鈉鹽替代物對馬蘇大馬哈魚子醬品質的影響

武瑞赟，王 安，穆文強，龐 德，李平蘭

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

魚子醬被稱為世界三大珍味之首，與鵝肝、松露并稱三大美食，也是國內經濟魚養殖產業的主打產品。魚籽食品營養物質種類齊全，富含蛋白質、維生素、必需氨基酸和礦物質等營養元素，近年來，需求呈現持續增長的態勢。魚籽的加工工藝中，為了去腥和延長貨架期，鹽漬是主要的處理環節。鹽漬過程中使用到的調料主要是氯化鈉，氯化鈉的使用不僅可以給產品帶來典型的咸味口感以及去除腥味的作用，同時，氯化鈉具有較高的滲透壓，使微生物細胞脫水、變形并影響微生物細胞中水分的代謝，從而抑制其生命活動，減緩有害微生物的生長，使魚子醬等產品的安全性和可食用性得到了保障。

雖然氯化鈉在居民日常飲食中必不可少，但是大量的流行病學、臨床實驗研究表明，過量的鈉攝入會導致高血壓、心血管疾病，而高血壓會導致心肌梗死、功能衰竭等。世界衛生組織《2030年可持續發展議程》中提到，每年約有410 萬人因鈉鹽攝入過量而死，所以被認為是人類不可忽視的“健康殺手”。Du Shufa等對食鹽使用量數據進行匯總分析發現，在過去的30 年里，中國人均鈉攝入量在逐步降低，但仍然是世界衛生組織推薦值（＜2.0 g/d）的2 倍，超過1/4的人鈉攝入量大于5.0 g/d。由此可見，我國的減鹽防控工作仍然任重而道遠。

如何降低氯化鈉含量又不影響鹽漬后魚子醬的品質？當下，食品中減鹽的措施主要集中在降低鹽含量、改變鹽粒形態、改善加工工藝，以及添加鈉鹽替代 物等方式。其中，鈉鹽替代物主要是通過對產品中使用的氯化鈉進行部分替代，減少鈉離子的攝入，從而達到減鹽的目的。相較于其他方法，此方法因成本較低、操作方便的特點，以及鈉鹽替代物在口感上具有和鈉鹽相同的作用，均能夠作為氯化鈉的替代物來使用并賦予食物咸味特征，因此被廣泛應用于食品減鹽。然而，鈉鹽替代物種類較為單一，目前主要為氯化鹽（如氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂等），其他替代物還未被全面使用，因次，開發復合鈉鹽替代物具有實際的應用前景。

實驗室前期對魚籽營養成分進行了全面的檢測分析，發現魚籽中水溶性蛋白和維生素含量最多，水洗能夠造成營養物質的流失。因次，在魚子醬的實際生產中應減少水洗次數，但又得保證鹽漬的作用可以得到發揮。在此基礎上，本研究擬采用多種鈉鹽替代物聯合使用的方法，以微生物為評價指標，通過單因素試驗、Plackett-Burman（PB）試驗、最佳陡坡試驗和響應面優化試驗，確定最佳的鈉鹽復合替代物配方，以期降低氯化鈉的使用量，減少魚子醬中的鈉含量；進一步通過對pH值、水分活度（water activity，）、色差等品質特性的研究，比較全面地反映鈉鹽替代物的減鹽效果與對馬蘇大馬哈魚子醬品質及貨架期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬蘇大馬哈魚籽 北京市鱘魚、鮭鱒魚水產創新團隊。

氯化鉀、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、乳酸鉀、乳酸鈣 湖北藍天有限責任公司；平板計數瓊脂（PCA） 北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

DNP-9162電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；SCL-1300超凈工作臺 北京賽伯樂儀器有限公司；YXQ-LS-S高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司；ML54-02分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HD3A智能水分活度測量儀 無錫市華科儀器儀表有限公司；TA-XT2i質構儀 英國Stable Micro Systems公司；NH-300色差儀 日本Konica Minolta 公司；KDN-1000自動凱氏定氮儀 杭州綠博儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚子醬制備

將新鮮魚籽解凍，用去離子水清洗去除雜質后，按照下述工藝進行魚子醬制備：原料→清洗→挑選→鹽漬→ 清洗→瀝干→包裝→冷藏。其中鹽漬過程，加入水的質量與魚籽質量比1∶1，用鹽量4%，鹽漬時長10 min，清洗時長5 min，后保存在27 ℃（常溫）條件下。整個過程均于無菌超凈臺進行，所使用的器具均為食品級。

1.3.2 單因素試驗

以貯藏12 h魚子醬的微生物菌落總數為指標，在僅使用氯化鈉（100%）鹽漬的基礎上，進行單因素試驗，針對乳酸鉀、氯化鉀、氯化鎂與抗壞血酸鈣4 種替代物，分別按照10%、20%、30%、40%與50%的替代比例設置試驗組，探求不同鈉鹽替代物的最佳替代比例。

1.3.3 PB試驗

PB試驗可從最少的試驗次數中從多因素中準確、便捷地篩選出顯著性影響因素。根據單因素試驗結果，利用Design-Expert軟件設計PB試驗（表1），響應值為貯藏12 h魚子醬的菌落總數。對各因素進行方差分析，并根據貢獻率大小從中篩選出貢獻率較高的3 個因素進行下一步研究。

表1 PB試驗因素與水平編碼表Table 1 Code levels and corresponding actual levels of variables used in PB design

1.3.4 最佳爬坡試驗

根據PB試驗的步長效應與結果，綜合分析菌落總數，得到顯著因素及響應值，以高替代比例為優先原則，設計爬坡試驗的方向和步長。方向根據顯著因素的效應值表現為增加或減少，步長根據單因素試驗結果確定，試驗設計如表2所示。

表2 最陡爬坡試驗設計Table 2 Design of the steepest grade test

1.3.5 Box-Behnken響應面試驗

選取乳酸鉀、氯化鉀、氯化鎂替代比例3 個因素作為自變量，使用Design Expert軟件設計響應面試驗，由最佳陡坡試驗中選擇的最優替代比例作為響應中心點，以貯藏12 h魚子醬的菌落總數為響應值，因素與水平編碼如表3所示。

表3 Box-Behnken響應面試驗因素與水平編碼表Table 3 Code levels and corresponding actual levels of variables used in Box-Behnken design

1.3.6 菌落總數測定

稱取1 g魚籽醬，破碎，振蕩均勻后取上清液備用。根據GB 4789.1—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 總則》進行平板計數，吸取100 μL樣品溶液進行涂布，在恒溫培養箱培養后計數，培養溫度37 ℃，以菌落形成單位在30～300 CFU/g為宜。

1.3.7 OD測定

稱取2 g馬蘇大馬哈魚子醬實驗組與對照組樣品，加入8 mL去離子水，破碎攪拌均勻后，8 000 r/min離心10 min，取上清液測定OD。

1.3.8 pH值測定

準確稱量0.2 g魚籽醬，加入0.8 mL去離子水，將魚籽破碎均勻后，靜置沉淀，使用電子pH計測定上清液的pH值。

1.3.9 色澤測定

采用色彩色差計，在自然燈光下測定魚子醬的亮度值（*）、紅度值（）和黃度值（*），每組樣品測定3 次。

1.3.10測定

不僅可以表示食品中水的能量狀態，又能揭示食品質量變化和微生物繁殖對其水分的可利用程度，是食品加工過程及成品質量的重要控制參數和監控指標。取適量實驗組與對照組馬蘇大馬哈魚子醬樣品分別于水分測量皿中，在0、6、12、18、24 h進行取樣。使用水分活度測量儀檢測樣品，測量時間10 min，示數穩定后記錄數值。

1.4 數據處理

每組實驗重復測定3 次，數據以平均值±標準差表示。使用SPSS Statistix 25.0軟件進行均值計算及方差分析，采用Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

由圖1可知，使用不同替代比例的鈉鹽替代物進行鹽漬后，微生物數量均呈現波動趨勢，說明鈉鹽的含量對微生物生長具有一定的作用。另外，考慮過高或過低的替代比例可能會帶來不適口感等影響，通過單因素試驗得到的乳酸鉀、氯化鉀、氯化鎂及抗壞血酸鈣的替代比例分別為10%、20%、10%、40%。

圖1 不同鈉鹽替代物單因素試驗結果Fig. 1 Effect of individual sodium salt substitutes on total bacterial count investigated by one-factor-at-a-time method

2.2 PB試驗結果

選擇對乳酸鉀替代比例（）、氯化鉀替代比例（）、 氯化鎂替代比例（）和抗壞血酸鈣替代比例（） 4 個因素進行分析，考察各個因素對魚子醬菌落總數的影響，根據單因素試驗中各因素的較適范圍，以菌落總數為響應值，PB試驗設計及結果如表4所示。

表4 PB試驗設計及結果Table 4 PB design and experimental results

表6 PB試驗整體因素模型方差分析表Table 6 Analysis of variance for the effect of substitution levels of four non-sodium salts for NaCl on total bacterial count as per PB design

由表5～6可知，氯化鉀替代比例（）、氯化鎂替代比例（）和抗壞血酸鈣替代比例（）3 個因素對菌落總數的增加顯示為正效應，乳酸鉀替代比例（）顯示為負效應，抗壞血酸鈣替代比例貢獻率最低（0.19）， 因此選擇乳酸鉀替代比例、氯化鉀替代比例、氯化鎂替代比例3 個影響最顯著的因素進行下一步的最陡爬坡試驗。

表5 PB試驗設計因素水平及效應分析Table 5 Low and high levels of variables and effect analysis as per PB design

2.3 最佳爬坡試驗結果

當擬合區域越靠近響應值中心，響應面擬合方程越精準。最佳爬坡法以各因素正負效應值確定爬坡方向，能夠準確逼近最佳值區域。依據PB試驗結果設計最佳爬坡路徑，其中乳酸鉀替代比例為負效應，應減少，氯化鉀、氯化鎂替代比例為正效應，應增加。按照因素水平的變化方向及步長設計試驗。

由圖2可知，3號樣品的初始菌落總數較高，但后續貯藏12、18、24 h均發現3號樣品的抑菌效果均優于其他組樣品，故以3號樣品的因素與水平為響應面試驗的中心點。

圖2 最佳陡坡試驗拐點圖Fig. 2 Inflection point for total bacterial count in samples stored for different periods of time as per steepest ascent design

2.4 Box-Behnken響應面試驗結果

根據PB試驗和最佳陡坡試驗的結果（乳酸鉀替代比例17.5%、氯化鉀替代比例15.0%、氯化鎂替代比例35.0%），采用響應面Box-Behnken試驗進一步優化，響應面試驗設計及結果如表7所示。

表7 復配鹽最佳配方的響應面試驗結果Table 7 Box-Behnken design and experimental response

根據Box-Behnken響應面試驗結果，建立回歸模型并進行方差分析，由表8可知：模型值小于0.000 1，高度顯著，說明與實際情況擬合良好；失擬項結果表明，未知因素對實驗結果干擾小（值為0.914 0，不顯著）；該模型的決定系數=0.936 1，說明該模型擬合較好。對于魚子醬產品，當菌落總數達到6.00（lg（CFU/g））即可認為產品腐敗，實驗中發現，在27 ℃放置12 h時菌落總數達到 6.00（lg（CFU/g）），因此以27 ℃放置12 h的菌落總數為響應值建立響應面模型。

表8 響應面試驗結果回歸模型方差分析Table 8 Analysis of variance of quadratic polynomial model

由圖3可知，等高線圖均為橢圓形，響應面三維圖具有穩定點，且為最大值。對結果進行擬合處理得到的曲線為：=6.316 2-0.031 2-0.010 0- 0.009 0＋0.007 5＋0.025 0＋0.036 7＋0.109 2＋0.072 3。

圖3 乳酸鉀、氯化鉀和氯化鎂替代比例對菌落總數影響的 等高線圖和響應面圖Fig. 3 Response surface and contour plots showing the individual and interactive effects of variables on total bacterial count

參照以上試驗結果得到的最優鈉鹽替代物復合配方為乳酸鉀替代比例18.55%、氯化鉀替代比例15.105%、氯化鎂替代比例35.08%，即當正常組氯化鈉使用量為4%時，最優鈉鹽替代物復合配方為乳酸鉀添加量0.74%、氯化鉀0.60%、氯化鎂1.40%，在保證鹽漬鹽使用量不變的基礎上可將氯化鈉使用量降至1.26%。

以乳酸鉀0.74%、氯化鉀0.60%、氯化鎂1.40%添加量為實驗組，氯化鈉組為對照組，進一步測定魚子醬貯藏過程中品質特性。

2.5 魚子醬貯藏過程中指標變化

2.5.1 OD的變化

OD與透光率呈負相關。由圖4可知，實驗組與對照組的初始OD分別為0.375±0.002、0.322±0.040。27 ℃貯藏條件下，隨貯藏時間延長均呈現上升趨勢，但是實驗組的OD上升趨勢較對照組緩慢，到達旺盛生長的對數期所需時間也較長，這與菌落總數的測定結果一致，說明微生物繁殖速度減緩，實驗組較對照組可有效抑制微生物的生長。

圖4 魚子醬貯藏過程中OD600 nm的變化Fig. 4 Changes in OD600 nm in caviar during storage

2.5.2 pH值的變化

由圖5可知，在貯藏過程中，魚子醬的pH值總體均呈現波動趨勢，這主要是因為貯藏過程中，磷酸肌酸等物質分解產生磷酸等酸性物質，使魚子醬的pH值下降，但隨著貯藏時間的延長，魚子醬中的內源性酶和表面微生物分解蛋白質等含氮化合物，產生較多的堿性物質，造成pH值上升。由于貯藏溫度與鹽漬過程使用的鹽用量不同，使上下波動趨勢快慢程度不同，各處理組均呈現波動趨勢，但是相比對照組而言，實驗組的變化趨勢較為緩慢，說明實驗組的微生物活動滯后，腐敗程度與菌落總數存在一定的關系，與菌落總數分析結果基本一致，說明得到的低鹽替代配方可以有效減緩微生物活性，進而延緩魚子醬腐敗進程。

圖5 魚子醬貯藏過程中pH值的變化Fig. 5 Changes in pH value of caviar during storage

2.5.3 色澤的變化

魚籽本身的生化、微生物變化的外部表現之一是色澤變化，而色澤變化與魚籽的新鮮度有直接關系。由表9 可知，魚籽醬貯藏過程中，*呈現上升趨勢但有所波動，這可能是由于在貯藏前期，溫度過高，魚籽表面水分損失較大，表面變得干燥，因此缺少水分的折射，*降低，隨著微生物的加速繁殖與相關酶的作用，魚籽逐漸腐敗萎縮，持水力下降，水分向魚籽表面滲透，使得表面濕潤程度增加，造成*上升。此時，魚籽質地逐漸變軟。實驗組與對照組魚籽醬的*在貯藏期間呈現先上升后降低的趨勢，變化幅度較大。這可能與貯藏過程中水分的析出有關，貯藏前期，表面水分減少，魚籽表面變得干燥，使*上升，在貯藏時間到達6 h時，魚籽的*升高到最大值，即紅色加深；在后續的貯藏過程中，由于水分的析出，表面由干燥逐漸濕潤，*逐漸降低。實驗組與對照組魚籽醬的*均呈現升高的趨勢，變化幅度較大。

表9 魚子醬貯藏過程中色澤的變化Table 9 Color change of caviar during storage

2.5.4的變化

由圖6可知，實驗組與對照組魚子醬在27 ℃的貯藏溫度下呈現基本一致的變化趨勢，且均大于0.90。這與色澤的測定結果相吻合：貯藏過程中，魚籽表面與內部的水分存在遷移現象，導致出現波動，但由于貯藏環境為封閉的恒溫培養箱，空氣流速較小，水分蒸發也較慢，導致實驗組與對照組的雖呈波動趨勢，但總體變化不大。

圖6 魚子醬貯藏過程中aw的變化Fig. 6 Changes in aw in caviar during storage

3 結 論

本研究以微生物菌落總數為指標，經單因素、響應面等試驗確定魚子醬中最佳鈉鹽復合物替代配方為乳酸鉀、氯化鉀、氯化鎂的替代比例分別為17.64%、14.61%、34.36%。通過與正常組魚子醬進行對比發現，實驗組魚子醬持續保持在0.9以上、*均呈現升高的趨勢、OD增長緩慢，表明優化得到的鈉鹽替代物復合鹽可以在一定程度上延長魚子醬貨架期，延緩魚子醬產品的腐敗進程。因此，該鈉鹽替代物復合鹽配方可用于魚子醬的制備，且能夠提高產品質量和安全性，在鹽漬品加工行業具有良好的應用潛力。