新疆山羊肉的食用品質及差異蛋白質分析

于紅，馬曉琳，劉永峰，張瑞*

1(新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室，新疆特殊環境物種多樣性應用與調控重點實驗室，干旱區植物逆境生物學實驗室，中亞區域有害生物聯合控制國際研究中心，新疆 烏魯木齊，830054)2(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710062)

當動物被屠宰取肉時，肌肉組織不會立即停止代謝過程。肌肉作為獨立結構，缺失了氧氣和外來營養的供給，開始發生相應的物理和化學變化，最終影響死后肉質的發展和成熟。宰后成熟過程中的能量代謝與肌原纖維蛋白的降解將會影響肉質的嫩化，進而直接影響肉質的嫩度、色澤等。肌原纖維蛋白也被稱為結構蛋白，主要支撐著肌纖維的形狀，其包括肌球蛋白、肌動蛋白和肌鈣蛋白等[5]。這些肌原纖維蛋白都與肌肉收縮有關，直接影響宰后肉的嫩度、保水性和肉色等品質[6]。有研究表明，肌內能量和代謝水平差異會調控肌內蛋白酶系的活力釋放，進而影響宰后的嫩度[7]。但目前關于宰后成熟過程中，有哪些差異蛋白在何時間段如何影響肉質的嫩度仍然存在爭議。因此深入研究新疆山羊不同成熟時間中的蛋白質表達水平，探討肉質成熟的機理，有助于新疆山羊的開發和利用，進而實現新疆農牧區的經濟增值。

課題組前期對陜西橫山羊的背部最長肌與胸腹肌肉進行宰后成熟機理的相關研究，在此研究基礎上發現背部最長肌是山羊肉中較為優質的部位[8]，且在肌肉轉化為肉的過程中，肌肉在死后48 h內的代謝發生了重大變化，從根本上決定了生肉的大部分重要品質(顏色、pH、保水能力和嫩度)。本研究選取新疆特有品質絨山羊的背部最長肌為實驗對象，研究新疆山羊肉成熟過程中的pH值變化以及相關差異蛋白的調節機制，探索宰后成熟過程中的差異蛋白對新疆山羊肉質嫩化的影響，明確肉質較好的最適成熟時間。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料：羊肉樣品，新疆烏魯木齊市華凌畜牧屠宰基地。選取6只約8月齡健康的新疆絨山羊(公)的背部最長肌為研究對象。

實驗試劑：氯化鉀，烏魯木齊科華偉業生物科技有限公司；三氯乙酸、KH2PO4、蛋白酶抑制劑、胰蛋白酶、二硫蘇糖醇(分析純)、尿素(分析純)、甲酸、乙腈、三乙基碳酸氫銨(分析純)、三氟乙酸(分析純)、蛋白質定量試劑盒(bicinchonininc acid，BCA)、串聯質量標簽(tandem mass tags，TMT)標記試劑盒、預染標記物、二甲苯(分析純)、檸檬酸(分析純)、醋酸鈾(分析純)等試劑，艾博抗(上海)貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

Testo 205便攜式pH計，德國德圖公司；PROTE-ANⅡ型凝膠電泳系統，美國Bio-Rad公司；IMARK酶標儀，上海旦鼎國際貿易有限公司；Velocity 18R離心機，天美儀拓實驗室設備(上海)有限公司；LC-20AB HPLC型Offline HPLC高校液相色譜，杭州瑞析科技有限公司；Q-Exactive質譜儀，百泰派克生物科技；JEM-1011透射電子顯微鏡，日本JEOL公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

采集6只8月齡的新疆絨山羊(來自同一養殖場，飼養方式相同)，均由烏魯木齊華凌畜牧基地提供。按照DB 37/T 3878—2020(肉樣屠宰操作規程)進行屠宰，并分割取背部最長肌10 g用錫紙包好放置于液氮中迅速冷卻，用于0 h樣品，其余肉樣包裝后放置4 ℃冰箱進行宰后成熟過程，用于pH和蛋白組檢測。

下一步將在引入優良谷子品種基礎上，進行谷子種業、谷子規?；N植、谷子及秸稈飼料化、小米深加工產品開發及產業化，全面發展小米“種植、養殖、加工”全產業鏈，立足保加利亞，形成可復制的盈利模式，并逐步輻射到歐洲其它國家，為我國農業“走出去”做出貢獻。

1.3.2 pH值測定

按照國標GB/T 5009.237—2016進行調整，分別將羊肉樣品剔除筋膜、剪成碎末，稱取約4 g肌肉樣置于燒杯中，加入40 mL 0.1 mol/L KCl溶液，用玻璃棒攪拌，常溫下放置30 min，使用校正后的pH計進行測值，每組測量3次，結果取平均值。

1.3.3 蛋白質提取和肽段酶解

每個樣品采用SDT[40 g/L十二烷基硫酸鈉，100 mmol/L Tris/HCl pH 7.6，0.1 mol/L二硫蘇糖醇]裂解法提取蛋白質，然后采用BCA法進行蛋白質定量。每個樣品取適量蛋白質，采用輔助過濾樣品制備(filter aided proteome preparation, FASP)方法進行胰蛋白酶酶解[9]。

1.3.4 TMT 標記

各樣品分別取100 μg肽段，按照Thermo公司TMT標記試劑盒說明書進行標記，標記信息如表1所示。該項目設計組別4個，每個組別含有3個生物學重復樣本，共計12個樣本。

表1 肽段標記信息Table 1 Peptide labeling information

1.3.5 標記肽段的強陽離子交換器(strong cation exchanger，SCX)分級

將每組標記后的肽段混合，采用AKTA Purifier 100進行分級。色譜柱以緩沖液A液(10 mmol/L KH2PO4，25% 乙腈，pH 3.0)平衡，樣品由進樣器上樣到色譜柱進行分離，流速為1 mL/min。洗脫過程監測214 nm的吸光度值，每隔1 min收集洗脫組分，分別凍干后采用C18 Cartridge脫鹽。

1.3.6 LC-MS/MS數據采集

每份樣品采用納升流速的HPLC液相系統進行分離。緩沖液A液為0.1%(體積分數)甲酸水溶液，B液為0.1%(體積分數)甲酸乙腈水溶液。樣品經色譜分離后用Q-Exactive質譜儀進行質譜分析。多肽和多肽碎片的質量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集20個碎片圖譜，MS2的激活類型是高能碰撞碎裂，二級質譜在200m/z處的分辨率為17 500，破碎能量為30 eV。

1.3.7 蛋白質鑒定和定量分析

質譜分析原始數據采用軟件Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4進行查庫鑒定及定量分析。相關參數和說明如表2所示。

1.4 統計分析

首先對目標蛋白質集合的定量信息進行歸一化處理(歸一化到-1～1區間)。使用亞細胞定位預測的方法，預測待檢索蛋白亞細胞定位信息。采用Blast2GO對目標蛋白質集合進行基因本體特征(gene ontology，GO)注釋，以及用京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)自動注釋服務器軟件進行KEGG通路注釋。采用Fisher精確檢驗對目標蛋白進行GO注釋或KEGG通路富集分析。

表2 蛋白質鑒定和定量分析的相關參數Table 2 Parameters related to proteins identification and quantitative analysis

2 結果與分析

2.1 成熟過程中pH值的變化

宰后羊肉成熟過程中的肌肉pH變化的幅度和速度除了影響肌肉色澤、嫩度和多汁性外[10]，同時也影響宰后山羊肌糖元的酵解速度和強度。由于動物體內有完善的緩沖體系，pH值基本保持在中性。而屠宰后，動物體內有氧呼吸停止，供氧途徑被阻斷，體內肌肉代謝變成糖酵解為主的無氧代謝，糖酵解的產物乳酸和ATP降解所產生的無機磷酸的累積，使肌肉pH不斷下降[11]。選取宰后不同成熟時間的新疆山羊背最長肌進行肉品質的測定，如圖1所示，宰后0～24 h內的pH顯著下降(P<0.05)，這可能是因山羊成長過程中的運動導致肌肉中的乳酸沉積和神經興奮導致宰后初期的pH較高，此結果與張利霞等[12]和SEN等[13]的研究結果一致。而宰后48 h內新疆山羊的pH偏低則可能與宰后糖酵解有關[14]，也可能是成熟過程中參與H+轉換的相關差異蛋白的活性決定。

圖1 不同宰后成熟時間對羊肉的pH變化Fig.1 Changes of mutton pH at post-mortem in different maturation time注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 質量控制

本實驗采用具有高質量精度、高分辨率的Q Exactive質譜儀，在數據采集過程中可以保持良好的質量偏差，并最終獲得高質量的MS1和MS2圖譜。如圖2所示，所有鑒定肽段的質量偏差主要分布在10 ppm以內，說明鑒定結果準確可靠。圖3是結合MASCOT的分析工具對MS圖譜數據進行分析所得到的肽段離子得分分布圖，MS2的MASCOT得分較為理想，約50.27%以上的修飾肽段得分在20分以上，肽段得分中位數為20分。每一套TMT數據在定性分析工作中均使用FDR≤0.01作為篩選標準，結合所得的優秀肽段得分分布情況，進一步說明MS實驗數據質量較高。圖4表明，等量標記的2組樣品中大部分蛋白質的豐度比值接近1。肽段進行質量檢測后結果良好，能夠增加蛋白質鑒定與分析結果的可靠性，為探索肌肉向食用肉的轉化過程中參與的重要差異蛋白的鑒定提供科學依據。

圖2 肽段離子質量偏差分布Fig.2 The mass deviation distribution of peptide ions注：橫坐標為肽段離子理論質荷比和質譜實驗測得質荷比的質量偏差，單位ppm即百萬分之一，是一個相對單位

圖3 肽段離子得分分布Fig.3 Peptide ion score distribution注：橫坐標為肽段得分；主縱坐標表示鑒定到的具有對應離子得分的肽段數量；次縱坐標表示不高于對應離子得分的肽段累積百分比

a-12 h/0 h比較組的肽段豐度比分布；b-24 h/0 h比較組的肽段豐度比分布；c-48 h/0 h比較組的肽段豐度比分布圖4 肽段豐度比分布Fig.4 Abundance ratio distribution of peptide segment注：差異倍數(以2為底的對數變換)

2.3 差異表達蛋白的定量與篩選

采用TMT技術研究了宰后48 h內新疆山羊的背部最長肌樣品的差異表達蛋白結果情況，質譜實驗中共得到級質譜譜圖總數518 230個，通過Mascot軟件進行分析后，匹配到的譜圖總數量為47 666張，其中唯一肽段總數14 466個，蛋白質總數2 526個，鑒定到的顯著差異表達蛋白155個。具體3個比較組的差異蛋白表達量變化如圖5所示，在宰后不同階段，差異蛋白的表達有所不同。3個比較組中，上調蛋白的數量均高于下調蛋白的數量，說明差異蛋白在山羊肉嫩化過程中更為活躍。且在屠宰12 h后，這些蛋白的表達差異更為顯著，進一步說明隨宰后成熟時間的延長，相關差異表達蛋白的數量逐漸增加，對肉質的調控程度也逐漸增強。細胞器是細胞質中具有一定形態和功能的小器官，也是蛋白質發揮不同功能的重要場所。不同的亞細胞器通常執行不同的細胞功能。因此，分析蛋白質的亞細胞定位有助于進一步探索蛋白質在細胞中的功能，結果如圖6所示。宰后成熟過程0 h/12 h、0 h/24 h、0 h/48 h 3個比較組的差異表達蛋白主要分布在細胞質和細胞核中，結果表明，成熟過程中作用的差異蛋白大多數來自于細胞核與細胞質，可能為這些參與調控肉品質的差異蛋白的合成及相關功能表達，提供了場所保障。

a-0 h/12 h組差異表達蛋白質聚類分析結果圖；b-0 h/24 h組差異表達蛋白質聚類分析結果圖；c-0 h/48 h組差異表達蛋白質聚類分析結果圖圖5 三組差異表達蛋白質聚類分析結果Fig.5 Clustering analysis of three groups of differentially expressed proteins注：橫坐標為樣品信息，縱坐標為顯著性差異表達的蛋白質，紅色代表顯著性上調的蛋白質，藍色代表顯著性下調的蛋白質，灰色部分代表無蛋白質定量信息

圖6 相關差異表達蛋白質的亞細胞定位Fig.6 Subcellular localization of differentially expressed proteins

2.4 差異表達蛋白的結構域富集、GO功能注釋與KEGG分析

對差異表達蛋白服從Fisher′s exact test進行驗證，在GO功能項顯著富集分析中對差異表達蛋白的認識、功能類別以及它們之間的相關性，并對這些差異蛋白質的富集GO條目層級關系進行展示，為深入了解影響山羊肉品質的變量進行了重要補充。本研究的GO功能注釋結果主要分為三類：生物過程(BP)、細胞成分(CC)和分子功能(MF)[15]。并發現隨宰后成熟時間的延長，新疆山羊肌肉中的一些差異蛋白主要參與調節生物過程、調節細胞過程和代謝調控，并且較為集中的參與催化活性和結合功能。此外，這些差異蛋白的主要分布在細胞部分、細胞和細胞器部分。對于細胞成分組，WEI等[16]觀察到山羊組的差異蛋白主要分布在細胞器和細胞外泌體中，與本試驗結果存在少許差別，這可能是因為不同品種的山羊，差異蛋白的表達及其分布存在地區差異。

為了進一步分析不同比較組中的關鍵代謝通路，執行KEGG通路富集提取與差異表達蛋白相關的生物通路[17]。宰后成熟48 h內某些差異表達蛋白參與糖酵解的代謝通路如圖7所示，結果顯示大多數差異表達在山羊宰后成熟中下調表達，其中只有2個差異蛋白(PGM1，LDHB)上調表達。代謝過程表明，葡萄糖磷酸變位酶-1(phosphoglucomutase 1，PGM1)參與α-D-一磷酸葡萄糖向α-D-六磷酸葡萄糖的轉化過程。因此，PGM1在糖代謝中起著重要的作用，能通過影響糖原降解、ATP的產生、乳酸的積累調控宰后肉品質的pH值。此外，有研究表明，PGM1是肌間脂肪(intramuscular fat，IMF)合成的還原性輔因子，其基因表達量高的樣品中IMF含量高，汁液流失率低[18]。由此可知，PGM1可能是改變宰后肉品質嫩化的重要因素之一。

圖7 宰后成熟過程中的糖酵解代謝Fig.7 Glycolytic metabolism during postmortem maturation注：圖中紅底方框表示發生差異的蛋白質為上調，綠底方框表示發生差異的蛋白質為下調，黃底方框表示有多個蛋白；小圓圈表示小分子代謝物，大圓框代表其他通路

LDHB參與三羧酸循環后期的丙氨酸與L-乳酸相互轉化過程，通過調控宰后成熟過程中的pH值變化改善肉品質。也有研究表明，LDHB能夠促進肉色的穩定性[19-20]。而本研究結果顯示宰后48 h時，該酶上調表達，可以解釋LDHB在穩定正常肉色中的作用。動物宰后的糖酵解速率是影響最終肉品質的重要因素之一。JIA等[21]利用2-DE蛋白組學研究了牛背最長肌從體內到宰后早期(宰后1 h)的蛋白質變化。鑒定到24個差異表達蛋白，其中5個蛋白(烯醇酶、醛脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、ATP特異性琥珀酰輔酶a合成酶和異檸檬酸脫氫酶)為酵解和三羧酸循環的關鍵，這些結果反映了宰后肌肉中無氧代謝為機體提供ATP，同時應激蛋白是肌纖維結構變化潛在的生物指示劑。JIA等[22]研究了宰后1、2、3、6、10、24 h的蛋白質組學變化，結果發現，與之前的文獻相比，代謝蛋白(酵解酶和與ATP產生途徑相關的酶)、應激和防御蛋白、蛋白水解酶在豐度上發生了變化。

2.5 能量代謝相關差異蛋白對肉品質的影響

在本研究中，在0 h/12 h組中檢測到的線粒體核糖體蛋白L46(MRPL46)顯著上調。在0 h/24 h組中，線粒體核糖體蛋白S15(MRPS15)、39S核糖體蛋白L41(MRPL41)、線粒體核糖體蛋白L22(MRPL22)顯著上調，這些差異蛋白主要參與宰后能量物質的運輸作用，說明宰后成熟早期的能量代謝，促進宰后肉質嫩化過程。也有相關研究表明，核糖體蛋白是調節肌肉凍融的關鍵蛋白，且凍融過程抑制了蛋白質的消化及脂肪分解[23]。在0 h/48 h組中檢測到的差異蛋白中無機焦磷酸酶2(PPA2)顯著上調。依據GO注釋和KEGG結果表明，這些差異表達蛋白質主要與線粒體有關，并參與氧化代謝過程，對山羊肉的嫩化過程起著重要作用。線粒體是細胞有氧活動的重要位點，并參與三羧酸循環和氧化磷酸化反應，這些與線粒體相關差異蛋白在成熟過程中上調表達，生成的ATP與H+有助于調節肉質的pH和成熟。有研究也表明，由細胞有氧呼吸產生的NADH(nicotinamide adenine dinucleotide)有助于肉的顏色的穩定[24-25]。

本研究中，在分子功能方面主要富集了參與有氧代謝的跨膜運輸蛋白。例如，在0 h/12 h組中檢測到的差異蛋白中，跨膜蛋白14C(TMEM14C)顯著下調。在0 h/24 h組中檢測到的差異表達蛋白中，跨膜蛋白205(TMEM205)顯著上調。在0 h/48 h組中，氧甾醇結合蛋白相關蛋白10(OSBPL10)、雷汀醇結合蛋白4(RBP4)顯著上調，糖質膜相關蛋白(SLMAP)顯著下調。這一結果表明，與跨膜運輸相關差異蛋白在成熟后期上調表達，這些差異蛋白可能與蛋白的初始濃度和宰后成熟過程中的能量代謝有關，說明有氧代謝在山羊宰后48 h內的成熟中發揮了作用。涉及肌肉結構的差異蛋白的某些分子功能在死后48 h與死后0 h不同，這可能是宰后成熟過程的嫩度不同導致的。因為結構蛋白質尤其細胞骨架蛋白的降解是宰后成熟過程中肌肉嫩化的主要原因[26]。對比其他2組，0 h/48 h組中該類差異蛋白下調表達，說明肌肉結構蛋白的變化可能導致48 h山羊肌肉嫩度降低。肌肉結構和能量代謝與影響肉類質量的蛋白質有關，由LAMETSCH等[27]和KARLSSON等[28]證實。

3 結論

本研究以新疆山羊的背部最長肌為實驗對象，較為深入地探索了影響肉質成熟的差異表達蛋白的作用機理。采用TMT標記蛋白質組學技術比較死后不同成熟時期的蛋白質組變化，這一結果使本研究更好地了解宰后成熟過程中的蛋白質組差異。與糖酵解相關的差異蛋白在宰后48 h時仍上調表達，這些蛋白可調控宰后肌肉的pH值變化，且對pH值的影響結果與前期pH值的檢測結果相一致。這說明山羊宰后的糖代謝過程維持到48 h之后，可以促進肉色的穩定和肉質的嫩化。山羊宰后肌肉轉化為肉的過程中有不同的代謝模式，而線粒體作為能量代謝的關鍵部位，可能間接地調節肉質嫩度的變化。本研究結果顯示，24 h內的線粒體相關差異蛋白均上調表達，表明新疆山羊肉的背部最長肌成熟期間肉質逐漸嫩化，且24 h時嫩化程度最高，進一步表明宰后成熟起到嫩度優化的作用。通過生物信息學分析出了一些差異蛋白質和糖酵解途徑為肉品質調控機制的研究奠定了基礎。