自然發酵臘肉中酵母菌的分離鑒定及其發酵特性研究

張秋會，王晗，祝超智，崔文明，王小鵬，余小領，王興輝，趙改名

(河南農業大學 食品科學技術學院，河南 鄭州，450002)

發酵肉制品是指在天然或者人工控制的條件下，利用各種微生物發酵作用制作出來的具有特殊風味、色澤和質地，且可以保存較長時間的肉制品[1]。臘肉是一種中國傳統的腌臘肉制品,因其主要在臘月加工生產而命名。臘肉的種類繁多,因其具有獨特的煙熏色澤、氣味及口感,而廣泛流行于各地民間飲食中。隨著現代消費者對于色香味形的需求,傳統臘肉的生產已然逐漸跟不上現代食品所需的安全、營養、快捷的發展趨勢[2-3]。

目前市面上臘肉制品多數為手工作坊式生產，臘肉中的微生物經過自然培養和發酵后，產生了獨特的風味和口感[4-5]，但由于手工作坊生產條件的局限性，無法對產品中的微生物生長進行有效控制，有益菌的生長受到影響，導致產品風味產生了差異性，并且部分有害菌的生長，會造成產品的腐敗變質等質量問題。我國在傳統發酵肉類食品工業化生產和技術現代化的改造等各個方面研究起步較晚,這種情況嚴重制約了我國傳統肉類食品加工行業的健康可持續發展。因此添加不同的有益菌種可以有效改善臘肉的生產工藝[6-7]。酵母菌作為發酵菌株的一種，一直應用于面粉、牛奶、酒類等產品。近年來，酵母菌開始應用于發酵類肉制品中，其與乳酸菌進行復配，可以增強發酵性能[8-9]。因此，篩選活性強、活菌數目多、適合發酵肉制品生產的優秀酵母菌，開發適合中國人口味的發酵肉制品微生物發酵劑，是目前肉類工業重要研究方向之一。

本研究以信陽臘肉和湖南臘肉為分離材料，對菌株進行分離純化分子生物學鑒定，并對篩選出的菌株的發酵特性進行測定，找出適合臘肉加工生產的、發酵性能優良的酵母菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：信陽臘肉、湖南臘肉，農家自制。

試劑：孟加拉紅瓊脂、YPD液體培養基，青島海博；氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)、碳酸鈣、氯化鈉、亞硝酸鈉、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD 超凈工作臺，AIRTECH；Tprofessi Gradie梯度PCR儀,德國Biomera；F3全自動凝膠成像系統，SYNGENE；DYY-12電泳儀，北京市六一儀器廠；KB240可編程低溫培養箱，BINDER；TU-1901紫外可見光光度儀，北京普析通用儀器有限公司；8次/s 拍擊式均質儀，Easy MIX；230V/Hz渦旋振蕩器，VORTEX GENIUS3。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

在無菌均質袋里，添加樣品10 g和90 mL的無菌生理鹽水，用均質機進行均質，用無菌生理鹽水在無菌試管中依次進行10倍梯度稀釋，選擇3個合適的梯度，分別取200 μL稀釋液涂布于孟加拉紅瓊脂平板上，30 ℃培養24～72 h，挑選符合酵母菌形態的菌落，進行反復劃線純化。對純化好的菌株進行進一步的實驗。

1.3.2 16S rDNA分子生物學鑒定

挑取單菌，加入20 mL無菌水在95 ℃、20 min的條件下進行PCR裂解，用所得的裂解液為模板。酵母菌所用序列如表1所示。PCR反應體系和反應時間如表2所示。

表1 通用引物序列Table 1 Universal primer sequences

表2 PCR反應體系和反應條件Table 2 PCR reaction system and reaction conditions

參考趙改名等[10]的方法，進行測序。應用NCBI數據庫，使用BLAST對基因同源性比較，確認菌株名稱。

1.3.3 菌株特性的研究

1.3.3.1 生長曲線和產酸曲線的測定

參考高紹金[9]的方法，并加以修改。吸取菌液于YPD液體培養基中，30 ℃培養50 h，每隔2 h測定其pH值和OD600值。

1.3.3.2 耐鹽特性

參考徐鑫等[11]的方法，并加以修改。吸取菌液于NaCl質量分數為0%、2%、4%、6%的YPD液體培養基中，30 ℃培養24 h，測定菌液的OD600值。

1.3.3.3 耐亞硝酸鹽特性

吸取菌液于NaNO2的添加量為0、50、100、150 mg/kg的YPD液體培養基中，30 ℃培養24 h，測定菌液的OD600值[12]。

1.3.3.4 耐酸特性

吸取菌液于pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的YPD液體培養基中，30 ℃條件下培養24 h，測定菌液的OD600值[13]。

1.3.3.5 產醇試驗

吸取活化3代后的菌液，在孟加拉紅固體培養基上劃線，倒置于30 ℃培養箱培養2 h。長出可見菌落后，在培養基倒入TTC上層培養基，使其覆蓋原來菌落。放置于30 ℃培養箱中培養4 h，記錄菌落的呈色情況。

1.3.3.6 產氣試驗

采用杜氏小管發酵法，在30 ℃培養24 h后，觀察杜氏小管中有無氣泡產生，記錄菌株的產氣情況。

1.4 數據統計處理與分析

所有實驗均重復3次。采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析，數據間的分析采用單因素方差分析(one way ANOVA)，顯著性水平均定位P<0.05。折線圖使用Origin進行作圖。

2 結果與分析

2.1 臘肉中微生物的分離與鑒定

對篩選出的臘肉中的酵母菌進行分離純化，通過DNA序列比對，鑒定臘肉中酵母菌的種類。

獲得各菌株的基因組后進行PCR擴增，并進行電泳檢測。由圖1可知樣品的擴增產物約為500～750 bp，所有條帶分子質量大小符合理論預期[14]。

圖1 PCR凝膠成像Fig.1 PCR gel imaging

利用NCBI數據庫，對分離菌株的DNA序列基進行BLAST分析，確定菌種鑒定結果。根據表3可知，信陽臘肉中含有漢遜德巴利酵母、季也蒙畢赤酵母；湖南臘肉中含有假絲酵母。

表3 臘肉中13株分離菌株的鑒定結果Table 3 Identification results of 13 strains isolated from Bacon

2.2 臘肉中分離酵母菌的特性研究

從分離得到的3種酵母菌中各選擇1株代表菌株，開展特性研究。

2.2.1 耐鹽特性研究

食鹽是肉制品加工過程中重要的調味劑，對發酵肉制品的安全性和感官質量有重要影響，而耐鹽特性是選擇發酵菌種的重要因素之一[15]。臘肉中食鹽的添加量一般為4%～6%(質量分數)，水分含量會隨著發酵的進行降低，鹽濃度隨之提高，菌株能夠有較好的NaCl的耐受性，可以在發酵過程中發揮自己的作用。許艷豐等[5]從臘肉中篩選的熱帶念珠菌和乳酒念株菌兩種酵母菌中發現，當鹽質量分數超出6%時，菌株基本失去活性，不適宜菌株的生長。

由圖2可知，各菌株在NaCl質量分數為0%時生長量最大，表明高NaCl含量會抑制菌株的生長。其中，菌株J1-2在NaCl質量分數為6%條件下活性良好，相比較，H34和X35在NaCl質量分數為6%條件下活性更強，由此可以了解到這3種菌株均有良好的耐鹽能力。這與劉英麗等[16]篩選出漢遜德巴利酵母和異常威克漢姆酵母的耐鹽特性一致，均可以耐高NaCl濃度的環境。

圖2 各菌種在不同鹽濃度下的生長能力Fig.2 Growth ability of each strain under different salt concentration

2.2.2 耐亞硝酸鹽特性研究

亞硝酸鹽是肉制品加工生產過程中重要的食品添加劑，有利于促進發色、增進風味、抑制有害菌的生長，但是過量食用亞硝酸鹽會對人體帶來危害[17]。通常根據對發酵肉制品亞硝酸鹽添加量和發酵產生亞硝酸鹽，要求菌株最少耐受100 mg/kg的亞硝酸鹽，最好可以在150 mg/kg的亞硝酸鹽條件下生長良好。

由圖3可知，X35和H34在100 mg/kg時活性很強，與之比較，菌株J1-2在150 mg/kg時依舊有較好的亞硝酸鹽耐受性。由此可知，3種酵母菌均有很好的耐亞硝酸鹽性，其中J1-2的耐受性更強。這與劉英麗等[16]、陶森等[18]篩選的漢遜德巴利氏酵母以及季也蒙畢赤酵母有差異，他們篩選出的酵母菌耐亞硝酸鹽能力都比較強，這可能是他們所篩選的原料不同，一個是從豆豉里面篩選的，一個是從腌魚里面篩選的,樣品本身的亞硝酸鹽含量較高，使其耐受性更強。

圖3 各菌種在不同亞硝酸鹽含量下的生長能力Fig.3 Growth ability of different strains under different nitrite content

2.2.3 耐酸特性研究

發酵過程中通常不以單一的酵母菌進行發酵，大多會加入乳酸菌進行復配，而乳酸菌具有較強的產酸能力，因此要求酵母菌需具有較強的耐酸能力[19]。由圖4可知，菌株J1-2在pH為3.0時生長能力最強，這與姚志芳等[20]篩選的畢赤酵母和李默等[21]篩選的畢赤酵母的耐酸性相近,在pH為3.0及以上時菌株活性很好；與黃治國等[22]篩選的季也蒙畢赤酵母進行對比，兩種酵母菌均可以在pH為3.0時很好的生長。X35和H34在pH為5.5時活性很強，但隨著pH值的增加而逐漸失去了活性。與劉壯等[23]篩選的漢遜德巴利酵母進行對比，本研究中X35的耐酸能力較差，這可能是由于劉壯等是從酸度較高的葡萄汁中篩選的菌株，具有很強的耐酸性。結果表明在發酵初期時，在酵母菌最適溫度下進行發酵，此時pH值較高，酵母菌活性很強，然后在乳酸菌的最適溫度下進行發酵，發酵的效果最好。

圖4 各菌種在不同pH下的生長能力Fig.4 Growth ability of different strains under different pH

2.2.4 菌株的生長曲線和產酸曲線研究

根據圖5可知，3種菌株都在0～8 h時為遲緩區，此階段菌株的生長速度較慢，時間較長；8～30 h時為對數區，此階段菌株的生長迅速增長，在30 h時到達穩定期。與劉輝等[24]所用的釀酒酵母菌進行對比，3種酵母菌的穩定期滯后，但是在穩定期時，吸光度比劉輝的高；其中J1-2的活性最強，在穩定期時，菌液的濃度顯著高于另外兩種菌株。

圖5 菌株的生長曲線Fig.5 Growth curve of the strain

根據圖6產酸曲線可知，H34的pH值下降最快，在50 h時候pH值為4.79。其中X35和J1-2的最終的產酸能力差異性不明顯。篩選出的酵母菌與姚志芳等[20]從牦牛瘤胃和青稞酒槽篩選的畢赤酵母和釀酒酵母進行對比，本實驗篩選出的菌株產酸速度慢但產酸多。圖5生長曲線可知，菌株的產酸和生長曲線對應的遲緩區、對數區和穩定期基本一致。一般情況下，乳酸菌的穩定期時間較早，產酸能力高于酵母菌[10]，酵母菌發酵可降低發酵肉制品的酸度，增加風味。

圖6 菌株的產酸曲線Fig.6 Acid production curve of the strain

2.2.5 菌株的產氣產醇研究

酵母菌在發酵過程產生氣體會破壞發酵肉制品的質地，影響發酵產品的外觀，從而嚴重影響發酵產品的銷售。由表4可知，杜氏小管內均沒有氣泡生成，結果表明這幾種酵母菌均不產氣。酵母菌能利用發酵基質中的糖分，將其轉化為乙醇，賦予發酵肉制品特殊的醇香風味，同時乙醇還可以與其他有機酸、醇類等風味相互轉換，并生成乙酸乙酯等重要的風味物質。由表4可知，所有的菌株均產醇，H34的產醇能力最強。

表4 各菌株的產氣產醇情況Table 4 Gas and alcohol production of each strain

3 結論

本實驗以農家自然發酵的臘肉為原料，從中分離出13株微生物，經菌落特征以及DNA序列鑒定后，確定臘肉中有3種菌，分別為信陽臘肉中的漢遜德巴利酵母、季也蒙畢赤酵母，以及湖南臘肉中的假絲酵母。其中，季也蒙畢赤酵母在不同pH、NaCl濃度、亞硝酸鹽濃度等條件下的生長能力均符合發酵肉制品菌株的基本要求，且該菌株的生長速度較快，可作為肉制品發酵劑的潛在菌株；假絲酵母和漢遜德巴利酵母可以在高pH的環境下進行發酵。這3種酵母菌有望在臘肉的工業生產中作為發酵菌種進行使用。