運用網絡藥理學和分子對接技術探究氧化苦參堿治療骨關節炎的作用機制*

葉柏柏，林城，王心寧，常征輝，李林福

1.贛南醫學院，江西 贛州 341000； 2.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046

骨關節炎(osteoarthritis，OA)屬于膝關節退行性病變，故又稱退行性關節炎，通常表現為骨關節軟骨變形、破壞及增生等特點，因其患病人數和患病率都位列世界排行首位，被世界衛生組織定義為“第一致殘疾病”，致殘率高達53%[1]。據報道，OA已經給患者帶來了嚴重的經濟負擔，目前，我國OA患病率高達5.1%以上，而英國、美國成年人患病率就已高達5%～10%[2]。迄今為止，國內外依舊缺乏有效且經濟的治療方法來治愈OA。

氧化苦參堿(oxymatrine，OM)是苦參堿類生物堿，大量研究表明，其有多種生理藥性，如抗心律失常、抗感染、抗腫瘤、調節免疫、保護肝臟、抗病毒、抗氧化等[3-9]。OM有良好的藥代動力學(ADME)特性，通過TCMSP數據庫查詢到OM的OB(Oral Bioavailability)值為0.35，DL(Drug Like)值為0.28，而且OM的堿極性適中，易溶于水和醇類溶劑，方便藥物制劑。此外，OM在很多藥用植物中存在，具有來源廣泛的特性，尤其是苦參、苦豆子、白刺花等豆科植物中含量高達1%以上。基于上述成藥性好、經濟易得的優勢，使其具備良好的藥物開發前景。

有報道表明，OM治療OA具有顯著作用[10-11]。相對于其他常見的藥理活性，OM在治療OA方面的研究不多，尤其是機制方面不夠明確。網絡藥理學是一種高效的生物信息學工具，可用于預測活性成分治療疾病的候選靶點和潛在機制[12-13]。本課題組參照文獻[14]中采用的網絡藥理學方法，對OM治療OA的作用機制進行系統的預測，并輔以分子對接驗證，為后續的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 數據庫和軟件本研究所涉及的一些數據庫及軟件匯總，見表1。

表1 數據庫和軟件匯總

1.2 獲取化合物目標靶點在TCMSP數據庫中以“oxymatrine”為化合物名稱項檢索詞來獲取OM的目標靶點。同時，在ZINC數據庫檢索中以“oxymatrine”為化合物名稱項檢索詞以獲取OM的mol2格式，再將OM的mol2格式分子結構上傳到Pharm Mapper數據庫平臺，靶點類型選擇“Human Protein Targets Only”，設定靶點數為300，完成在該平臺OM目標靶點的預測。最后將兩個數據庫獲取的目標靶點合并去重，得到OM的目標靶點。

1.3 獲取OA潛在作用靶點以“osteoarthritis”為疾病項檢索詞，在OMIM和Gene Cards數據庫中檢索OA相關基因，合并從這兩個數據庫中獲取的基因，去重，將其相關基因編碼的蛋白作為藥物治療OA的潛在作用靶點。

1.4 OM和OA的交集靶點應用Draw Venn Diagram在線服務平臺將OM(drug)的目標靶點和OA(disease)的潛在作用靶點進行交集，將兩者交集出的靶點作為OM治療OA的潛在作用靶點。

1.5 構建蛋白互作網絡及篩選核心靶點于在線數據庫STRING 10.0 (http：//string-db.org) 中將獲取的交集基因上傳至“Multiple Proteins”項，在“Organism”項下選擇“Homo sapiens”“minimum required interaction score”選擇>0.70，在線生成PPI 網絡，計算度值最前的20個核心基因，并繪制其柱狀圖。

1.6 基因本體(gene ontology，GO)與京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析在Dvid V 6.7在線平臺(https：//david-d.ncifcrf.gov/home.jsp) 對交集所得到的基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。將閾值設定為P值<0.05后，取排在前20的GO term和KEGG通路，再用R包繪制氣泡圖進行分析。

1.7 構建交集基因-GO-KEGG網絡應用Cytoscape 3.7.1軟件 (http：//www.Cytoscape.org/) 構建交集基因-GO-KEGG網絡，將前面已獲取的交集靶點、GO富集分析結果和KEGG富集分析結果導入軟件，通過網絡節點度值(degree)的大小對網絡進行分析以探究苦參堿治療OA的作用機制。

1.8 分子對接驗證先以“oxymatrine”為關鍵詞在PubChem數據庫檢索下載其2D結構的SDF文件，再從RCSB PDB下載篩選出來的核心靶點蛋白質結構的PDB文件，運行Discovery studio 2019軟件將化合物小分子與核心靶點蛋白大分子對接驗證。

2 結果

2.1 OM治療OA的潛在靶點基于數據庫平臺Pharm Mapper及TCMSP在線檢索得到的化合物靶點經合并去重后，共得到155個OM目標靶點；基于數據庫平臺OMIM和Gene cards在線檢索得到的疾病相關基因經合并去重后，共得到3 114個OA相關基因。兩者經過韋恩圖交集，共得到80個OM治療OA的潛在靶點，見圖1。

圖1 交集后得到的OM治療OA的潛在靶點

2.2 構建蛋白互作網絡及篩選核心靶點將OM和OA的交集靶點導入STRING在線網絡平臺中，再選擇互作評分>0.70，得出PPI網絡圖，將離散點隱藏，統計得到244條邊和72個節點。按照度(degree)值排序篩選出最高的前30個蛋白質節點。核心節點是指某蛋白質擁有的邊數為所有蛋白質平均邊數兩倍以上的節點，即擁有的邊數>13.56。由圖2B可知，前30個蛋白質均>26，都為核心節點。其中，排名前5位的依此為：AKT1(26)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)(26)、SRC(23)、MYC(19)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)(18)，見圖2。

注：A：交集基因的PPI網絡圖；B：前30個核心交集基因柱狀圖圖2 交集基因PPI網絡圖和前30個核心交集基因柱狀圖

2.3 GO term富集分析采用DAVID在線服務平臺對OM治療OA涉及的80個蛋白質的GO term進行富集分析。對分析所得的結果進行篩選，設定 p.adjust<0.05以及FDR<0.05，涉及到分子功能的條目共有119個，再按照P值列出前20個較為顯著的條目，見圖3。由圖3可知，OM治療OA時涉及的基因功能主要有：endopeptidase activity(內肽酶活性)、DNA-binding transcription factor binding(DNA結合轉錄因子結合)、DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase II-specific(DNA結合轉錄激活因子活性，RNA 聚合酶 II 特異性)、DNA-binding transcription activator activity(DNA結合轉錄激活劑活性)、nuclear receptor activity(核受體活性)。

圖3 交集基因GO term富集的前20個條目

2.4 KEGG通路分析采用DAVID在線服務平臺對OM治療OA涉及的80個蛋白質的KEGG通路進行富集分析。對分析所得結果進行篩選，設定p.adjust<0.05以及FDR<0.05，涉及到治療OA的信號通路共有129個，再按照P值列出前20個較為顯著的條目，見圖4。由圖4可知，OM用于治療OA時涉及的信號通路主要有：proteoglycans in cancer (癌癥蛋白聚糖)、PI3K-Akt signaling pathway(磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶 B 信號通路)、Lipid and atherosclerosis(血脂和動脈粥樣硬化)、MAPK signaling pathway(MAPK信號通路)、Chemical carcinogenesis receptor activation(化學致癌受體激活)、Prostate cancer(前列腺癌)。

圖4 交集基因KEGG通路富集的前20個條目

2.5 交集基因-GO-KEGG網絡分析如圖5所示，在交集基因-GO-KEGG網絡圖中，涉及到OM治療OA的交集基因有63個節點、GO term有10個節點和KEGG信號通路有10個節點。其中，長方形為交集基因，三角形為GO term，V形為KEGG信號通路，每兩個節點之間有連接就說明他們之間有潛在的聯系，GO term-交集基因邊106條以及KEGG信號通路-交集基因邊143條，這說明OM治療OA時，可能涉及多個靶點，有多種生物效應共同參與，并存在多種作用機制。按度值大小排序，前五的交集基因依次為：RELA(13)、AKT1(12)、ESR1(9)、GRB2(9)、PPARA(9)。

2.6 分子對接結果將從PubChem數據庫檢索下載得到的OM三維結構(SDF格式)與篩選出前5個核心靶點進行分子對接驗證。小分子與靶點的對接結果為：Libdockscore>100時，表明兩者能夠自由、穩定對接。如表2所示，OM與各靶點對接得到的Libdockscore均>92，表明OM和核心靶點能夠相對穩定地對接，見表3。由圖6可知，OM主要是通過傳統氫鍵、碳氫鍵、P-Pi共軛、堿基孤對電子與靶點結合。

注：長方形為交集基因，三角形為GO term，V形為KEGG信號通路圖5 交集基因-GO-KEGG網絡圖

表2 分子對接結果

圖6 Oxymatrine與核心靶點對接示意圖

表3 基因表達蛋白及蛋白RCSB號

3 討論

OA是由于關節退行性功能失調引起的慢性疾病，病因包括老年化、肥胖、運動損傷、炎癥及遺傳易感性等[15]，該病程所涉及的生物效應數不勝數，分子機制更是復雜，已經報道證實的就有PERK/Bip信號通路、p38MAPK信號通路、Wnt/β-catenin 信號通路、NF-κB信號通路、TLR/MyD88信號通路、TGF-β /BMPs信號通路、細胞骨架信號通路，以及某些與他們存在cross-talk的信號通路等[16-20]。使用不同的活性成分治療OA，其治療過程中涉及的靶點、機制各有不同[21-23]。在本研究中，共交集得到80個OM治療OA的目標靶點，獲取AKT1、IL-6、SRC、MYC和TNF等核心靶點，富集到119個GO條目和129條KEGG通路。GO條目和KEGG通路中，涉及最多的基因依次為：RELA、AKT1、ESR1、GRB2、PPARA。

本研究經PPI網絡分析得到AKT1、IL-6、SRC、MYC和TNF等核心靶點，表明OM治療OA時，上述蛋白質參與的概率最高，被旁路激活的可能性最大。而如上述的GO條目和KEGG通路中涉及最多的基因為：RELA、AKT1、ESR1、GRB2、PPARA。這表明，在優選的GO條目和KEGG通路中，RELA、AKT1、ESR1、GRB2、PPARA的共有率最高。將兩種情況進行比較分析，發現均存有AKT1，表明其代表性較強，具有一定的研究意義，后續值得關注。

GO條目中，P值較為顯著的前5個依次為：endopeptidase activity(內肽酶活性)、DNA-binding transcription factor binding(DNA結合轉錄因子結合)、DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase II-specific (DNA 結合轉錄激活因子活性，RNA 聚合酶 II 特異性)、DNA-binding transcription activator activity(DNA結合轉錄激活劑活性)、nuclear receptor activity(核受體活性)，他們與OA的發病有著密切聯系。內肽酶活性可催化多肽鏈中內部α-肽鍵的水解，如MMP-3作為具有細胞外活性的鋅依賴性內肽酶，在OA的產生過程中起著重要作用[24]。DNA結合轉錄因子結合則是通過與基因調控區內特定的DNA序列相互作用來調節轉錄。DNA 結合轉錄激活因子活性是指RNA 聚合酶II特異性激活或增加由RNA聚合酶II轉錄的特定基因集的轉錄。DNA結合轉錄激活劑活性可以通過激活或增加特定基因組轉錄來影響DNA結合轉錄因子活性。核受體活性是一種可以通過與DNA結合的方式來抑制或者減少特定基因組轉錄的輔助抑制活性。上述的后4個GO條目在細胞內遺傳信息流通是極為常見的，OA的發生過程中也是必不可少的，如TNF-α誘導的MEK/ERK信號通路在產生OA時就涉及Egr-1的DNA 結合[25]。

KEGG信號通路中，P值較為顯著的前5個依次為：proteoglycans in cancer (癌癥蛋白聚糖)、PI3K-Akt signaling pathway(磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶 B 信號通路)、Lipid and atherosclerosis(血脂和動脈粥樣硬化)、MAPK signaling pathway(MAPK信號通路)、Chemical carcinogenesis receptor activation(化學致癌受體激活)、Prostate cancer(前列腺癌)。腫瘤微環境中的許多蛋白多糖對各種類型癌癥的生物學效應如增殖、黏附、血管生成和轉移起著關鍵作用，還有些和生長因子、細胞因子等相關。癌癥蛋白聚糖信號通路中存在cross-talk，可激活TGF-β /BMPs、Wnt/β-catenin、p38MAPK、PI3K-Akt等能誘導OA的信號通路。血脂和動脈粥樣硬化信號通路一般是通過激活PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、TLR/MyD88信號通路來產生作用。化學致癌受體激活信號通路則是通過激活PI3K-Akt信號通路、JAK/STAT信號通路來實現。前列腺癌信號通路可激活PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路來起作用。此外，上述5條KEGG信號通路均涉及到細胞凋亡，而細胞凋亡是導致OA的重要原因。因此，OM可能通過上述信號通路發揮對OA的治療作用。

運用分子對接技術驗證OM與各靶點的結合性能時，發現對接得到的Libdockscore為92～107，說明OM對核心靶點具有一定的結合能力，但并非十分穩定。分析OM與各核心靶點的分子間作用力種類與數量，發現主要依靠數目較少的傳統氫鍵、P-Pi 共軛、堿基孤對電子進行結合，甚至有的主要依靠碳氫鍵這種弱作用力進行結合，結合能力相對較弱。已有研究表明，由于苦參堿類天然生物堿的自身結構特點，其與眾多靶點進行對接時的Libdockscore都偏低[26]。生物堿類具有較強生理活性的同時，也有較大的不良反應，這種相對較弱的結合能力，亦可能是自然藥學觀下的機體保護作用，即藥物與受體結合發揮藥效之后盡快解離以免產生過多的不良反應。

本研究運用網絡藥理學對氧化苦參堿治療骨關節炎的作用機制進行了預測及分子對接驗證，并分析了前五個最為核心的靶點、GO條目及KEGG通路，為后續研究的模型選擇、驗證實驗提供了信息導向。