低鹽和高鹽條件下L-組氨酸對肌原纖維蛋白 結構及體外消化特性的影響

郭秀云，徐雙意，曹思瑜，張雅瑋,*

（1.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.揚州大學旅游烹飪學院·食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225009）

食鹽作為最普通的咸味劑，對肉制品風味、質構、貨架期及加工過程起著至關重要的作用。在肉制品的加工過程中，通常需要添加較高含量（3%～4%）的食鹽以獲得良好的產品品質。據統計，人們從肉制品中攝入的食鹽約占食鹽總攝入量的25%。我國是傳統高鹽飲食國家，過多攝入食鹽容易引發高血壓等心血管疾病，降低食鹽用量已引起足夠重視。目前，針對降低肉中食鹽用量國內外已進行了廣泛研究，主要通過直接降低氯化鈉（sodium chloride，NaCl）用量、利用鉀鹽、鎂鹽及鈣鹽進行部分替代、改變加工工藝等途徑來減少食鹽的 攝入。然而降低肉中食鹽用量，或采用鉀鹽、鎂鹽或鈣鹽替代部分食鹽將影響肉品的加工特性，主要表現在鹽滲透速率減慢、彈性及硬度下降等。

近年來，氨基酸在肉制品中的應用越來越受到國內外學者們的關注，已有諸多文獻報道，-組氨酸（-histidine，His）作為風味增強劑，在協同增強咸味感知的同時能夠顯著改善肌肉蛋白理化特性、凝膠特性及乳化特性，從而提高肉制品保水、質構、色澤等品質特性。Zhang Yawei等研究發現，His對咸味具有協同增強的作用。Guo Xiuyun等研究發現，低鹽濃度溶液中，His的添加能夠引起肌球蛋白分子發生解折疊，二級結構中的-螺旋結構轉變成-折疊、-轉角、無規則卷曲結構，暴露更多的疏水基團和巰基基團至肌球蛋白表面，從而提高了蛋白溶解度。Hayakawa等研究發現，His能夠拉長肌球蛋白桿狀區域，從而使得肌球蛋白纖絲弱化，進而增加肌球蛋白在低離子強度條件下的溶解度。Zhang Yawei等進一步研究發現，His能夠改變肌球蛋白熱誘導凝膠特性，減少凝膠網絡中水的移動性和自由水含量，提高凝膠硬度、保水性，降低蒸煮損失。此外，Guo Xiuyun等研究表明，低鹽條件下His能夠通過改變界面肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）結構及吸附特性進而提高乳液的穩定性。

隨著生活水平的日益提高，人們越來越注重產品的營養價值。肉制品作為人類膳食優質蛋白的主要來源，對人體具有重要的生物學意義。因而如何維持或提高肉制品的營養特性是研究熱點。蛋白質消化率是反映食物中的蛋白質在消化道內被消化酶分解程度的一項指標，是評價食物蛋白質營養價值的重要指標之一。而蛋白質的消化率和營養價值與肉類加工及貯藏過程中發生的蛋白質結構改變密切相關。前期研究表明，His能夠改變肌球蛋白結構，進而改善低鹽條件下蛋白的功能特性，而蛋白的結構改變可能會引起其消化特性的變化，最終影響肉制品營養價值。但關于低鹽（0.2 mol/L）條件下His的添加對MP消化特性的影響規律及作用機制尚不清楚。

因此，本研究以高鹽（0.6 mol/L NaCl）條件作為對照，通過研究低鹽（0.2 mol/L NaCl）及高鹽條件下添加His對豬肉MP結構及體外消化特性的影響，為研究低鹽條件下His對MP營養價值的影響提供依據，為低鹽肉制品的開發和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背最長肌購于菜大全江蘇省南京市玄武區孝陵衛市場店。

His、胃蛋白酶、胰蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司；NaCl、KCl、Tris、NaHPO、NaHPO、MgCl、HCl、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸（ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid，EGTA）均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

Allegra 64R高速離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司； T25 digital高速勻漿機 德國IKA公司；Varioskan Flash酶標儀（多功能讀數儀） 賽默飛世爾科技有限公司；Labram HR 800顯微激光拉曼光譜儀 法國Jobin-Yvon公司；MASTERSIZER 3000激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；GelDoc XR＋凝膠電泳成像儀 美國Bio-Rad公司；HJ-4多頭磁力加熱攪拌器 上海越眾儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

參考Han Minyi等的方法并稍作修改。將約300 g切碎的豬背最長肌解凍，加入4 倍體積的僵直提取緩沖液（含100 mmol/L Tris、10 mmol/L EDTA，pH 8.3），高速組織搗碎機攪碎約30 s，1 000×（＜4 ℃）離心20 min，收集沉淀。沉淀加入4 倍體積的提取緩沖液（含100 mmol/L KCl、20 mmol/L NaHPO/NaHPO、2 mmol/L MgCl、1 mmol/L EGTA，pH 7.0）溶解，高速分散10 s，1 000×、4 ℃離心10 min，收集沉淀，并重復2 次此步驟，后2 次離心前用2 層紗布過濾。沉淀加入4 倍體積的提取緩沖液（含體積分數1% Triton X-100，pH 7.0）溶解，高速分散10 s，1 500×、4 ℃離心10 min，收集沉淀，重復1 次。沉淀加入4 倍體積0.1 mol/L KCl溶液溶解，高速分散10 s，1 500×、4 ℃離心10 min，收集沉淀，重復此步驟。沉淀加入4 倍體積蒸餾水溶解，高速分散10 s，1 500×、4 ℃離心10 min，收集沉淀得到純化的豬肉無鹽MP于塑料燒杯中，24 h內使用。以上操作均需在冷庫（＜4 ℃）中進行。提取的豬肉MP用雙縮脲法測定質量濃度。

1.3.2 蛋白樣品制備

將5 g MP分別溶于50 mL不同處理溶液中，分別為0.2 mol/L NaCl、0.2 mol/L NaCl＋0.2 g/100 mL His、0.2 mol/L NaCl＋0.4 g/100 mL His、0.6 mol/L NaCl、0.6 mol/L NaCl＋0.2 g/100 mL His、0.6 mol/L NaCl＋0.4 g/100 mL His，制得6 組不同MP樣品，并將pH值調至6.5。

1.3.3 MP二級結構的測定

采用拉曼光譜儀測定MP二級結構。拉曼光譜所用功率為100 mW。使用前，需要通過單晶硅進行光譜頻率校正，為使激光聚焦在載玻片上，可用50 倍長焦距鏡頭調節，以便于測試樣品。需要設置光譜參數為：開孔200 μm，光柵600 g/mm，光譜分辨率2 cm，獲取的光譜范圍400～3 600 cm，光譜數據獲取速率120 cm·min， 設定積分時間為60 s。-螺旋、-折疊、-轉角和無規則卷曲的相對含量用Alix等的方法計算。

1.3.4 MP表面疏水性的測定

通過8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光探針法測定MP的表面疏水性。將1 mg/mL MP樣品用0.01 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）溶解，攪拌均勻，用上述緩沖液將溶液稀釋至質量濃度0.01～0.10 g/100 mL，保持在20 ℃，靜置穩定12 h。用移液槍分別吸取樣品2 mL，加入20 μL 8 mmol/L ANS，通過微型旋渦混合儀使其混合均勻，靜置5 min。設定參數：激發波長374 nm，狹縫校正5 nm，發射波長485 nm，狹縫校正5 nm。用熒光強度對蛋白質質量濃度作曲線的斜率表示蛋白質表面疏水性。

1.3.5 體外消化率的測定

參考Wen Siying等方法并作修改。建立體外胃-腸道消化模型，分別稱取5 mL 30 mg/mL MP溶液，加入37 mL 10 mmol/L HCl溶液，用均質機在7 500 r/min條件下均質30 s，隨后加入8 mL 1 mg/mL胃蛋白酶（溶于10 mmol/L HCl）。所得混合物終濃度為：蛋白質量濃度4 mg/mL、胃蛋白酶含量4%（/，以蛋白質量為基準），pH 2.0。混合均勻后置于37 ℃水浴中酶解1 h。用1 mol/L NaOH調節pH值為7.5以滅活胃蛋白酶，結束反應。隨后加入相應劑量的胰蛋白酶（4%，/，以蛋白質量為基準，pH 7.5）于37 ℃水浴中保溫消化2 h。反應結束后，反應物于沸水中加熱滅酶10 min，冷卻至室溫，離心（11 000×、15 min、4 ℃），收集上清液即為體外胃腸道消化產物。上清液蛋白質含量通過凱氏定氮法測定，體外消化率計算公式如下。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

參照Laemmli的方法進行。反應結束后，經過胃蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的每管反應液內分別加入4×樣品緩沖液，95 ℃下加熱10 min，室溫冷卻。取10 μL上樣，使用4%濃縮膠、12%分離膠，用考馬斯亮藍R-250染色。

1.3.7 消化產物粒徑的測定

參照Gatellier等方法并稍作修改。取勻漿后、胃蛋白酶酶解、胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解后的溶液，使用激光粒度儀測定物質粒度大小。獲取的數據如下：、、分別表示樣品的累計粒度分布數達到10%、50%、90%時所對應的粒徑；表示體積平均徑，表示表面積平均徑。

1.4 數據處理

所有實驗設置3 個重復，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS軟件進行雙因素方差分析。采用鄧肯多重比較法（Duncan’s multiple range test）進行差異顯著性分析（＜0.05）。采用Origin 8軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 MP二級結構分析

由圖1可知，在低鹽或高鹽濃度條件下，His處理均使MP的-螺旋結構減少，并轉變成其他二級結構。在低鹽濃度條件下，0.2 g/100 mL His和0.4 g/100 mL His處理使得MP的-螺旋結構相對含量由61.09%分別降至59.87%和57.33%（＜0.05）；在高鹽濃度條件下，0.2 g/100 mL His和0.4 g/100 mL His處理使得-螺旋結構相對含量由68.45%分別降至56.58%和47.16% （＜0.05）。這與Guo Xiuyun等研究結果相一致，該研究認為His可通過靜電相互作用與肌球蛋白中酸性氨基酸殘基結合，從而破壞肌球蛋白分子內及分子間的離子鍵，導致肌球蛋白發生解折疊。同時，隨著His添加量的增加，MP的-螺旋結構相對含量明顯降低，MP解折疊程度與His添加量之間呈現明顯的劑量依賴性關系。

圖1 不同鹽濃度條件下His對MP二級結構的影響Fig. 1 Effect of His on secondary structure of MP at different salt concentrations

2.2 MP表面疏水性分析

蛋白質表面疏水性的變化情況可以用來衡量蛋白質分子空間結構的變化。由表1可知，MP表面疏水性隨著鹽濃度的提高而提高，這與Supanwa等的研究結果相一致。隨著鹽濃度的升高，MP開始解聚集，呈單體狀態，疏水基團逐漸暴露。在低鹽濃度下，0.2 g/100 mL His和0.4 g/100 mL His處理使得表面疏水性分別升高21.75%和28.91%（＜0.05）；高鹽濃度下，0.2 g/100 mL His和0.4 g/100 mL His處理使得表面疏水性分別升高5.54%和10.50%（＜0.05）。說明在不同鹽濃度條件下，His處理都能明顯提高MP的表面疏水性。His處理破壞了MP的分子結構，使得芳香氨基酸基團暴露至肌球蛋白表面。同時，相同鹽濃度條件下，0.4 g/100 mL His的作用顯著高于0.2 g/100 mL His （＜0.05），這與MP二級結構變化相一致。在pH 6.5條件下，His帶有正電荷，而MP帶有負電荷。His可通過靜電作用與MP中酸性氨基酸殘基相結合，破壞維持MP二級結構穩定性的分子間及分子內離子鍵，從而導致MP解折疊并暴露MP分子內以及由于蛋白聚集而埋藏的疏水基團。王耀松等也曾研究發現，His在一定程度上能促進乳清蛋白分子間解聚集、單個蛋白分子結構展開，從而使更多的疏水性基團外露。

表1 不同鹽濃度條件下His對MP表面疏水性的影響Table 1 Effect of His on surface hydrophobicity of MP at different salt concentrations

2.3 MP體外消化率分析

由表2可知，在胃蛋白酶消化階段，MP得到初步消化，消化率在50%左右（46.81%～51.66%）。這與馬紀兵等研究傳統風干牦牛肉加工中MP氧化與體外蛋白酶消化階段消化率的變化結果一致。相比于胃蛋白酶消化階段，胰蛋白酶消化后中各樣品的消化率顯著上升 （＜0.05），說明在胰蛋白酶的作用下，MP進一步被水解消化。這是因為在蛋白質的胃消化階段，胃蛋白酶主要作用的部位是蛋白質中酸性氨基酸或芳香族氨基酸所組成的肽鍵。于娜的研究表明，胃蛋白酶傾向于剪切氨基端或羧基端為芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）或亮氨酸的肽鍵，而如果某一肽鍵氨基端第3個氨基酸為堿性氨基酸（如賴氨酸、精氨酸和組氨酸）或者該肽鍵的氨基端為精氨酸時，則不能有效對此肽鍵進行剪切。胰蛋白酶能選擇性水解蛋白質中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構成的肽鏈，并能在胃蛋白酶初步消化的基礎上繼續消化變性的蛋白質，因而胰蛋白酶消化后消化率顯著高于胃蛋白酶消化階段的消化率。

表2 不同鹽濃度條件下His對MP體外消化率的影響Table 2 Effect of His on in vitro digestibility of MP at different salt concentrations

此外，不論在胃蛋白酶消化階段還是胰蛋白酶消化階段，MP體外消化率隨著鹽濃度的提高而提高。且添加His處理后的MP消化率均顯著高于對照組 （＜0.05），而0.2 g/100 mL His處理組MP消化率顯著高于0.4 g/100 mL His處理組（＜0.05）。蛋白質的結構變化會影響蛋白質被蛋白酶水解的速率。MP結構信息研究結果表明，0.2 g/100 mL His處理可引起MP結構的輕度變化，使其發生部分解折疊，暴露出更多的酶切位點，使得胃蛋白酶、胰蛋白酶更容易與MP結合，利于酶消化，從而提高MP體外消化率。而0.4 g/100 mL His處理組的MP解折疊程度顯著高于0.4 g/100 mL His處理組，這可能導致MP與胃蛋白酶、胰蛋白酶結合的位點被修飾，從而降低胃蛋白酶、胰蛋白酶對其水解的 敏感性，因而0.4 g/100 mL His處理組的MP體外消化率低于0.2 g/100 mL His處理組。總而言之，在低鹽或高鹽濃度條件下，添加His均能提高MP的消化率，從而使更多的可溶性蛋白在胃腸道中得以釋放，進而更有利于人體的吸收。

2.4 SDS-PAGE分析

由圖2A可知，MP經胃蛋白酶消化后，大分子蛋白被水解，MP中的主要蛋白質肌球蛋白重鏈和肌動蛋白均部分水解成不同多肽片段，且胃蛋白酶對肌球蛋白重鏈的水解作用強于對肌動蛋白的水解作用。高鹽濃度（0.6 mol/L NaCl）處理后的條帶灰度明顯低于低鹽濃度（0.2 mol/L NaCl）處理，這是由于高鹽濃度條件下蛋白溶解度高，蛋白更加分散，更易于胃蛋白酶消化。此外，His處理組的條帶灰度均明顯低于未添加His的處理組，說明His促進了胃蛋白酶對MP的水解。由圖2B可知，MP經胰蛋白酶進一步水解后，大分子的蛋白或多肽均被完全水解，形成小分子的多肽或氨基酸。總之，經過胃蛋白酶、胰蛋白酶2 步消化后，不同處理組電泳條帶灰度與消化前相比發生明顯變化，顯著變淺甚至消失，蛋白發生大幅降解，這與Paolella等研究的模擬體外胃腸道消化后火腿MP的電泳結果一致。而低鹽或高鹽條件下添加His均能顯著促進胃蛋白酶/胰蛋白酶對MP的水解，與體外消化率結果相一致。

圖2 體外消化產物的SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE patterns of in vitro digested MP

2.5 消化產物粒徑分析

由表3可知，經胃蛋白酶消化后，高鹽濃度處理組的MP消化產物粒徑均顯著低于低鹽處理組，且添加His處理的MP經消化后其粒徑指標、、、和均顯著降低（＜0.05）。再經過胰蛋白酶消化后，MP消化產物的各項粒徑指標與胃蛋白酶消化后相比進一步減小，這與詹光等的研究結果相一致。且胰蛋白酶消化結果與經過胃蛋白酶消化后的變化趨勢一致，高鹽濃度處理組MP消化產物粒徑均顯著低于低鹽處理組，且添加His處理的MP經消化后其粒徑指標、、、和均顯著降低 （＜0.05）。如SDS-PAGE圖譜所示，經胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后，MP發生降解，大分子質量蛋白被水解成小分子質量的多肽或氨基酸，進而使得消化產物粒徑下降。而His的添加能夠進一步促進MP水解，從而降低消化產物粒徑。Promeyrat等研究表明，蛋白質疏水性與粒徑相關。經His處理的MP表面疏水性增大，疏水基團暴露增加，進而提供了更多酶切位點，使得MP中的疏水性氨基酸基團組成的肽鍵能被胃蛋白酶和胰蛋白酶更加高效地水解，MP降解程度更高，從而導致胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的MP粒徑小于未添加His處理組。

表3 不同鹽濃度條件下His對MP體外消化產物粒徑的影響Table 3 Effect of His on particle size of in vitro digested MP at different salt concentrations

3 結 論

本研究分析低鹽及高鹽條件下0、0.2、0.4 g/100 mL的His添加量對豬肉MP結構及體外消化特性的影響。結果表明，在低鹽和高鹽條件下，His的添加均引起MP發生解折疊，從而暴露出更多酶切位點，促進胃蛋白酶和胰蛋白酶對MP的酶解作用，降低酶解粒徑并提高MP體外消化率。本研究結果為低鹽肉制品的開發和應用提供了參考。