添加Maillard反應前體物質對混有椴木屑暗棕壤腐殖質組成的影響

王 楠， 邵澤強， 馬 超， 吳柏恩， 馬 余， 王 帥

(吉林農業科技學院 農學院， 吉林 吉林 132101)

腐殖質(HS)是土壤有機質的主體部分， 是源于自然界的各類前體物質在微生物作用下經過一系列生物化學反應形成的、 具有多相分布且結構復雜的一類高分子化合物[1]. Maillard反應以游離氨基和糖類的胺醛縮合開始， 伴隨一系列縮聚聚合和環化反應， 最終生成暗色且難以生物降解的高分子有機物， 盡管結構不同于HS[2]， 但Maillard反應前體物質對HS的形成有重要貢獻. 通常經過兩個階段形成HS： 第一階段為HS前體物質的生成階段， 即有機質分解形成HS的中間產物， 如多酚、 氨基酸、 多糖和還原糖等過程； 第二階段為前體物質聚合形成HS的階段， HS前體物質在微生物作用下， 通過多酚理論、 Maillard反應等途徑聚合形成HS[3]， 其中最關鍵反應為多酚的氧化縮合， 即通過微生物酶的氧化縮合作用， 以多酚、 糖類和氨基酸類小分子為起始物， 通過多酚-Maillard反應路徑促進HS形成. 因此， 添加Maillard反應前體物質可促進腐殖化進程， 對HS形成有一定的激發效應[4].

自然界中的木質素儲量豐富， 其降解與HS形成關系密切[5]， HS的芳香性主要源自木質素， 木質素和蛋白質可結合形成木質素-蛋白質復合體， 這是HS的核心[6]， 可見木質素對HS形成的貢獻遠大于纖維素， 但木質素的腐殖化進程較緩慢， 導致秸稈還田培肥效果欠佳以及堆肥腐熟周期過長. 因此， 研究Maillard反應前體物質的激發效應促進以木質素為主要成分的農業廢棄物培肥土壤的效果具有重要意義. Fukuchi等[7]研究了天然沸石對鄰苯二酚、 葡萄糖及甘氨酸間縮聚反應的催化作用， 結果表明， 沸石促進了縮聚反應; Hardie等[8]研究表明， 葡萄糖在δ-MnO2催化下可促進鄰苯二酚的非生物腐殖化過程， 此外， 增加葡萄糖與鄰苯二酚和甘氨酸間的物質的量比還可促進類似于HS的高分子物質產生； 文獻[9]研究表明， 堆肥過程主要以Maillard反應合成HS； 文獻[10]研究表明， 有機物料在堆肥過程中均受Maillard反應的影響； 文獻[11]研究表明， 在牛糞與甘蔗共堆肥過程中添加尾氣脫硫石膏后， 形成HS的芳香化和含氮化合物明顯增加.

木質素難于腐解的特性影響了富含木質素農業廢棄物培肥土壤的效果， 目前Maillard反應促進堆肥腐殖化進程的研究主要針對以木質素為主要成分的椴木屑， 而探索Maillard反應前體物質對其添加暗棕壤腐殖化進程的激發效應目前尚未見文獻報道. 基于此， 本文采用室內恒溫培養法， 通過添加Maillard反應前體物質， 在接種微生物菌劑條件下， 探索各前體物質對混有椴木屑暗棕壤腐殖質組成的影響， 研究3種前體物質對椴木屑在暗棕壤中的腐解特征及培肥效果的影響， 以期為椴木屑、 黑木耳菌糠、 秸稈等農業廢棄物粉碎還田、 更好培肥土壤提供優質可行的助劑， 為農業廢棄物催腐劑的研制提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試土壤采自吉林市經濟技術開發區猴石山海拔243 m的針闊混交林下， 土壤類型為暗棕壤； 椴木屑購于某木材商城. 葡萄糖、 鄰苯二酚、 甘氨酸等試劑購于國藥集團化學試劑有限公司.

微生物菌劑的制備： 準確稱取秸稈腐熟劑(有效活菌數≥200億cfu/g， cfu為菌落數， 由木霉菌、 芽孢桿菌、 放線菌、 假單胞菌、 乳酸菌、 酵母菌、 纖維素酶和蛋白酶等組成， 天津環微生物科技有限公司)1.0 g于100 mL無菌水中， 在28 ℃氣浴振蕩器中以120 r/min振蕩提取2 h， 靜止沉降30 min后以3 500 r/min離心15 min， 收集上清液， 備用.

1.2 實驗設計

采用室內恒溫培養法， 將45.0 g風干、 磨細過0.25 mm篩的暗棕壤與5.0 g椴木屑粉末混勻， 用噴壺均勻噴灑一定濃度的(NH4)2SO4溶液(w(N)=27.2%)調節混料適宜的含水量(w(H2O)=60%)和m(C)∶m(N)(C，N比， 25∶1). 實驗共設3個處理， 在裝有混料的三角瓶中分別添加5 mL 0.12 mol/L的鄰苯二酚(catechol)、 葡萄糖(glucose)和甘氨酸(glycine)， 以無菌水為對照， 分別用Cat，Glu，Gly和CK表示， 每個處理重復3次后， 接種10 mL微生物菌劑， 用無菌透氣膜封口， 于28 ℃恒溫培養， 實驗期間動態補水， 在培養0，30，80，150 d時動態取樣， 取樣后立即轉入50 ℃鼓風干燥箱中風干， 終止微生物反應， 磨細過0.25 mm篩， 用于腐殖質組成分析.

1.3 測試方法

采用腐殖質組成修改法[5]對動態采集混有椴木屑的暗棕壤試樣進行水溶性物質(water soluble substance， WSS)、 可提取腐殖酸(Humic-extracted acid， HE)、 胡敏酸(Humic acid， HA)、 富里酸(Fulvic acid， FA)及胡敏素(Humin， Hu)組分的提取， 同時測定各組分的含碳量(質量比，w(C))， 對其中HA堿溶液進行色調系數(ΔlogK)測定. 步驟如下： 準確稱取1.0 g動態采集的混有椴木屑暗棕壤樣品于100 mL聚乙烯離心管中， 加入30 mL蒸餾水攪拌均勻， 在70 ℃恒溫水浴振蕩器上提取1 h， 離心(3 500 r/min， 15 min)， 將上清液過濾于50 mL容量瓶中， 在帶有殘渣的離心管中繼續加水20 mL攪拌均勻， 離心并將此次上清液與前次合并， 用蒸餾水定容， 所得溶液為WSS； 將蒸餾水替換為0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L Na2P2O7的混合溶液， 按上述步驟對殘渣進行二次提取， 此次收集的溶液為HE； 離心管中殘渣用蒸餾水多次洗滌， 直至洗液近中性， 將其轉入50 ℃鼓風干燥箱中烘至恒質量， 得到Hu.

吸取30 mL HE溶液， 用0.5 mol/L的H2SO4將其pH值調至1.0～1.5， 置于70 ℃水浴鍋中保溫1.5 h， 靜置過夜， 次日將溶液過濾于50 mL容量瓶并定容， 得到FA溶液； 先用稀酸洗滌濾紙上的殘渣， 再用0.05 mol/L溫熱的NaOH將其溶解于50 mL容量瓶中， 用蒸餾水定容， 得到HA堿溶液， 各腐殖質組分的有機碳(w(CWSS)，w(CHE)，w(CHA)，w(CHu))質量比均用外加熱-重鉻酸鉀氧化法測定， 差減法計算w(CFA)=w(CHE)-w(CHA)， 并根據w(CHA)和w(CFA)的結果計算二者比值, 即為胡富比(w(CHA)/w(CFA)). 采用北京普析通用儀器有限責任公司生產的TU-1901型紫外可見分光光度計對HA堿溶液的光密度(A400 nm和A600 nm)進行測定， 并計算ΔlogK：

ΔlogK=lgA400 nm-lgA600 nm.

1.4 數據處理

采用Excel 2003和SPSS 18.0軟件對數據進行整理并進行差異顯著性分析， 采用Excel 2003軟件進行繪圖.

2 結果與分析

2.1 對混有椴木屑暗棕壤水溶性有機物碳質量比及總有機碳的影響

圖1為添加Maillard反應前體物質對混有椴木屑暗棕壤w(CWSS)的影響. 由圖1可見， 隨著培養的進行， 包括CK在內的4個處理， 其w(CWSS)均呈降低趨勢. 與未培養相比， 培養30，80，150 d后， Cat，Glu，Gly和CK處理條件下w(CWSS)的降低幅度分別為47.8%，43.0%，50.4%，36.2%； 53.5%，56.7%，56.4%，44.2%和60.7%，57.7%，64.1%，77.5%. 其中經Gly處理培養30 d后的降低幅度最大， CK處理的降低幅度最小. 在培養80 d后， Glu處理的降低幅度最大， CK處理的降低幅度最小， 在培養150 d后， CK處理的降低幅度最大， Glu處理的降低幅度最小. 當培養結束后， 添加Maillard反應前體物質處理均低于CK的w(CWSS)降低幅度， 其中添加Glu處理的w(CWSS)降低幅度最小.

大寫字母表示同一天數、 不同處理間的差異分析結果； 小寫字母表示同一處理、 不同天數間的差異分析結果.

圖2為添加Maillard反應前體物質對混有椴木屑暗棕壤TOC的影響. 由圖2可見， 隨著培養的進行， 各處理下混有椴木屑暗棕壤TOC均呈降低趨勢， 與未培養相比， 在Cat，Glu，Gly和CK處理下， 暗棕壤TOC分別降低了27.2%，20.6%，29.7%和25.2%， 其中Gly處理的降低幅度最大， 其次為Cat處理， 二者均高于CK的降低幅度， Glu處理的降低幅度最小.

大寫字母表示同一天數、 不同處理間的差異分析結果； 小寫字母表示同一處理、 不同天數間的差異分析結果.

大寫字母表示同一天數、 不同處理間的差異分析結果； 小寫字母表示同一處理、 不同天數間的差異分析結果.

2.2 對混有椴木屑暗棕壤可提取腐殖酸碳質量比的影響

圖3為添加Maillard反應前體物質對混有椴木屑暗棕壤w(CHE)的影響. 由圖3可見， 添加Maillard反應前體物質的處理在各培養天數下w(CHE)均顯著高于CK處理， 且CK處理在各培養天數下w(CHE)均無顯著差異. 除CK處理外， 其余各處理w(CHE)均呈先降低后升高的趨勢. 與未培養相比， 培養150 d后Cat，Glu，Gly和CK處理下w(CHE)的降低幅度分別為4.22%，3.70%，1.52%和0.48%， 其中Cat處理下w(CHE)的降低幅度最大， CK處理下w(CHE)的降低幅度最小.

大寫字母表示同一天數、 不同處理間的差異分析結果； 小寫字母表示同一處理、 不同天數間的差異分析結果.

2.3 對混有椴木屑暗棕壤胡敏酸碳質量比的影響

圖4為添加Maillard反應前體物質對混有椴木屑暗棕壤w(CHA)的影響. 由圖4可見： 在Cat和Glu處理條件下,w(CHA)均呈先升高后降低的趨勢； 在Gly和CK處理條件下，w(CHA)呈逐漸降低的趨勢. 在培養150 d后， 混有椴木屑暗棕壤w(CHA)降低幅度分別為27.9%，20.8%，23.5%和19.2%， 可見， 添加Maillard反應前體物質處理均高于CK的w(CHA)降低幅度.

大寫字母表示同一天數、 不同處理間的差異分析結果； 小寫字母表示同一處理、 不同天數間的差異分析結果.

圖5為添加Maillard反應前體物質對混有椴木屑暗棕壤HA堿溶液ΔlogK的影響. ΔlogK是衡量腐殖質組分光學性質的重要參數， 其與分子結構的復雜程度呈反比， 即ΔlogK值越高， 分子結構越簡單、 分子量越小[12]. 由圖5可見， 隨著培養時間的增加， 各處理下HA堿溶液ΔlogK變化規律不同， Glu和CK處理HA堿溶液ΔlogK逐漸增加， Cat處理HA堿溶液ΔlogK呈先降后升的趨勢， Gly處理呈先升后降的趨勢. 與未培養相比， 培養150 d后Cat，Glu，Gly，CK處理下HA堿溶液ΔlogK分別增加了6.5%，8.7%，1.8%和8.4%， 其中Glu處理的增加幅度最大， 大于CK處理， Gly處理的增加幅度最小. 可見， 添加Gly更有利于提高混有椴木屑暗棕壤HA分子結構的復雜程度.

大寫字母表示同一天數、 不同處理間的差異分析結果； 小寫字母表示同一處理、 不同天數間的差異分析結果.

2.4 對混有椴木屑暗棕壤胡富比的影響

圖6為添加Maillard反應前體物質對混有椴木屑暗棕壤胡富比(w(CHA)/w(CFA))的影響. 胡富比是評價腐殖質品質的重要指標， 胡富比越大， 表明腐殖質品質越好[13]. 由圖6可見， 隨著培養的進行， Cat，Glu和Gly 3個處理條件下， 混有椴木屑暗棕壤胡富比呈先升后降的趨勢， 在CK處理下， 胡富比呈降低趨勢. 與未培養相比， 在培養150 d后， Cat，Glu，Gly和CK處理下胡富比降低幅度分別達37.7%，27.5%，35.9%和32.7%， 其中Cat處理的降低幅度最大， 其次是Gly處理， Glu處理的降低幅度最小. 當培養結束后， 添加Maillard反應前體物質和混有椴木屑暗棕壤的胡富比均顯著低于CK， 不利于提升腐殖質品質.

大寫字母表示同一天數、 不同處理間的差異分析結果； 小寫字母表示同一處理、 不同天數間的差異分析結果.

2.5 對混有椴木屑暗棕壤胡敏素碳質量比的影響

圖7為添加Maillard反應前體物質對混有椴木暗棕壤w(CHu)的影響. 由圖7可見， 隨著培養的進行， 除Cat處理下的w(CHu)先降低后略增加外， 其他3個處理下的w(CHu)均呈降低趨勢， 與未培養相比， 在培養150 d后， Cat，Glu，Gly和CK處理下的w(CHu)分別降低13.1%，32.7%，27.4%和27.7%， 其中Glu處理的降低幅度最大， 高于CK， Cat處理的降低幅度最小. 因此， 與CK相比， Glu處理更有利于w(CHu)的礦化分解， Cat處理更有利于w(CHu)的積累.

大寫字母表示同一天數、 不同處理間的差異分析結果； 小寫字母表示同一處理、 不同天數間的差異分析結果.

3 討 論

水溶性物質(WSS)是微生物能迅速分解利用的底物， 在腐殖質形成過程中起主要作用[14]， 總有機碳含量(TOC)是衡量土壤肥力的一個重要指標[12]， 通常腐解過程伴隨TOC下降， 即TOC礦化分解為更穩定的有機分子進入腐殖質(HS). 隨著培養的進行， 各處理下的暗棕壤水溶性物質碳質量比(w(CWSS))和TOC均呈降低趨勢， 其中， 添加Maillard反應前體物質均低于CK暗棕壤w(CWSS)的降低幅度， 添加葡萄糖使暗棕壤w(CWSS)和TOC的降低幅度達到最小； 各處理w(CWSS)降低的主要原因是微生物腐解暗棕壤中的椴木屑消耗了該能源物質維系自身的生命活動所致[15]. 添加Maillard反應前體物質的處理， 由于額外添加了部分能源物質， 減少了對w(CWSS)的利用. 葡萄糖是微生物最易利用的碳源基質， 因此， 添加葡萄糖更有利于緩解微生物對w(CWSS)的消耗， 此外， 添加葡萄糖也在一定程度上抑制了微生物對TOC的礦化分解. Gao等[16]研究表明， 多糖通過Maillard反應可促進酚類的腐殖化作用， HS的形成可減緩w(CWSS)和TOC的礦化.

可提取腐殖酸(HE)是腐殖質中的活性部分， 具有較高的生物可利用性[1]. 添加Maillard反應前體物質均顯著高于CK的暗棕壤在培養期間可提取腐殖酸碳質量比(w(CHE)). 可見， 鄰苯二酚、 葡萄糖和甘氨酸均有一部分經微生物轉化進入HE組分， HE的形成主要源于前體物質的聚合反應， 添加前體物質會促進堆肥腐熟程度并提高HS的生成數量[4]. 培養前期微生物獲得外源物質對HE進行大幅度降解， 后期進行縮合[17]， 因此使w(CHE)在培養期間呈先降低后升高的趨勢， 最終w(CHE)降低且降低幅度高于CK， 因此， 鄰苯二酚、 葡萄糖和甘氨酸3種前體物質對HE的降解作用大于縮合作用.

胡敏酸(HA)是腐殖質中最活躍的組分， 在一定程度上可表征腐殖質的芳香性、 化學穩定性和有效性[18]， 其自然發生是由于多酚、 蛋白質、 木質素和糖等生物碎片的分解和轉化所致. 添加Maillard反應前體物質的暗棕壤， 其胡敏酸碳質量比(w(CHA))的降低幅度均高于CK， 即鄰苯二酚、 葡萄糖及甘氨酸3種前體物質對HA的降解作用大于縮合作用， 添加鄰苯二酚和甘氨酸可使HA分子結構向復雜化方向進行， 更有利于提高HA分子中的芳香基團. 甘氨酸是最簡單的氨基酸種類[19]， 鄰苯二酚易被氧化成鄰苯醌， 二者均可作為生物碎片加強HA分子的縮合， 使分子復雜程度有所提升[20].

富里酸(FA)是腐殖化反應的重要中間產物， 大多數HA通過FA進一步聚合而成[21]， 研究胡富比變化可直接揭示堆肥過程中HS的演變規律[22]. 在本文實驗中， 添加Maillard反應前體物質的暗棕壤w(CHA)/w(CFA)均呈先增后減的趨勢， 最終有所降低， 添加葡萄糖的暗棕壤低于CK的w(CHA)/w(CFA)降低幅度. 從該規律可以推斷， 添加Maillard反應前體物質增加了微生物的降解能力， 使FA組分趨于降解， 然后部分FA發生縮合進入HA組分， 添加葡萄糖更有利于促進土壤有機碳活化與更新、 改善腐殖質品質[23]. 也可理解為HA比FA形成更早， 符合木質素-蛋白質理論和微生物合成學說[6].

胡敏素(Hu)是腐殖質中的惰性物質[24]， 具有比HA和FA更大的分子量和更高的聚合度， 表明Hu的穩定性更強[3]. 各處理下的暗棕壤胡敏素碳質量比(w(CHu))經培養均有不同程度降低， 其中添加葡萄糖更有利于w(CHu)的礦化分解， 鄰苯二酚可在某種程度上促進碳固存， 抑制w(CHu)降解， 原因可能是添加鄰苯二酚增加了微生物的降解負擔、 削弱了對CHu的降解所致[25]. 可見， 添加葡萄糖可顯著提高微生物的降解能力， 使Hu中的酰胺和多糖物質被微生物用作碳源[16]， 促進了惰性腐殖質組分Hu的降解并向活性腐殖質組分轉化.

4 結 論

1) 隨著室內培養的進行， 混有椴木屑的暗棕壤在各處理影響下， 水溶性物質及總有機碳含量均呈降低趨勢， 其中， 添加Maillard反應前體物質使暗棕壤水溶性物質的降低幅度減小， 添加葡萄糖使水溶性物質及總有機碳含量的降低幅度最小.

2) 添加Maillard反應前體物質的暗棕壤在培養期間可提取腐殖酸碳質量比均顯著高于CK處理， 呈先降低升的趨勢， 經培養后可提取腐殖酸碳質量比有所降低且降低幅度高于CK處理； 添加Maillard反應前體物質使暗棕壤胡敏酸碳質量比的降低幅度更大， 其中， 添加鄰苯二酚和甘氨酸使胡敏酸分子結構向復雜化方向進行. 添加Maillard反應前體物質暗棕壤的w(CHA)/w(CFA)均呈先增后減的趨勢， 最終降低， 添加葡萄糖使暗棕壤w(CHA)/w(CFA)降低幅度低于CK處理.

3) 各處理條件下暗棕壤w(CHu)經培養后均有不同程度降低， 其中添加葡萄糖更有利于胡敏素的礦化分解.