紫花苜蓿品種苗期耐鹽性分析及評價指標篩選

余如剛， 王雪茄， 王國良， 徐智明， 高晴晴， 杜雪玲， 張宇龍

(1. 淮北師范大學生命科學學院， 安徽 淮北 235000； 2. 山東省農業科學院休閑農業研究所， 山東 濟南 250010；3. 秋實草業有限公司， 安徽 五河 233300； 4.安徽省農業科學院， 安徽 合肥 230031)

土壤鹽漬化面積逐年增加已成為全球范圍內的農業生態環境問題之一[1]。鹽脅迫負調控植物的生長過程，包括植物的光合作用、呼吸作用及新陳代謝發生等，從而抑制植物的生長，甚至導致死亡[2-3]。提高鹽漬化土壤的利用率已成為緊迫的全球性生態環境關注熱點。前人研究發現，種植耐鹽性較高植物不僅可以利用鹽漬化土壤，而且也提高土壤修復能力[3-4]。因此，篩選和開發更多耐鹽植物種質資源是利用和治理鹽漬化土壤的有效生物方法。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)屬豆科蝶形花亞科苜蓿屬的多年生優質牧草，富含粗蛋白質、維生素和多種礦物質元素，被譽為“牧草之王”，并具有適應性和抗逆性強等特點。隨著我國膳食結構的轉變，肉、蛋和奶等動物源食品逐漸成為食物的重要組成部分，隨之而來對養殖所需的優質牧草，特別是紫花苜蓿的需求量也大幅增加。然而，目前國產苜蓿無法滿足國內市場需求，仍需大量進口國外苜蓿。同時，國內有限的耕地資源在保障口糧供給的基礎上，難以用于大規模種植苜蓿，成為制約苜蓿產業發展的重要因素。研究發現，紫花苜蓿與其他牧草相比，具有較高的耐鹽性和改良土壤鹽漬化的作用[5-6]，是一種理想的修復和利用鹽漬化土壤的首選植物。但是，紫花苜蓿是同源四倍體，具有很高的遺傳復雜性，不易培育新品種，且不同品種間耐鹽性存在顯著差異[7-11]。因此，在有限的耕地資源條件下，挖掘紫花苜蓿本身耐鹽性強的種質資源，篩選和培育耐鹽紫花苜蓿品種，不僅能有效改良和利用鹽漬化土地，而且有利于促進畜牧業發展。此外，不同的紫花苜蓿品種在不同的生育期對鹽脅迫的耐性具有顯著差異，幼苗期是其對鹽脅迫較為敏感的時期之一[12]。由于植物對鹽的耐受性是一個復雜的綜合性狀，因此，近年來耐鹽種質資源篩選的方法多基于多指標綜合評價方法，包括主成分分析法、隸屬函數法和回歸分析等多元分析方法[13-14]。本試驗以17個形態和生理指標的耐鹽系數為基礎，在NaCl脅迫下，通過多元分析方法對20個紫花苜蓿幼苗的耐鹽特性進行綜合評價，根據測定指標與耐鹽特性的關系建立紫花苜蓿幼苗期耐鹽評價數學模型，以期為耐鹽紫花苜蓿種質資源評價及新品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗材料由山東省農業科學院休閑農業研究所、秋實草業有限公司、北京克勞沃生態科技有限公司和北京陽光綠地生態科技有限公司提供，共計20個紫花苜蓿品種(表1)。

表1 供試紫花苜蓿品種及來源Table 1 The origins of M. sativa L. varieties in test

1.2 試驗設計

盆栽試驗于2020年9—11月在淮北師范大學園藝專業實訓基地進行。挑選大小一致的種子，置于鋪兩層濾紙培養皿中，暗培養4天后，將已發芽且長勢一致的紫花苜蓿轉移至口徑13 cm高12 cm的營養盆中。為避免在收苗時傷害到幼苗的根系，采用清洗干凈的河沙作為培養基質，曬干河沙1.2 kg/盆。移苗后每間隔1 d澆100 mL自來水。出現真葉時，每間隔1 d澆100 mL霍格蘭營養液；每盆留長勢一致的幼苗10株。緩苗生長2周后進行鹽脅迫，共設置3個處理：無NaCl的霍格蘭營養液(對照)、150 mmol·L-1和300 mmol·L-1NaCl濃度的霍格蘭營養液處理；其后，每間隔1 d澆含不同濃度NaCl(0,150和300 mmol·L-1)的霍格蘭營養液100 mL。試驗期間每盆添加營養液均為上午和下午各50 mL。每品種各處理設3個生物學重復。鹽處理5周后，統計成活率，并分別取根、莖和葉樣品進行形態和生理指標測定。

根據觀察不同濃度NaCl處理下紫花苜蓿形態特征，發現JG,GN3和ST在300 mmol·L-1NaCl處理5周后植株葉片萎蔫，有的甚至死亡。因此，本研究僅以150 mmol·L-1NaCl處理下各指標評價不同品種紫花苜蓿的耐鹽特性。

1.3 指標測定

1.3.1形態指標測定 鹽處理5周后從每盆隨機選取3株長勢一致的幼苗，用直尺測量基質表面到植株最頂部的距離作為株高(PH)；取樣時，每盆取3株，將根、莖和葉分開，利用直尺測量最長根長(LRL)；通過人工計數單株葉片數(LN)；分別稱量莖鮮重(SFW)、葉鮮重(LFW)和根鮮重(RFW)；然后，放于105℃烘箱中殺青1 h，再在70℃條件下烘干至恒重，分別稱量莖干重(SDW)、葉干重(LDW)和根干重(RDW)。其他生長指標計算公式如下：

地上部鮮重(AFW)=莖鮮重+葉鮮重

總鮮重(TFW)=莖鮮重+葉鮮重+根鮮重

地上部干重(ADW)=莖干重+葉干重

總干重(TDW)=莖干重+葉干重+根干重

1.3.2生理指標測定 以葉片為研究對象，分別測定對照和150 mmol·L-1NaCl處理下各項生理指標。丙二醛含量的測定參照張志良等的方法[15]。葉綠素含量采用手持葉綠素儀SPAD-502Plus進行測定；光合熒光參數F0和Fm采用FluorPen手持式葉綠素熒光儀進行測定，進一步計算可得量子產額，表示光系統Ⅱ的效率，等于Fv/Fm(暗適應狀態)或Yield(光適應狀態)。

Fv/Fm= (Fm-F0)/Fm

Yield=(Fm′-F0′)/Fm′

1.4 綜合評價及數據分析

利用Microsoft Excel 2010進行原始數據處理。采用IBM SPSS 25.0軟件進行主成分分析、相關性分析、聚類分析和逐步回歸等分析。具體指標計算如下[13-14]：

(1)測定指標的耐鹽系數

各單項指標的耐鹽系數(STC)=
鹽脅迫處理測定值/對照處理測定值

①

(2)不同紫花苜蓿品種各綜合指標的隸屬函數值U(Xi)

②

式中，Xi表示第i個綜合指標；U(Xi)表示第i個綜合指標的隸屬函數值，Xi max和Xi min分別表示20個品種中第i個綜合指標的最大值和最小值。

(3)不同基因型紫花苜蓿品種綜合指標的權重(Wi)

③

式中，Wi表示第i個綜合指數的相對重要性，即第i個綜合指數的權重，Pi表示第i個綜合指數的貢獻率。

(4)不同基因型紫花苜蓿品種的綜合耐鹽性評價值

④

式中，D值為各紫花苜蓿品種在鹽脅迫條件下由綜合指標評價分析后獲得的耐鹽性綜合評價值。為了獲得各紫花苜蓿品種更科學合理的耐鹽類別，利用最小距離準則對綜合評價D值進行系統聚類分析。同時，為了分析各單項指標與耐鹽性之間的關系，篩選準確的耐鹽鑒定指標，探討可用于預測紫花苜蓿耐鹽性評價的數學模型，將各指標的脅迫耐性系數與D值進行相關性分析，以顯著相關指標(P<0.05或P<0.01)的脅迫耐性系數作為自變量，綜合評價值(D值)作為因變量進行逐步回歸分析，建立最佳評價數學模型。

2 結果與分析

2.1 紫花苜蓿品種幼苗存活率分析

存活率一般是鑒定植物耐鹽性的一個重要指標。本研究發現在對照和150 mmol·L-1NaCl處理下，各品種存活率均接近100%。因此，本試驗僅統計300 mmol·L-1NaCl處理下各品種的存活率。由圖1可知：存活率大于60%的品種有GN5,XL,JNG,TG,JN和JS；存活率在60%～40%的品種有JN995,ADN,GN9,HG,POW,SG,JN801,JL,SH和LS；存活率在40%～20%的品種有JG和INS，存活率小于20%的品種有ST和GN3。由此，我們推測GN5,XL,JNG,TG,JN和JS為耐鹽品種，ST和GN3高感品種。

圖1 300 mmol·L-1 NaCl處理下20個紫花苜蓿品種幼苗存活率Fig.1 Seedling survival rate of 20 M. sativa L. varieties under 300 mmol·L-1 NaCl treatment.

2.2 各單項指標的耐鹽系數及相關性分析

耐鹽系數能夠較好顯示各指標在處理與對照條件下比較的結果。由表2可知：各單項指標的耐鹽系數在20個紫花苜蓿品種間變化顯著。變異范圍為8.90%～78.90%，其中，丙二醛的變異系數最大，變異系數較大的為莖鮮重、葉鮮重、地上部鮮重、葉片數和總鮮重指標，說明鹽脅迫對這些指標的影響較大。不同紫花苜蓿品種經鹽處理后，13個形態指標值：株高、最長根長、根鮮重、莖鮮重、葉鮮重、地上部鮮重、總鮮重、根干重、莖干重、葉干重、地上部干重、總干重和葉片數與對照比均有所下降(STC<1)，說明各品種在鹽脅迫下生長均受到不同程度抑制。鹽處理后生理指標值與對照比則在不同品種中呈不同程度的變化(STC>1或STC<1)。NaCl脅迫下各單項指標的變化幅度不同，依據任何一個單項指標均難以準確、直觀地評價其耐鹽性，因此，需要多指標綜合評價。

表2 150 mmol·L-1 NaCl處理下20個紫花苜蓿品種測定指標的耐鹽系數Table 2 The salinity tolerance coefficients of tested indices of 20 M. sativa L. varieties under 150 mmol·L-1 NaCl treatment

從17個單項指標耐鹽系數的相關性分析來看：除了株高、丙二醛含量和黑暗下量子產額外，其他每一個單項指標至少與其他1個或1個以上的單項指標顯著或極顯著相關，其中，最長根長與莖干重、總干重、葉綠素呈顯著性正相關，根鮮重與莖鮮重、葉鮮重、地上部鮮重、總鮮重、莖干重和總干重等呈顯著性相關，莖鮮重與葉鮮重、地上部鮮重、總鮮重、莖干重和總干重等呈顯著性相關(表3)。從上述分析得知，這些單項指標之間的相關性，導致提供的評價信息發生重疊，從而影響了各紫花苜蓿品種耐鹽性的篩選與鑒定。

表3 150 mmol·L-1 NaCl處理下紫花苜蓿幼苗各單項指標的相關系數矩陣Table 3 Correlation matrix of each single index of M. sativa L. seedlings under 150 mmol·L-1 NaCl treatment

2.3 耐鹽系數的主成分分析

以不同紫花苜蓿品種各單項指標的耐鹽系數為基礎，利用SPSS 25.0軟件計算各主成分的特征向量和貢獻率，并根據各特征向量的絕對值將不同指標劃分到不同的主成分之中。同一指標在各因子中的最大絕對值所在位置即為其所屬主成分。由表4可知：所轉換的前5個綜合指標(CI)的貢獻率分別為53.40%，10.66%，8.58%，7.35%和7.08%，被分別定義為第1(CI1)至第5(CI5)主成分，累計貢獻率達到87.07%，表明這5個綜合指標能代表17個單項指標攜帶的絕大部分信息，因此，可以用這5個主成分指標對20個紫花苜蓿品種耐鹽性進行分析。

表4 各綜合指標的特征向量及貢獻率Table 4 Eigen vectors and percentage of accumulated contribution of comprehensive index

2.4 紫花苜蓿苗期耐鹽性的綜合評價

2.4.1隸屬函數分析 利用公式(2)，求出不同紫花苜蓿品種各綜合指標的隸屬函數值(表5)。對于同一綜合指標如CI1而言，鹽處理下，GN5的U(X1)值最大，為1.0000，表明GN5在CI1綜合指標中耐鹽性最強，而LS的的U(X1)值最小，為0.0000，表明其該綜合指標上耐鹽性最弱。

表5 不同苜蓿品種綜合指標隸屬函數分析Table 5 Subordinate function analysis of comprehensive index in different M. sativa L. varieties

2.4.2耐鹽性的綜合評價及聚類分析 利用公式(3)，計算5個綜合指標的權重，分別為0.6133,0.1224,0.0986,0.0844和0.0813(表5)。利用公式(4)，求出不同紫花苜蓿品種的耐鹽性綜合評價值(D值)(表5)，依據D值對不同紫花苜蓿品種的耐鹽性強弱進行排序，D值最高的為GN5(0.8269)，表明其耐鹽性最強；D值最低的為LS(0.1400)和HG(0.1447)，表明其耐鹽性最弱。對D值進行系統聚類分析，20個紫花苜蓿品種分為5類：高度耐鹽類型(GN5)、耐鹽類型(SH,ADN,ST,TG,SG,JL和JN801)、中度耐鹽類型(JS,INS,POW和JNG)、鹽敏感類型(JN,JN995,GN9,GN3,XL和JG)和高敏感類型(HG和LS)(圖2)。

圖2 20個紫花苜蓿品種D值聚類樹狀圖Fig.2 The deprogram of clusters for 20 M. sativa L. varieties based on D value

2.5 回歸分析及耐鹽鑒定指標的選擇

為分析各單項指標與耐鹽性之間的關系，篩選出可靠的耐鹽鑒定指標，探討可用于耐鹽性評價的數學模型，以耐鹽性綜合評價值D值作為因變量，以與D值顯著相關的指標：根鮮重、莖鮮重、葉鮮重、地上部鮮重、總鮮重、根干重、葉干重、地上部干重、總干重、葉片數、葉綠素和光照下的量子產額為自變量進行線性逐步回歸分析(表6)，建立耐鹽評價數學模型：D′=-0.284+1.342×ADW+0.182×LN (R2=0.967，P=0.001)，并篩選出2個指標對紫花苜蓿苗期耐鹽性有顯著影響，分別為地上部干重和葉片數。利用該數學模型對20個紫花苜蓿品種進行綜合評價，平均估算精度為93.35%(表7)。

表6 逐步線性回歸分析結果Table 6 The results of stepwise linear regression analysis

表7 回歸方程的估計精度分析Table 7 Analysis of evaluation accuracy of equation

3 討論

紫花苜蓿是牲畜均喜食的優質牧草，但中國耕地資源緊缺，次生鹽漬化耕地面積逐年增加，有限的耕地資源在保障口糧供給的基礎上[16]，難以用以大規模種植紫花苜蓿。但是紫花苜蓿具有一定的耐鹽能力，因此，篩選和開發更多的優質耐鹽紫花苜蓿品種不僅有利于鹽堿地的有效利用，而且對畜牧業發展起到一定的助力作用。

植物生長易受鹽脅迫的抑制，已有研究表明，鹽脅迫指的主要是含有NaCl和Na2SO4的鹽漬土，其中，NaCl是鹽漬土組成中含量最大，遷移能力最強，最活躍的鹽分之一[17]，因此，本研究以NaCl作為鹽處理具有一定的合理性和代表性。紫花苜蓿的耐鹽篩選已有研究，Maas和Hoffman[18]報道紫花苜蓿苗期產量在8.9 dS·m-1(≈ 97 mmol·L-1NaCl)時下降50%。李明雨等[19]認為1.2%(≈205 mmol·L-1)NaCl濃度為苜蓿耐鹽性鑒定的適宜濃度。基于以上，為了篩選高度耐鹽紫花苜蓿品種，本研究設置3個NaCl(0，150 和300 mmol·L-1)處理水平，其中，300 mmol·L-1NaCl脅迫下，各品種植株均出現不同程度萎蔫和死亡現象，有些評價指標難以測定，因此，最終選擇150 mmol·L-1NaCl作為本研究的篩選濃度。不同的紫花苜蓿品種間耐鹽性差異很大，不同生育時期的耐鹽性也不盡相同，幼苗期是紫花苜蓿對鹽脅迫較為敏感的時期[12]。鹽脅迫對不同苗期指標的影響也不盡相同。目前紫花苜蓿苗期耐鹽性篩選指標并沒有統一的標準，但有研究表明，鹽脅迫下株高和生物量在紫花苜蓿各品種間差異很大，可以作為指示紫花苜蓿苗期鹽脅迫響應的指標[12,19]；張則宇等[20]對59份紫花苜蓿品種進行苗期耐鹽篩選，結果發現鹽脅迫下苗期的葉面積、葉綠素熒光、葉綠素含量和根冠比可作苗期耐鹽性鑒定指標。田小霞等[21]通過葉綠素含量、單株綠葉數、苗高和葉片相對電導率等4個指標以及Yu等[13]通過地上部鮮重、地上部干重、鮮重根冠比和K+/Na+等4個指標建立數學評價模型，為篩選紫花苜蓿耐鹽性提供了評價指標。同時，已有研究表明作物耐鹽性篩選中，任何單一指標均不能準確、直觀地評價其耐鹽性，因此需要多指標來全面的進行紫花苜蓿耐鹽性評價。研究顯示利用主成分分析、隸屬函數法及回歸分析等多元分析方法已成為作物耐鹽性品種篩選的一種可靠、有效的方法[13,20-23]。本研究選擇13個形態指標和4個生理指標進行測定，并運用多元分析方法對20份紫花苜蓿苗期耐鹽性進行綜合評價。

耐鹽系數顯示了對照和鹽處理品種在各項指標上的比較結果，它通常被用作評價作物耐鹽性的標準[7,9,13,20-23]。本研究以17個單項指標的耐鹽系數為基礎，利用主成分分析，將17個單項指標轉換為5個相互獨立的綜合指標，并得到不同品種紫花苜蓿苗期的耐鹽性綜合評價值(D值)，依據D值進行聚類分析，較為客觀地篩選出1個高度耐鹽、7個耐鹽、4個中度耐鹽、6個鹽敏感和2個高度鹽敏感紫花苜蓿品種。該結果與依據300 mmol·L-1NaCl脅迫下單一存活率指標的推測結果不一致，說明不能以單項存活率指標來進行紫花苜蓿耐鹽性評價。同時，有3個品種GN3,XL和HG的評價結果與張則宇等[18]的研究結果相同，均為不耐鹽類型。此外，通過逐步回歸法建立了紫花苜蓿苗期耐鹽性預測數據模型，該模型平均估算精度為93.35%，可用于篩選紫花苜蓿幼苗階段不同品種的耐鹽性。

4 結論

本研究將供試的20份紫花苜蓿品種分為高度耐鹽(1個)、耐鹽(7)、中度耐鹽(4個)、鹽敏感(6個)和高度鹽敏感(2個)5個類型，其中GN5為高度耐鹽型、SH為耐鹽型、LS和HG為高度鹽敏感型紫花苜蓿。建立了紫花苜蓿幼苗耐鹽性評價數學模型D′=-0.284+1.342×ADW+0.182×LN (R2= 0.967，P= 0.001)，篩選出地上部干重和單株葉片數為紫花苜蓿苗期耐鹽性鑒定指標。研究結果將為紫花苜蓿耐鹽品種資源鑒定及良種選育提供科學支持。