蜂花粉過敏原識別及微生物發酵法降解過敏原的潛在應用研究進展

尹舒婷，姜玉鎖，李強強 ，吳黎明

（1.中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093；2.山西農業大學動物科學學院，山西晉中 030801）

蜂花粉是蜜蜂從植物雄蕊上和裸子植物小孢子囊內采集的花粉粒，經過蜜蜂向其中加入花蜜及唾液腺分泌物而形成的團狀物，既可經脫粉器脫落后，直接或經適當加工后使用，也可由蜜蜂攜帶入巢并釀制成蜂糧后，作為蜜蜂主要的食物來源。蜂花粉以其極為豐富的營養成分在國際上被稱為“完全營養品”。隨著應用范圍的擴大，因食用蜂花粉而產生過敏癥狀的病例逐漸增多，蜂花粉食源性過敏引起的安全問題開始引起人們的關注。然而，近年來國內外關于蜂花粉致敏性的研究多集中于風媒花粉混入的鑒別，關于不同植物來源的蜂花粉其自身存在的致敏原識別與分離鑒定研究尚不完善，致敏性仍是蜂花粉食用安全的重要威脅之一，嚴重制約了蜂花粉安全利用與發展。微生物發酵法在降低食物致敏性方面具有獨特優勢，未來或可適用于降低蜂花粉致敏性。因此，本文對近年來國內外關于蜂花粉致敏性及其過敏原識別的研究現狀進行綜述，并對微生物發酵法降解過敏原的潛在應用進行分析討論，同時對未來通過微生物發酵手段降解或消除蜂花粉中過敏原的研究提出展望。

1 蜂花粉的營養價值與藥用功效

蜂花粉是蜜蜂從植物雄蕊上和裸子植物小孢子囊內采集的花粉粒，經過蜜蜂向其中加入花蜜及唾液腺分泌物而形成的團狀物，既可經脫粉器脫落后，直接或經適當加工后使用，也可由蜜蜂攜帶入巢并釀制成蜂糧后，作為蜜蜂的主要食物來源。蜂花粉以其極為豐富的營養成分在國際上被稱為“完全營養品”。研究表明，蜂花粉中含有200 多種營養成分，包括20 多種游離氨基酸及11%～35%的蛋白質，蛋白質中必需氨基酸含量高于WHO 提出的優質食品氨基酸模式，并且其組成與動物機體中氨基酸的組成極其相似，故蜂花粉擁有極高的食用價值和營養價值[1-3]。此外，蜂花粉中含有大量維生素如VB1、VB2、煙酸、VB6、VH、泛酸、葉酸、VE、肌醇等，以及含有胡蘿卜素，可轉化為VA[4]。花粉中還含有Ca、Na、K、Fe、Mg、Cu、P、S、Se 等60 多種礦物質元素[5]，這些元素構成動物機體組織，維持機體平衡和正常生理活動。蜂花粉中還富含脂類物質，包括月桂酸、十四烷酸、亞油酸和不飽和脂肪酸等，對于機體中物質交換、降低血液中膽固醇濃度、以及治療和預防動脈粥樣硬化等有重要的作用[6-8]。蜂花粉中碳水化合物占25%～48%，主要包括單糖（如葡萄糖和果糖）、雙糖（如麥芽糖和蔗糖）和多糖（如淀粉、纖維素和果膠等），具有增強機體免疫等功效[9-11]。

蜂花粉因其豐富的營養價值、繁多的資源品種、極高的研究潛力，近年來已經成為國內外學者探究的熱點。經過對蜂花粉的深入研究發現其具有極高的藥用功效和食用價值。研究表明，蜂花粉具有較強的抗氧化特性，并且在一定濃度范圍內，蜂花粉中的黃酮含量與自由基清除率呈現正相關[12]，其提取物酚類物質具有較好的DPPH 和ABTS+自由基清除能力[13-14]，而蜂花粉中一些其他物質，如蜂花粉蛋白質也與蜂花粉良好的抗氧化活性有關[15]。蜂花粉對心血管系統有良好的調節作用，可降低血糖血脂、降低血液中膽固醇、預防和治療動脈粥樣硬化[16-19]。蜂花粉還有一定的抗癌抗腫瘤的作用，提高實驗動物機體的免疫力，促使免疫細胞增殖，促進淋巴因子和抗體釋放，抑制細胞異常生長[20-21]。蜂花粉還可防治前列腺疾病，蜂花粉中多種成分通過多途徑、多靶點的機制作用于機體，抑制前列腺增生[22]。

因其擁有諸多營養功效，蜂花粉在畜牧養殖方面也被大量運用。實驗證明，日糧添加蜂花粉飼喂產蛋母雞可提高其產蛋率，降低料蛋比，提高蛋的質量和品質[23]。飼喂肉雞可促進生長，提高肉雞肌肉品質，提高飼料轉化率[24]。飼喂犢牛可使其生長性能提高，飼料中營養轉化率提高[25]。蜂花粉里的多種活性物質可提高畜禽的免疫指數，增強免疫功能[26]。大量實驗證明了蜂花粉作為飼料添加劑的卓越性和可行性，蜂花粉在畜牧養殖業的應用越來越廣泛。

2 蜂花粉過敏原因及過敏原識別

2.1 蜂花粉過敏原因調查

據早期研究報道，約有1/10000～1/20000 的人在食用蜂花粉或蜂花粉制品后會出現輕微過敏癥狀[27]。然而，近年來越來越多的蜂花粉過敏病例被報道出來。Martín 等[28]報道了一例鼻炎患者攝取蜂花粉后發生過敏反應的病例，研究者在蜂花粉中檢測出菊科和薔薇科植物花粉，特異性IgE 測定顯示菊科植物花粉的血清特異性IgE 水平最高，并且由于菊科植物花粉存在交叉反應性，研究者認為過敏反應最可能來源于菊科植物花粉中的過敏原。Jeong 等[29]報道了一例相似病例，研究人員鏡檢蜂花粉后也在其中發現菊科類植物花粉，蜂花粉與菊科類植物同樣具有較強的交叉反應性，但并未有明確證據證明過敏原僅菊類植物花粉，患者可能對蜂花粉和其他植物花粉產生了共敏反應。Nonotte 等[30]報道過一名有艾蒿過敏史的患者因食用混有艾蒿花粉的蜂花粉而引發過敏反應，皮膚點刺試驗表明該患者的皮膚過敏反應與蜂花粉中所含艾蒿花粉的質量成正比。隨后，研究者們對10 名禾本植物花粉過敏患者進行混有玉米花粉的蜂花粉皮膚點刺試驗，患者的皮膚過敏反應與蜂花粉中禾本植物絕對質量成正比。Greenberger 等[31]首次報道了一名接受了過敏原免疫治療并獲得成功的患者，第一次攝入蜂花粉時發生了過敏癥狀，顯微分析發現食用的蜂花粉中含有豚草類和藤本植物花粉，酶聯免疫實驗證明蜂花粉與短豚草和黑麥草花粉之間存在交叉反應性。但諸多實驗未證明摻雜的風媒植物花粉是否為單一過敏原，因此進一步探究蜂花粉中的過敏原組成是十分必要的。

此外，機體本身的狀態發生變化也可能是蜂花粉致敏的原因之一，一例食用蜂花粉后因運動誘發過敏反應的病例，患者此前攝入蜂花粉并無過敏癥狀，他在跑步前食用了蜂花粉補充劑，后劇烈跑步中出現過敏癥狀，皮膚點刺實驗顯示其對蜂花粉補充劑為陽性，推測是蜂花粉中存在豚草花粉或其他雜草花粉。運動誘發過敏的機制可能是運動增加腸胃通透性或滲透效應來降低肥大細胞脫粒的閾值[32]。Akiyasu等[33]報道了首例攝入含蜂花粉的營養補充劑后發生急性腎衰竭的病例，該病人無過敏史和其他病癥，食用營養補充劑五個月后出現急性腎衰竭癥狀，研究者通過藥物淋巴細胞刺激試驗（DLST）排除補充劑中另一成分諾麗果的作用，活檢顯示腎小球無增生，散在白細胞尤其是嗜酸性粒細胞間質發生彌漫性纖維化和細胞浸潤，認為蜂花粉導致了藥物性腎臟疾病。由于此前并無此類病例的報道，關于蜂花粉副作用的信息不準確，因此攝入之前應該有相應風險評估和提醒[34]。

而部分學者則發現，蜂花粉中含有黃酮類和脂類成分具有抗過敏作用。Medeiros 等[35]將蜂花粉中酚提取物（BPPE）中的黃酮類化合物作用于卵清蛋白誘導的小鼠過敏模型，分析小鼠免疫參數，發現BPPE抑制了足爪水腫和特異性抗體IgE、IgG1的產生、降低了支氣管液中白細胞的總數和促紅細胞生成素的水平，抑制細胞向肺腔遷移，降低小鼠過敏性休克引起的死亡率。得出結論，蜂花粉中黃酮類成分對改善變態反應是有效的，具有抗過敏作用。另有實驗發現，小鼠每日口服蜂花粉可降低特異性抗體IgE 的產生，同時也發現蜂花粉中的脂溶性成分可通過抑制Fc?RI 介導的肥大細胞激活發揮抗過敏作用[36]。盡管蜂花粉中含有黃酮類和脂類抗敏性成分，但蜂花粉致敏問題仍然是影響蜂花粉食用安全和制約開發利用的重要共性難題。

由此可見，蜂花粉致敏的主要原因可歸結為以下四點：a.具有過敏史或過敏體質人群在食用蜂花粉后易產生過敏風險；b.蜂花粉中若混入致敏性風媒花粉可能導致食用人群產生過敏反應；c.對于無過敏史或非過敏體質人群來說，若機體免疫狀態發生了變化，在食用蜂花粉后仍存在致敏風險；d.蜂花粉中混入的致敏性風媒花粉并非唯一過敏原，蜂花粉本身也可能存在多種致敏成分。然而，目前關于蜂花粉本身過敏原的研究十分有限，使對蜂花粉的質量安全控制及進一步開發利用難度增加。

2.2 蜂花粉過敏原識別

目前國內外諸多研究認為，絕大多數蜂花粉引起的過敏反應是由致敏性風媒花粉，如豚草等禾本植物花粉，及樺樹等木本植物花粉中過敏原的混入導致的。花粉過敏原通常是分子量為10～70 kDa 的糖蛋白或水溶性蛋白質[37]，并且不同植物來源的花粉中致敏蛋白的種類和數量有所不相同。近年來，科學家利用免疫印跡法（Western-blotting）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）等已從豚草花粉中鑒定提取出12 種過敏原[38-39]，從樺樹花粉中鑒定出7 種過敏原[40]（見表1），這為蜂花粉后續過敏原研究提供了一定的科學依據。

表1 豚草花粉（Ambrosia artemisiifolia）和樺樹花粉（Betula verrucosa）中已鑒定出的過敏原[38,40]Table 1 Identified allergens in Ambrosia artemisiifolia and Betula verrucose pollens[38,40]

蜂花粉中除了致敏性風媒花粉的混入導致易感人群產生過敏反應外，其自身植物源花粉同樣存在致敏風險。以我國最大宗蜂花粉——油菜蜂花粉為例，其自身植物源花粉（油菜花粉）也存在多種過敏原[41-42]。Puumalainen 等[41]利用SDS-PAGE、酶聯免疫法（ELISA），并結合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術（MALDI-TOF）從芥菜型油菜（Brassica juncea）、甘藍型油菜（Brassica napus、Brassica oleifera）、白菜型油菜（Brassica rapa）花粉中鑒定出6 種過敏原（見表2）。Singh 等[42]利用SDS-PAGE 結合ELISA和免疫印跡法（Western blot）從白菜型油菜（Brassica campestris）、甘藍型油菜（Brassica napus）、芥菜型油菜（Brassica juncea）和黑芥（Brassica nigra）花粉中測定出分子量為15～90 kDa 的8 種致敏蛋白質，但并未鑒定出其致敏蛋白的氨基酸序列而無法進一步研究其致敏屬性。近期，筆者團隊基于蛋白質組學分析技術，從油菜蜂花粉中檢出了一種已知的油菜花粉過敏原即Polcalcin（Bra r 5），而其余5 種已知過敏原尚未檢出。但基于與其他植物中致敏蛋白（如Profilin 家族、Oleosin 家族等）同源序列比對后發現，油菜蜂花粉中仍存在諸多同源性較高的未知潛在過敏原。此外，不同植物來源蜂花粉中過敏原種類和數量均有不同。目前國內外對蜂花粉自身植物源花粉的過敏原研究尚不完善。基于以往對致敏性風媒花粉過敏原研究技術，未來可對不同植物來源蜂花粉的過敏原識別進行更深入的探索。

表2 油菜花粉中已鑒定出的過敏原[41]Table 2 Identified allergens in Brassica napus pollen[41]

3 微生物發酵干預食物致敏性研究

諸如蜂花粉等食物類引起的食源性過敏已經成為亟待解決的全球性問題，如何使用安全衛生科學有效的手段降低食物致敏性是學者們近年來關注的熱點。為此科學家們提出許多加工手段以期從食物本身源頭性降低致敏威脅[43]。其中發酵法在降低食物致敏性中具有獨特的優勢，它通過微生物代謝水解蛋白質過敏原[44]。同時，發酵提高了食品原料的營養價值和理化性質[45-46]。不少研究使用微生物發酵法將食物中的致敏蛋白分解變性，以達到降低或消除過敏原的目的，而不同食物選用合適的菌種、溫度、配比和時間可將致敏性降至較低水平甚至消除。微生物發酵技術在之前的研究中曾被用于改善蜂花粉的口感、風味和營養價值[47]，但目前并未研究其是否作用于蜂花粉過敏原的降解。

由于蜂花粉來源于植物花粉，蜂花粉中部分致敏蛋白與植物類食物中致敏蛋白存在共性。筆者團隊目前的關于蜂花粉過敏原的研究中發現蜂花粉中致敏蛋白主要來源于Profilin、Oleosin 等家族（數據尚未公開發表）。而植物類食物中的一部分致敏蛋白同樣來源于這些致敏家族，致敏蛋白之間存在一定的同源性和氨基酸序列相似性。因此，利用微生物發酵改善植物類食物的食源致敏性可為微生物發酵改善蜂花粉致敏性的研究提供依據。以下將對一些較普遍的植物類致敏性食物中過敏原的微生物發酵降解技術進行概述與分析，希望從中找到微生物發酵降解食物過敏原的共性與規律，為后續微生物發酵降解蜂花粉中過敏原的方法開發提供技術支持。

3.1 微生物發酵降解花生中的過敏原

關于花生中的致敏蛋白目前已發現17 種（見表3），包括Ara h1～Ara h18（Ara h4 更名為Ara h3.02）[48]，其中Ara h1、Ara h2、Ara h3 和Ara h6 為主要致敏蛋白，可引起大部分敏感人群產生過敏反應[49]。周陽[50]利用間接酶聯免疫法檢測發酵對花生蛋白致敏性的影響，研究發現，使用枯草芽孢桿菌發酵花生樣品在前8 h 樣品與IgE 結合能力緩慢上升，而8 h 后則顯著下降，至44 h 時，樣品與IgE 結合能力降為0，Ara h1蛋白含量為0，很可能使花生完全脫敏；使用納豆芽孢桿菌發酵樣品，44 h 內與IgE 結合能力逐漸下降，但降低幅度有限，最多降低48%，納豆芽孢桿菌發酵也能使Ara h1 蛋白含量顯著下降。皮瀟文[51]將花生漿樣品高溫蒸汽處理后用納豆芽孢桿菌發酵，花生樣品的總體致敏性最高可降低77.3%，納豆芽孢桿菌發酵可產生大量蛋白酶，將花生中大部分致敏蛋白分解為小分子，而無法完全消除可能是因為小分子物質仍保留特異性IgE 結合位點。花生中存在來自Profilin家族和Oleosin 家族的致敏蛋白，與筆者團隊所研究得到的蜂花粉中潛在的致敏蛋白具有同源性，因此以上對花生中致敏蛋白的降解方法可能適用于蜂花粉中的致敏蛋白，具體發酵工藝及降解機制需進一步探究。

表3 花生中已鑒定出的過敏原[48]Table 3 Identified allergens in peanut[48]

3.2 微生物發酵降解豆類中的過敏原

大豆營養豐富，蛋白質的氨基酸組成和動物蛋白質相似，氨基酸比例接近人體，易于機體消化吸收，是重要的糧食作物之一，同時也是目前八大致敏食物之一，大豆中目前鑒定出16 種抗原蛋白，IUIS 命名的有8 種（見表4），主要過敏原為兩種儲藏蛋白即大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白[52-53]。豆粕是大豆抽取豆油后的產物，豆粕中存在大豆過敏蛋白，影響機體對豆粕中營養物質的吸收和利用，發酵法是豆粕加工中常用的方法，而多菌種混合發酵更優于單菌種發酵[54]。賴晗等[55]用枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和酵母菌混合發酵，混合比例為2:1:1，溫度30 ℃，接種量為發酵物總量的12%，優先將枯草芽孢桿菌發酵24 h 后加入干酪乳桿菌和乳酸菌繼續發酵48 h，SDSPAGE 電泳評估顯示豆粕中致敏蛋白含量顯著降低。Yang 等[56]使用同樣的發酵方法，豆粕樣品與IgE 結合能力顯著降低，研究者認為微生物使大豆蛋白降解為低分子多肽，破壞致敏蛋白序列，從而降低其致敏性。大豆中存在來自Profilin 家族的致敏蛋白，與蜂花粉中致敏蛋白具有同源性，因此在未來研究中可借鑒上述發酵工藝用以降解蜂花粉中的致敏蛋白。

表4 大豆中已鑒定出的過敏原[52-53]Table 4 Identified allergens in soybean[52-53]

3.3 微生物發酵降解小麥中的過敏原

小麥致敏較復雜，不同的小麥品種過敏原不同，致敏機制不同，而引起的癥狀也不同，小麥中蛋白按溶解度的不同分為四類：清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和麥谷蛋白，是小麥過敏原的來源[57]。IUIS 命名的過敏原有28 種（見表5），其中Tri a 19 是小麥主要過敏原，Tri a 14 可引起面包師哮喘癥，Tri a 25 是一種硫氧化蛋白，雖然被IUIS 命名委員會收錄為過敏原，但有研究表明，硫氧化蛋白可緩解過敏反應，因此Tri a 25 的過敏原性存在一定爭議[58]。李璽等[59]用酵母菌發酵面團，發酵初期面筋蛋白交聯結構改變，二硫鍵含量降低，過敏原性增加，隨著時間的延長，發酵產生的酒精溶解大量醇溶蛋白，以及蛋白酶分解面團中蛋白，小麥結構被破壞，致敏性降低。Carlo 等[60]探究酵母乳酸菌水解小麥和黑麥過敏原的能力，研究發現發酵導致樣品面包中與IgE 結合的低分子量蛋白/多肽的含量顯著減少，推測是發酵產生的消化酶將IgE 結合蛋白水解，使小麥致敏性下降。小麥中存在來自Thioredoxin 家族、Profilin家族的致敏蛋白，與蜂花粉中致敏蛋白具有同源性，因此以上對小麥中致敏蛋白的發酵降解工藝可為后續開發蜂花粉致敏蛋白的降解技術提供參考。

表5 小麥中已鑒定出的過敏原[54-55]Table 5 Identified allergens in wheat[54-55]

4 展望

蜂花粉具有極高的營養價值和藥用功效，然而蜂花粉致敏問題成為威脅其食用安全的主要因素之一。國內外學者對蜂花粉致敏性研究目前多集中于風媒花粉混入的鑒別中，而關于不同植物來源的蜂花粉中過敏原的識別研究尚不完善，嚴重制約蜂花粉的質量安全控制與深加工利用。加強蜂花粉中過敏原的分離鑒定，深入研究其致敏機理，可為蜂花粉脫敏技術開發提供理論基礎。

微生物發酵技術作為一種安全健康有效的食品加工技術，目前已廣泛應用于諸多過敏食物的致敏蛋白降解中，并且已經取得了較為可觀的成效。芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌等多用于發酵植物類食物，降解其過敏原，降低致敏性。蜂花粉中存在與其他植物類食物（如花生、大豆、小麥等）相同致敏家族的過敏原，如Profilin 家族、Oleosin 家族、Thioredoxin 家族等，因此植物類致敏蛋白與蜂花粉致敏蛋白之間存在一定的同源性與氨基酸序列相似性。通過微生物發酵降解植物類食物中過敏原的研究，可為后續開發利用微生物發酵降解蜂花粉中過敏原的技術提供一定的依據與指導。在未來研究中，建立降低或消除蜂花粉過敏原的微生物發酵法，以及探究微生物發酵對蜂花粉中過敏原的降解機制，將對蜂花粉的安全利用發揮重要作用。