。1300～400 cm-1稱為指紋區，可以判斷糖苷鍵類型和構型[26]。

PHP 的紅外掃描圖譜見圖5。圖中3400 cm-1的-OH 伸縮振動峰、2936 cm-1的C-H 鍵的伸縮振動峰和1380 cm-1的C-H 鍵的彎曲振動峰，聯合證明所檢測化合物為糖類化合物[27-29]。在1636 和1424 cm-1分別為-COOH 的非對稱及對稱伸縮振動峰。圖譜在1000～1200 cm-1的三個吸收峰是吡喃環吸收振動引起的，具有C-O-C 骨架[30]，α型的C-H在844 cm-1會有一個吸收峰，而β型的在891 cm-1處有一個吸收峰[31]，圖中在852 cm-1有一個吸收峰，說明含有α-型糖苷鍵。綜上說明PHP 是一種α-吡喃糖。

圖5 PHP 的紅外光譜掃描圖Fig.5 Scanning infrared spectrum of PHP

2.3.3 分子量檢測 多糖的溶解度和粘度受其分子量大小的影響，并且多糖鏈的大小與結構與其生物活性密切相關[30]。以出峰時間（t）為橫坐標，分子量的對數值（lg Mw）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為lg Mw=-1.2807 t+15.374，R2=0.9981。

如圖6所示，PHP 主要被分成3 個峰，其中2 個強吸收峰的出峰時間在9.38 與9.90 min，代入標準曲線計算分子量分別為2.3×103和500 Da。此外，8.13～9.10 min 有1 個較大連續峰，代入標曲后分子量在5.2×103～92×103Da 之間。結合文獻，太子參中多糖的分子量基本在3×103～2.2×105Da 之間[14,32-33]。有研究報道，醇沉的乙醇終濃度不同，所得多糖的分子量會不同[34]，李松法等[35]采用不同濃度的乙醇分級醇沉了黃芪多糖，發現醇沉所得黃芪多糖的分子量隨乙醇濃度的升高而降低。本研究中太子參多糖分子量在500～92×103Da 之間，與現有的太子參多糖的分子量存在差異，這可能是使用80%乙醇濃度醇沉導致的。

圖6 PHP 的分子量分布Fig.6 Molecular weight distribution of PHP

2.3.4 單糖組成檢測 標準單糖出峰時間及順序見圖7。圖8 為PHP 的HPLC 色譜圖，PHP 主要是由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖醛酸組成。郭守斌測定了10 種不同產地太子參的單糖，總結出太子參的單糖組成為半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸，且不同產地太子參多糖中單糖組成略有差異[36]，這與本實驗結果是基本一致的。夏和先等比較了組培太子參和野生太子參的單糖組成，發現其單糖組成基本相同，但單糖的比例明顯不同[37]。葡萄糖與半乳糖是PHP 中最主要的兩種單糖，這與金針菇、杏鮑菇、猴頭菇等食用菌多糖的單糖組成相類似[38]，可能具有與其類似的免疫調節、降血糖血脂、抗疲勞等生理活性[39]。

圖7 單糖混標樣品的HPLC 色譜圖Fig.7 HPLC spectrum of the mixture of monosaccharides

圖8 PHP 的HPLC 圖譜Fig.8 HPLC spectrum of PHP

2.4 PHP 對Raw 264.7 巨噬細胞的保護作用

2.4.1 PHP 對Raw 264.7 巨噬細胞的毒性作用濃度PHP 對 Raw 264.7 巨噬細胞毒性作用結果如圖9所示。PHP 在80～640 μg/mL 范圍內，對Raw 264.7巨噬細胞的存活率具有提升作用，且呈現劑量-反應關系，在添加量為320 μg/mL 時，細胞存活率最大，為111.35%。但是當濃度達到960 μg/mL 后，PHP 對細胞表現出毒害作用，因此，選擇PHP 濃度為80～640 μg/mL 進行下一步實驗。張麗娟等[40]探究了太子參多糖對Raw 264.7巨噬細胞免疫調節作用的影響，結果表明太子參多糖的安全濃度為600 μg/mL，這與本文研究結果相近。研究表明多糖可以通過促進巨噬細胞的增殖，從而增強巨噬細胞的吞噬作用[41]。此外，鐵皮石斛多糖、杏鮑菇等多糖的單糖組成均以葡萄糖、半乳糖、甘露糖為主[38,42]，與本研究中PHP的單糖組成較為一致，且此類多糖均表現出免疫調節活性[42-43]，進一步說明PHP 具備潛在的免疫調節活性。

圖9 PHP 對Raw 264.7 巨噬細胞存活率的影響Fig.9 Effects of PHP on cell viability in Raw264.7 cells

2.4.2 PHP 對LPS 誘導免疫損傷的Raw 264.7 巨噬細胞存活的影響 PHP 對LPS 誘導的免疫損傷下細胞存活檢測結果如圖10所示。與空白組相比，在1 μg/mL 的LPS 的誘導損傷下，細胞相對存活率極顯著降低（P＜0.01），說明本實驗成功建立了免疫損傷模型。不同濃度的PHP 處理后，Raw 264.7 巨噬細胞存活率有一定提升效果；當劑量為640 μg/mL 時，細胞存活率極顯著提高了7.21%（P＜0.01）。這表明太子參多糖對Raw 264.7 巨噬細胞的免疫損傷具有一定緩解作用。

圖10 PHP 對LPS 誘導損傷的Raw264.7細胞存活率的影響Fig.10 Effects of PHP on cell viability in Raw264.7 cells induced by LPS

Raw 264.7 巨噬細胞最好的狀態呈透亮的圓形，細胞吞噬抗原過多、培養環境惡劣都會促使該細胞呈現梭形、長梭形[44]。由圖11可知，空白對照組的Raw 264.7 巨噬細胞呈橢圓或圓形。模型組在LPS 刺激下，細胞發生形態變化，呈菱形、梭形，細胞密度明顯少于空白對照組。陳光勇[45]、鄭勝眉[46]等顯微鏡下觀察Raw 264.7 巨噬細胞時，LPS 處理組同樣出現了數量降低、長梭狀的細胞形變等。加入PHP 的處理組中，細胞形態出現明顯改善，大多細胞呈標準圓形、類橢圓形、紡錘形等，這表明PHP 具有改善Raw 264.7 巨噬細胞形態的作用。

圖11 PHP 對LPS 誘導損傷的Raw 264.7 巨噬細胞形態的影響Fig.11 Effects of PHP on cell morphology in Raw264.7 cells induced by LPS

3 結論

本實驗通過水提醇沉法從太子參中提取了太子參粗多糖，得率為8.23%，純度為51.47%。并采用DEAE Cellulose-52 離子交換柱法純化得太子參多糖（PHP），其純度為80.52%。PHP 是一種α-吡喃糖，分子量在500～92×103Da，主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖及葡萄糖醛酸組成。以LPS誘導的Raw 264.7 小鼠巨噬細胞為模型，PHP 可以提高免疫損傷后的細胞存活率，改善細胞形態，說明了PHP 對由LPS 誘導損傷的Raw 264.7 巨噬細胞有保護作用，初步表明具備體外調節免疫的潛力。