UPLC-Q Exactive Orbitrap HRMS同時測定肉中6 類28 種獸藥殘留量

徐艷偉， 高 娃， 吳云芳， 郭元晟， 孫海林

（錫林郭勒職業學院，內蒙古錫林浩特 026000）

飼養過程中存在不遵守用藥劑量、用藥種類、休藥期等規定和商品名不同而成分相同的藥物重復使用現象， 以上這些原因都可以致使藥物在動物體內不斷積累，最終獸藥殘留。 目前，檢測獸藥殘留的方法有很多種，最常見的是液相色譜法（趙維 等，2012）、 氣 相 色 譜-質 譜 法（GB29685—2013，2014）、 液相色譜-串聯質譜法 （覃玲等，2018）和高效液相色譜結合高分辨質譜法（朱萬燕等，2017）。利用高技術建立一種快速、高通量多種獸藥殘留同時測定的檢測方法， 像改進前處理方法， 采用UPLC-檢測技術等分析過程意義重大。因此本項目利用Q Exactive Orbitrap HRMS 開展了肉獸藥殘留高通量檢測技術， 通過優化色譜和質譜條件， 建立了高分辨液相串聯質譜的高效檢測方法，旨在實現一次性樣品處理，同時鑒定多種獸藥殘留。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材 乙腈、甲酸、甲醇：色譜純，廣州艾欣科學儀器有限公司；PSA：40 ～63 μm，北京綠百草科技發有限展公司；C18：50μm， 北京綠百草科技發有限展公司；HypersilGOLD25002-102130C18 色譜柱：2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國賽默飛世爾科技/Thermo Fishegs 公司。

1.2 標準品 6 類28 種獸藥標準品均購自天津阿爾塔科技有限公司。

1.3 儀器 QExactive 四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀 （賽默飛世爾科技公司， 美國）；Ulti-Mate3000 超高效液相色譜儀（遼寧東科分析儀器有限公司）； 旋轉蒸發儀 （鄭州長城科工貿公司EV-400）；高速冷凍離心機（北京北利時代醫療科技有限公司）。

1.4 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD 25002-102130 C18；流動相A：0.1%甲酸水；流動相B：甲醇；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；沖洗程序：梯度沖洗。

1.5 質譜儀的條件 檢測器：Q Exactive； 離子源：靜電噴霧電離（ESI）源；采集方式：正負離子交換采集；質譜掃描方式：一級全掃描質譜加數據依賴二級掃描（MS/dd full MS2）。

1.6 樣品前處理

1.6.1 樣品采集 取適量具有代表性的新鮮或解凍肉樣，絞碎，并使其充分均質。

1.6.2 樣品的提取 稱取樣品2 g （精確至0.01 g），置于50 mL 聚丙烯離心管中， 加入0.1 mol/L Na2EDTA 溶液2 mL，乙腈8 mL，無水硫酸鈉5.0 g，渦旋混勻1 min，4 ℃、9500 r/min 離心5 min，在另一個50 mL 離心管中收集上清液。 剩余樣品重新加入0.1 mol/LNa2EDTA 溶液2 mL，乙腈8 mL，渦旋5 min 混勻后， 在4 ℃、9500 r/min 離心5 min，吸出上清液，合并待純化的兩個有機相。

1.6.3 樣品的凈化 在肉提取液中加入所有無水QuEChERS 純 化 劑 （100 mgPSA、40 mgC18 和600 mg 無 水MgSO4）， 高 速 渦 旋1 min，4 ℃、9500 r/min 離心5 min。 移取全部有機相，在減壓旋轉蒸發儀上于40 ℃蒸發至近干。 加入2.0 mL 0.1%甲酸水/甲醇（9:1，V/V）溶解殘留物，渦旋混合1 min，通過0.22 μm 濾膜，上機測定。

1.6.4 系列標準曲線溶液的制備 取定量的混合標準溶液， 然后用0.1%甲酸水和甲醇（9:1，V/V）進行稀釋至質量濃度為2.00 ～100.00 ng/mL （氯霉素、氟苯尼考0.50 ～40.00 ng/mL）。 所得溶液應立即使用和配制，避光，密封并冷凍。

1.6.5 空白基質標準曲線系列溶液的制備 將均質的肉樣稱取10 份（精度為0.01 g），置于50 mL聚丙烯離心管中，按照1.6.2 和1.6.3 處理后，加入2.0 mL相應質量濃度待復溶的混合標準溶液，渦旋1 min，過微孔濾膜，得到質量濃度分別為2.00、4.00、8.00、10.00、20.00、40.00、80.00、100.00ng/mL（氯霉素、 氟苯尼考0.50、2.00、4.00、8.00、10.00、20.00、40.00 ng/mL）標準曲線測序溶液。

1.6.6 樣品測定 采用四極桿超高效液相色譜-質譜/線性離子阱對標準空白基質曲線系列和溶液樣品進行分離解析，并將譜圖記錄。提取初級質譜儀的母離子的精確質量， 以及每種化合物的保留時間和次級部分離子信息來實現初級特異性，準確地獲得更高的定性和定量性。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相的選擇 在流動水相中加入一定比例的甲酸將有助于改善化合物電離效率， 可使流動相處于酸性環境， 改善酸堿化合物的峰形，使pH 保持恒定。 實驗結果表明，其不會影響三種酰胺醇化合物的電離效率和峰形， 最終的水相是含有0.1%甲酸的水溶液。 有機相結合物是甲醇（王煉等，2011）和乙腈（趙鳳娟等，2014）。通過比較兩種有機相可以看出，有機相為甲醇時，核心噪聲較低，色譜峰形、響應值、分離效果和靈敏度均優于乙腈，其中，磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶三種異構體也能很好地分開， 當有機相為乙腈時，色譜峰響應通常良好，但是對三種磺胺同分異構體不能完全分開（圖1）。

圖1 2 種流動相對三種磺胺同分異構體的分離效果圖

總之，當流動相的水相為0.1%（V/V）甲酸水溶液， 有機相為甲醇時， 不同目標化合物分離良好，待測化合物的最大響應值優于乙腈，峰形對稱銳利， 滿足分析檢測要求， 故選用0.1%（V/V）甲酸-甲醇水溶液作為流動相。

2.1.2 選擇溶解程序 由于獸藥數量多， 同類性質相似， 等度洗脫方法難以實現多組目標化合物的分離，因此使用梯度洗脫程序。比較獸藥殘留在4 種不同梯度洗脫過程中的色譜峰效應， 如表1所示。 比較方案1 和方案2，當流動相為0.1%甲酸水溶液:甲醇溶液（95：5，V/V）時在梯度洗脫程序中，供試化合物的色譜峰響應值與（90:10，V/V）相比應較高，峰形更對稱、更銳利。 此外，通過比較程序3 和程序4 發現， 當將梯度洗脫時間延長到20.0 min 時，待測化合物色譜峰的峰形、響應值、出峰時間都能很好的滿足檢測要求，但是，它需要相對較長的時間， 并且不太適合大量樣本。當梯度洗脫時間減少到14.5 min， 連續進樣幾次后， 發現下一個樣品中待測化合物的峰時間會發生變化，由于減少了分析平衡時間，呈現不穩定狀態，連續輸注前后的相互作用。 因此，綜合考慮色譜峰的峰時間、響應值、峰形、靈敏度等因素，最終確定最佳程序一。

表1 不同梯度洗脫程序

2.1.3 流速的選擇 流動相的流速對受試化合物的分離影響較大等， 適當的流速可實現色譜峰的分離。 選擇了0.2、0.3 mL/min 和0.4 mL/min 三種流速， 均可以有效分離待測化合物， 但流速為0.4 mL/min，受試化合物尖端形狀對稱、銳利，可保證受試化合物的回收率，提高整體檢測效率，滿足多種獸藥殘留分析要求。

2.2 選擇質譜條件 Orbitrap 高分辨率質譜不需要優化每種化合物的質譜條件和碰撞能量， 這可以顯著縮短檢測方法的開發時間。

2.2.1 掃描方式 該方法比較了三種掃描模式Full MS、Target-SIM/dd-MS2和Full MS/dd-MS2。雖然可以在全質譜掃描模式下定量檢測目標，但只有精確質量和母離子定性所需的保留時間容易導致假陽性結果；Target-SIM/dd-MS2掃描方式是通過四極桿過濾目標母離子， 然后母離子以高能量進入碰撞池，獲得碎裂和生成的離子碎片信息，提高目標的定性檢測精度， 掃描模式對測試化合物的定量略有不足。 當Full MS/dd-MS2掃描模式用于測試化合物的定性篩選和定量時， 母離子和碎片離子的精確質量和碎片離子的精確質量數用于前體離子的定性和精確定量，是定性篩選的目的，可以達到化合物的準確定量測試。因此，選擇Full MS/dd-MS2作為掃描模式。 28 種獸藥產品的精確質量數和保留時間見表2 和圖2。

圖2 28 種獸藥的質譜圖

2.2.2 分辨率 分辨率決定了分子質量的準確性，越高越能區分分子質量相近的物質，同時對掃描速度產生負面影響。 研究發現， 當分辨率較高 （R=140000） 時，掃描速度將降低，因此收集的點較少，并且無法量化生成的峰形， 甚至不能形成一個峰形。在連續采樣過程中，結果不一致，關鍵質譜信息丟失，導致檢測結果重現性差，不穩定性增加。 當第一級全掃描分辨率R=70000 時， 所有待測化合物都能與基質中的干擾物質分離， 響應值大大提高，基質中的干擾大幅度降低。最后，考慮檢測方法的定性和定量精度， 初級質譜全掃描分辨率為70000，次級質譜掃描分辨率為35000。

2.2.3 理論精確質量數 測試的28 種化合物中， 三種酰胺醇以陰離子方式反應， 母離子為[MH]-， 其余25 種藥物均以陽離子方式反應，母離子為[M+H]+。 表2 列出了28 種獸藥產品的理論精確質量，通過對比參考物質的全分析數據進行驗證。 從表中可以看出，28 種供試化合物精確質量的相對質量偏差均小于5 ppm，證明供試化合物的質量準確度良好，滿足定性要求。

2.2.4 質譜條件 水平質譜掃描直到強度達到閾值設置 （1×106）， 并且自動獲取二次質譜掃描。 碰撞能量用梯度定義，分別為CE 20、40、60碰撞能量分裂測試化合物，最后添加并獲得豐富的二級碎片譜，簡化了質譜儀信息參數的優化并節省了分析時間。此外，調整動態排除、峰值觸發和Top N 等參數以獲得有關碎片離子的高質量信息， 將動態移除時間與6、8 s 和10 s 進行比較。 結果表明，測試的28 種化合物的峰形在8 s時較好。 當頂部觸發設置為2 ～6 s 且Top N =10 時， 可以獲得第二個令人滿意的水平離子碎片和MS 譜。 分析結果表明包含母離子的精確質量，還包含次級碎片離子的信息，大大提高了定性準確性并降低了假陽性的可能性。

2.3 樣品前處理條件的優化

2.3.1 提取溶劑的選擇 本研究中建立的分析方法涵蓋6 大類28 種化合物。 由于每種受試化合物的化學性質存在顯著差異，因此在選擇萃取劑時應充分考慮受試化合物的極性和樣品基質的性質等化學性質。 常用提取物有乙腈、乙腈和0.1 mol/L Na2EDTA 水溶液、 含有5% 甲酸的乙腈水溶液（孫曉杰等，2020）等。

本實驗發現，用1%醋酸提取乙腈對磺胺類等堿性化合物的回收率＜60%， 主要是由于酸性強時磺胺類等堿性化合物的電離度增加，導致在有機相中的溶解度降低 （孫曉杰等，2020；GB/T 21317-2007；GB/T 23182-2008）。 樣品分別用0.1 mol/L Na2EDTA 水溶液和乙腈兩次提取，回收率在69%～110%，各自回收率的標準偏差在1.1%～8.6%。 因此，綜合待測化合物的提取情況，確定最終方案。

2.3.2 凈化方式的選擇 本研究從C18、PSA 、GCB 三種凈化劑（付曉燕，2018）中搭配選擇兩種組合作為吸附劑時的凈化效果見表3。結果表明，當C18 與PSA 結合作為凈化劑時，可以獲得較好的凈化效果， 大部分目標化合物均能達到較好的回收率， 但GCB 時對大環內酯類有明顯吸附。 因此， 最終選擇40 mg C18+100 mg PSA作為凈化劑。

表3 兩組吸附劑凈化效果情況

2.3.3 再溶解液的選擇 樣品上機前，最大程度地重新溶解測試化合物而不影響色譜峰的基線和峰形是非常重要的（高彥，2017）。 本研究比較了水甲醇（9:1，V/V）、水乙腈（9:1，V/V） 和0.1%甲酸流動相和各測試化合物的溶解性能水-甲醇（9:1，V/V），0.1%甲酸，水-乙腈（9:1，V/V），甲醇水（6:4，V/V）、乙腈水（6:4，V/V）、0.1% 甲酸甲醇（6:4，V/V）、0.1% 甲酸乙腈水（6:4,，V/V）在受測化合物回收率的影響。 將甲酸加入溶解液的水相中更適用于含堿性基團的物質（臧國棟等，2018），如磺胺類藥物的溶解。 根據各待測化合物的色譜峰基線、峰形和回收率結果，最終采用0.1%（9：1，V/V）甲酸甲醇的水溶液作為再溶解液。

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線與檢出限評價 取質量濃度分別為2.00、4.00、8.00、10.00、20.00、40.00、80.00、100.00 ng/mL（氯霉素、 氟苯尼考0.50、2.00、4.00、8.00、10.00、20.00、40.00 ng/mL）一系列標準曲線溶液，利用峰響應面積和標準樣品的質量濃度制作標準曲線，即可得到相應的線性回歸方程. 實驗結果表明，所有組分在該質量濃度范圍內均具有良好的線性，相關系數r為0.9962 ～1.0000。 以3 倍信噪比計算的檢出限在1 ～10 μg/kg 量級，可滿足檢測要求。

2.4.2 回收率、 精密度評價 根據相關定判定依據，制備三個質量分數為5.0、20.0、50.0 μg/kg（氯霉素、氟苯尼考1.0、5.0、20.0 μg/kg）的陽性肉樣，每個水平進行3 次平行實驗。結果見表4。實驗結果表明， 三個水平樣品的回收率為60.3% ～118.4%，RSD 為0.23% ～9.73%。

表4 各組分加標回收率及相對偏差測定結果（n=3）

3 結論

通過對色譜、 質譜條件的優化 （方從容等，2018），28 種獸藥殘留的色譜峰對稱性好且尖銳、響應值高、基線噪音低。 通過對樣品前處理過程的優化， 采用0.1 mol/LNa2EDTA 水溶液和乙腈分別對樣品進行兩次提取，QuEChERS 凈化后直接上機測定。 同樣的一份樣品QuEChERS凈化方法只需要13 元左右。 QuEChERS 純化方法具有高效、安全、經濟、實用等優點，越來越多地應用于動物藥物殘留的檢查和檢測（莫迎等，2019）， 這是當前預處理和純化技術的發展趨勢。 通過提取測試化合物的初級質譜全掃描的精確質量， 可以準確地定性和定量地獲得每個測試化合物的保留時間和次級部分離子信息。通過對標準曲線線性、 相關性測定， 在基質中2.0 ～100.0 ng/mL（氯霉素0.5 ～40.0 ng/mL）的質量濃度內線性良好， 相關系數r大于0.9962。通過做準確度和精密度實驗， 所有待測化合物回收率為60.3% ～118.4%。 3 份平行樣待測化合物精密度為0.23% ～9.73%， 符合國家標準《GB/T27404-2008 食品理化檢驗實驗室質量控制規范》，可用于肉中多種獸藥殘留的快速定性定量測定（GB/T 27404-2008）。