生物技術在文物保護修復中的應用研究進展

武發思，張 永，蘇 敏，賀東鵬，李 潔，馮虎元

[1． 細胞活動與逆境適應教育部重點實驗室(蘭州大學)，甘肅蘭州 730000； 2． 國家古代壁畫與土遺址保護工程技術研究中心(敦煌研究院)，甘肅酒泉 736200； 3． 甘肅省敦煌文物保護研究中心(敦煌研究院)，甘肅酒泉 736200)]

0 引 言

文物類型多樣、數量巨大、分布廣泛，具有極其重要的歷史、藝術、科學及社會文化價值。然而，因長期受到其賦存環境中光、熱、水、氧、風、污染物、微生物等因子及日益加劇的人類活動影響，多數文物已劣化甚至瀕臨消失。以古代壁畫和石質文物為例，如何科學有效地治理其酥堿粉化、鹽霜結殼、風化脫落、煙熏污染等病害(圖1)，從而減緩其劣化速度，一直是文物保護領域的科技難題[1-2]。使用化學材料對病害文物進行清洗或加固防護是自20世紀以來最常見的保護手段[3-5]，在一定程度上挽救了大量瀕危文物，使文物延年益壽，但受限于保護材料自身老化、與文物材料兼容性差以及容易引發新的病害等問題，新型保護修復材料的研發一直是文物保護領域的熱點課題。在此背景下，利用基于微生物的代謝產物或者誘導合成產物等生物技術對文物進行保護修復已成為新的發展方向，其具有兼容性高、綠色環保、易推廣等諸多優勢[6]。截至目前，運用生物學原理開發形成的生物技術，在文物保護中的應用主要包括生物清洗和生物加固。本工作系統總結了生物技術在國內外的最新研究及其在文物保護中的應用進展，旨在推動我國文物科技保護的發展。

(a)云岡石窟雕像風化；(b)大足石刻雕像風化；(c)北石窟寺風化；(d)莫高窟壁畫煙熏病害圖1 石窟寺及古代壁畫典型病害圖Fig.1 Representative weathering diseases of grottoes

1 生物退化與生物防護

多數情況下，微生物可對文物構成嚴重的侵蝕威脅，是造成文物破壞的主要因素[7-9]，其幾乎可以作用于任何材質的文物，使其污損、退化甚至降解[10]。這一生物學過程所產生的后果是不可逆的，也可能是毀滅性的。氣候因素，包括溫度、濕度、雨水、光照、空氣污染物等均可為生物的生長創造有利條件，造成文物美學損傷(如形成色斑和結殼)，以及生物代謝活動引起文物材質發生物理及化學變化。Liu等[11]對微生物參與的碳、氮、硫等元素生物地化循環過程及其導致石質文物的生物退化機制進行了深入述評(圖2)。有研究提出在諸多環境因素中，水分是影響文物鹽害及微生物侵蝕最為關鍵的因子[12]；水分能夠激活可溶性鹽在石材內活動，進而加劇石質文物風化。

圖2 人類活動與生物地化循環對石質文物生物退化的影響[11]Fig.2 Effects of human activities and biogeochemical cycles on biodeterioration of stone relics

然而石材表面生物膜也可能具有防護作用，防止污染物對文物基體進一步侵蝕，例如微生物形成的草酸鈣保護層，對外界環境變化和多種生物起到了一定隔離作用[13]。一些附生地衣對文物基質的侵染性較低，去除后會造成黑色真菌或藍藻等更具侵染性的生物在裸面快速定殖，導致更嚴重的生物退化[14]。Casanova等[15]對土耳其中部建于公元7世紀的烏祖姆魯教堂軟凝灰巖的研究指出，去除石材表面地衣后，多種因素會加速裸巖石材的破壞和風化，建議保留。Hu等[16]對吳哥窟巴戎寺的研究中發現曲霉屬真菌(Aspergillusallahabadii)在先前由自養和異養微生物定殖的區域形成了致密的生物膜，導致石質表層變黑，但這些真菌可以清除人工模擬形成的生物被膜。而一些分離自壁畫的真菌可形成碳酸鈣和草酸鈣，具有防護文物的應用潛力[17]。

2 文物的清洗保護

2．1 傳統清洗方法

清洗是文物保護修復程序中尤為關鍵的一步，通常是利用機械、物理(激光、蒸汽等)或化學方法(清洗劑、水等)清除文物表層污染物。對石質文物的清洗一方面可減緩污染物對石材的腐蝕，打開石材被堵塞的氣孔，恢復石材水汽交換通道，另一方面可除去導致石材病害的鹽分[18]。但清洗過程不得對文物本體造成損害，應嚴格遵循“不改變原狀原則”[19]。

根據布蘭迪的修復理論，修復是一項包括對美學和歷史在內的評判過程，并尊重文物的藝術價值。從這個角度考慮，清洗時要避免因自然老化而形成的如“銅綠層”等有價值信息的丟失。因此，是否清洗要建立在科學評判的基礎上，毫無保留地清洗可能導致文物歷史信息的丟失或加速侵蝕破壞。

各類清洗方法都有其優勢和不足。使用紙巾、海綿或真空泵等機械方法最為常見，但手動清除過程耗時費力，效果持續時間短并可能造成文物本體損傷。20世紀90年代中期，激光清洗作為新型清洗技術受到青睞，但該技術對操作人員要求高，稍有不慎會導致文物表面受損[20]。化學清洗中通常使用水或其他有機溶劑，而螯合劑、表面活性劑或鹽多用于調節pH；化學試劑對工作人員有潛在的毒性危害并污染環境。近期有研究將過氧化脲(carbamide peroxide)和過碳酸鈉(sodium percarbonate)與凝膠結合用于梵蒂岡花園大理石表層清洗，能有效減少色斑[21]。

2．2 生物清洗技術

微生物也可在文物保護中發揮正面作用，如將其用作文物修復清洗劑[22-24]。微生物代謝能力的應用稱為微生物資源管理[25]，利用微生物細胞進行文物保護的新工藝可被定義為生物清洗[26]。微生物具有可降解不同來源環境污染物的特性，為其在文物清洗、加固修復中的應用提供了契機[27]。與傳統修復方法相比，利用生物清洗更加低廉環保和安全高效[28]。研究發現，生物清洗技術在去除石材表面硫酸鹽方面比激光及化學清洗更有效[29]。

生物清洗研究始于20世紀90年代初，該技術當前已被應用于石質和壁畫類文物的保護修復，如黑色結殼、礦物鹽沉積物和早期修復有機物殘留物的清除。由于微生物具有高度選擇性和特定酶活性，其在去除復雜污染物方面比化學方法更為專一有效。Mazzoni等[30]研究了利用生物結合化學方法清洗文物的協同效應，建立了一種運用生物學方法來清除壁畫上由石膏、碳酸鈣、磷灰石、硝酸鹽和劣化蛋白質組成的粘附沉積物，所選含有細菌代謝產物的溶液不會形成孢子，原位清洗后無殘留。

我國文物保護工作者利用微生物技術在絲織品和紙質文物清洗加固中進行了有益探索。如荊州文物保護中心研發了古代絲織品保護生物技術[31]，成功用于長沙馬王堆漢墓出土的絲錦袍和荊州謝家橋楚國一號墓出土的荒帷等出土絲織品的揭展、清洗和加固修復(圖3)；為解決古書畫揭展問題，首都博物館于2015年成功研制出生物酶揭展古書畫技術[32]，利用芽胞桿菌發酵制作含淀粉酶的胞外液作為生物揭展劑，取得了較好效果(圖3)。

(a)(b)：長沙馬王堆絲綿袍修復前、后對比，荊州文物保護中心魏彥飛供圖；(c)(d)：生物酶用于古書畫揭展，首都博物館閆麗供圖圖3 生物技術在絲織品和紙質文物保護修復中的應用Fig.3 Application of biotechnology to the restoration of silk and paper cultural relics

2．2．1生物清洗脫鹽 石質文物表層多見黑斑和鹽殼，其與文物基體緊密結合，極難清洗。工業革命以來，氣候變暖和日益嚴重的環境污染導致石質文物鹽風化加劇。造成石材結殼的組分包括硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽及磷灰石等，黑色結殼也可能由硫酸鈣(石膏)沉積物和空氣污染煙塵顆粒混合形成。由于現有除鹽技術收效甚微，基于生物的清洗脫鹽技術應運而生。

2) 硝酸鹽類。硝酸鹽沉積與繪畫材料的自然老化及修復試劑殘留有關，對壁畫的破壞作用極大。硝酸鹽還原菌(NRB)在早期被用于還原石材基質中的硝酸鹽。May等[34]首次確定了一株施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)對硝酸鹽的還原活性。利用施氏假單胞菌對露天紀念碑和壁畫上的鹽害進行了生物清洗試驗，并形成了一種基于瓊脂載體的創新輸送系統[35]。該技術已成功應用于西班牙瓦倫西亞桑托斯·胡安斯教堂內一幅18世紀的壁畫及12世紀馬特拉大教堂凝灰巖表面硝酸鹽的清洗(圖4)。

圖4 施氏假單胞菌嵌入瓊脂對巴倫西亞Santos Juanes教堂壁畫鹽風化的生物清洗[35]Fig.4 Biocleaning with Pseudomonas stutzeri entrapped in agar for salt efflorescence present on the wall painting of the Santos Juanes church of Valencia

通過評估生物清洗對硝酸鹽的清除效果及對文物表面的可能影響，發現施氏假單胞菌清洗后硝酸鹽含量降低了92%[35]；6年后，處理區域硝酸鹽濃度保持穩定，微生物群落及顏色沒有明顯改變[36]。利用極端微生物，特別是嗜鹽單胞菌(Halomonascapaniensis)能安全有效清洗石材表面硝酸鹽結殼[37]。D．desulfuricans也被作為一種潛在的硝基纖維素降解劑去除近現代噴漆涂鴉[38]。

然而，生物清洗脫鹽的技術應用當前仍存在一些問題和擔憂，如表層生物處理會遺留細菌、水或瓊脂，增加了其他微生物生長繁殖的風險，比如真菌。因此，針對于生物處理后的短期、中期和長期監測及評估尤為必要，確定沒有活性微生物的生長是該技術能夠大范圍推廣應用的關鍵。

2．2．2生物酶清洗 生物水解酶能降解生物污漬、黏合劑和有機殘留物等污染物中復雜的化學鏈，從而將有機高分子降解為低分子或二氧化碳、水等無機物以便于清除[39-41]。自20世紀70年代，該技術已開始用于文物保護，如通過胰蛋白酶、淀粉酶或蛋白酶去除紙質文物上淀粉糊、動物膠或蛋白質黏合劑[42]。使用脂肪酶去除畫作上老化的丙烯酸涂料[43]。利用混合酶溶液去除油漆上的動物膠和蛋白質及油性黏合劑[44]。

自20世紀90年代，化學試劑的毒性問題受到關注，從而推動了其他清洗技術的發展[26]。有些生物酶是基于活的微生物細胞和水解酶聯合使用，以去除文物表層的雜質[45-46]。處理前先使用色譜技術確定清除層特性，再選定生物酶[46]。當前幾種商用酶具有去除黏合劑的能力[47]，也有水解酶作用于動物膠的報道[48-49]。蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和酯酶常用于文物清洗修復，尤其是去除壁畫和紙質文物上的污垢、黏合劑等有機殘留[41，45，50]。這一方法已成為傳統酸堿化學清洗試劑的有效替代品[29]。這些酶主要來自動物、植物、細菌或真菌組織[45，51]。

可根據清洗底物選擇特異性酶、調節酶活性和操作安全性。酶清洗通常需在特定的pH和溫度條件下進行，由于多數商業酶的最佳活性溫度≥37 ℃，而文物本體上常存在影響酶活性的抑制劑，如鹽、金屬離子、色素或其他分子，因此限制了酶技術的應用[52]。近年來分離自海洋無脊椎動物的新蛋白酶和酯酶，可在<30 ℃的溫度下使用，這些冷活性酶無需加熱酶溶液或文物表面即可水解膠、酪蛋白黏合劑等老化的蛋白質[53]。酶清洗后，須檢查其清除效率及殘留物，評估表層顏色的變化情況[54]。新型生物清洗方法已用于石灰巖表層生物膜的去除，葡萄糖氧化酶能在室溫下發生酶促反應，原位產生具有氧化特性的過氧化氫(H2O2)，對于石灰巖的清潔效果顯著[55]。脂肪酶是去除老化干性油等材料的有效方法，已被用于去除紙質文物畫面的丙烯酸樹脂Paraloid B-72[43，56]，與使用飽和碳酸銨溶液、EDTA緩沖液的傳統方法相比，該方法優勢明顯。

細菌代謝產物多樣化，具有產生組成酶和誘導酶的特性[57]，通過施氏假單胞菌懸浮液(DSMZ 5190)濕棉條法可進行生物清洗[45，58]，該菌株可產生酪蛋白水解和膠原酶活性，能降解動物膠成分[59]。真菌同為代謝物多樣化的微生物類群，其中真菌漆酶在多方面被廣泛應用[60]，如從變色栓菌(Trametesversicolor)培養物中獲得的真菌漆酶能去除伊薩姆大理石滑梯雕塑上的紅色斑點[61]。

另外，通過直接將施氏假單胞菌液噴涂于壁畫等文物表面，然后純化蛋白酶，并確定了最佳修復條件[62]。使用活的細菌細胞和酶(P．stutzeri∶蛋白酶∶膠原酶=1∶3∶10)進行生物清洗的新型生物技術成本遠低于其他常規方法。

生物酶技術對文物干預小，操作人員面臨的健康風險低，環境安全性高[55]，是機械及化學方法的有效補充或替代。由于影響酶活性的因素較多，在不同特性文物表面如何提高酶活性仍是該技術今后需要探索的方向。

2．2．3活性微生物技術 現代清潔技術，如酶、表面活性劑和溶解劑修復壁畫的效果常不盡如人意[38]。微生物細胞整體利用的思路已成為發展新趨勢。利用施氏假單胞菌活細胞對比薩紀念碑墓地一幅Spinello Aretino壁畫中動物膠的生物清洗取得了良好效果[63]，該菌株也被用于去除壁畫中的其他有機物[59，64-66]。與化學或機械方法相比，活細胞法的適用性更強[67](圖5)。

(a)傳統瓊脂生物膠盤的生物清洗；(b)斯氏假單胞菌激活的高級瓊脂紗布生物凝膠圖5 生物清洗在梵蒂岡博物館的La Navicella壁畫的應用[67]Fig.5 Application of biocleaing to La Navicella wall painting， Vatican Museums

其他案例包括使用包埋在碳凝膠載體中的假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)處理意大利馬特拉大教堂的外墻，然后用PET薄膜覆蓋；利用施氏假單胞菌處理西班牙巴倫西亞的桑托斯胡昂斯教堂墻面壁畫，并使用紅外燈確保正常的細菌代謝活性[35-36]。因活性微生物具有多功能性和廣泛的酶活性，其比單純酶技術的性價比更高[45，67]。但對文物進行長時間的細菌處理可能產生未知的破壞作用，因此，活性微生物未來用于清洗修復的準確性至關重要，清洗結束后應針對性去除用于清洗修復的活性細菌。由于微生物技術應用的專業性及其未知傳染性和可能的生物安全隱患，當前傳統清洗方法仍是首選。

3 文物的加固保護

3．1 傳統加固材料與技術

使用化學材料是露天石材防護常用的方法，包括無機材料和有機聚合物，其中有機類應用廣泛[68-69]。固體石蠟是一類最早使用的石材表面防護劑[3]，無機防護劑在十九世紀前也有使用[38]。然而常用的加固修復材料存在與石材兼容性差，失效后引起文物表面變色、形成硬殼及造成表層剝落等問題，因此亟須開發新型兼容環保的防護材料。

3．2 生物礦化加固修復

生物學原理的利用為文物加固修復提供了新途徑，如生物鈣化細菌(BCB)可以加固石材，延緩石質文物鈣基質的劣化[70]。生物礦化是因金屬的氧化或還原形成礦物的過程，已知生物礦化機制有生物誘導礦化和生物控制礦化[71]。針對微生物誘導碳酸鈣沉淀(MICP)的生物地球化學過程已有大量研究。已證明Bacilluspasteurii[72]、Bacillussubtilis[70，73-74]、Myxococcusxanthus[75]、Acinetobacter[76]、Pseudomonas、Pantoea和Cupriavidus菌株[77]均能形成方解石沉淀。黃色粘球菌(Myxococcusxanthus)在液體和固體環境中[78]均可誘導碳酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽沉淀[75]。

細菌誘導的方解石沉淀有利于石灰巖和大理石石碑的保存[79]。真菌代謝產生的醋酸、檸檬酸、葡萄糖酸、反丁烯二酸、乙醛酸和草酸等有機酸也可與不同金屬形成沉淀[80]。

利用微生物礦化加固文物的探索和實踐已有很多。微生物活動形成的草酸鹽、碳酸鹽和氧化物等礦物沉淀能提高文物耐久性[14]。MICP技術當前已成為巖土質文物加固修復研究關注的焦點，用于石材裂縫修復、促進石材強度并降低其滲透性[75，81]。采用全新方法將解脲菌八疊球菌(Sporosarcinapasteurii)細胞包埋在聚氨酯(PU)中，可增強石材裂紋修復[82]。De Belie[83]和De Muynck[84]使用賴氨酸桿菌(Lysinibacillussphaericus)生物礦化作用修復了混凝土裂縫。Achal[85]也報道了芽孢桿菌CT-5在方解石裂縫修復中的應用。Tiano[70]利用微球菌(Micrococcussp．)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)對萊切石灰巖的加固效果明顯。Perito等[86]利用枯草芽孢桿菌(B．subtilis)細胞壁組分(BCF)誘導方解石沉淀，在實驗室條件下和原位對石材均具有加固能力。劉強等[87]以硫酸軟骨素作為有機模板，草酸鈣亞穩過飽和溶液作為無機前驅物，于室溫條件下在石材表面仿生合成了一水草酸鈣材料，并測試了其憎水性、耐污性和耐酸性。孫延忠等[88]選擇枯草桿菌-Ⅱ在含鈣培養基上進行誘導礦化，發現在細菌周圍可生成白色碳酸鈣，并包裹細菌菌體使其鈣化。然而，國內當前還處于對生物礦化機理和制備技術的探索研究階段，在文物保護修復中尚沒有應用案例。

Jroundi等[79]近年開發了一種新穎、環保、細菌自接種加固鹽風化石質文物的方法，通過將鹽害石材中分離到的細菌制成培養液重新接種于風化區域，形成了有機(胞外聚合物EPS)-無機(CaCO3)雜化納米復合材料，能顯著增強風化區域的力學性能(圖6)。鑒于在多數巖土質文物上都能分離到具有類似功能的本土微生物，該新方法在文物加固及表面防風化中的推廣應用前景可期。

(a)無生物處理顯示微米級的方解石晶體(Cc)；(b)(c)：細菌接種處理顯示細菌化方解石黏合(BCc)、豐富的EPS和礦化的細菌細胞(白色箭頭)圖6 掃描電鏡圖顯示生物處理鈣質巖的形態變化[79]Fig.6 SEM images showing the morphological change of bio-treated calcarenite stone

對于處在不同平衡狀態的石質文物-微生物系統而言，施加的外源細菌或從其中分離的純培養物可能會處于競爭劣勢，抑或改變原有的微生物群落平衡。因此，微生物生物礦化長效性還須綜合評估，包括對文物基質特性、可溶鹽、微生物類型的影響，以及微生物接種量及其與基質中其他微生物的相互作用，以及后期的維護保養程序等尚需進一步明確。

4 展 望

大多數文化遺產和歷史建筑長期暴露在空氣污染、氣候多變和歷經多次化學保護修復處理的環境之中，這在一定程度上促進了微生物的定殖和生長代謝，加速了生物退化，因此，已有多數研究是針對微生物活動對文物材料負面的影響評估。然而考慮到微生物是地化循環的主要驅動因子，利用其代謝降解途徑又為文物的保護修復提供了新的可能[96]。利用生物體及代謝產物清洗文物表面污染物的技術是當前研究熱點，然而要從實驗室走向文物本體，依然還存在一些技術難題等待解決。如在微生物誘導碳酸鈣沉淀過程中，溫度、pH值和Ca2+濃度對細菌生長和碳酸酐酶活性均有很大影響[97]，如何在文物表面實現最佳的應用條件并避免對文物本體及其賦存環境造成傷害，開發常/低溫及中性條件下生物技術是今后探索的方向。污垢的生物清洗及風化石質文物的生物加固修復來源于生物酶和生物礦化機制的啟發，因此，生物技術有益于生態環境的動態平衡。而目前對于文物的清洗或加固修復，基于化學和機械處理的傳統方法仍是首選，因微生物的潛在破壞性未知，后期評價體系還不成熟。因此確保生物技術的安全性是其廣泛應用的重要前提。

隨著全球氣候變化加劇、極端天氣頻發、環境污染日益加重以及文化旅游業高速發展，文物面臨的病害問題日益突出，對于保護修復的需求也將更加緊迫。文化遺產的保護需要全球協力，就保護修復材料而言，材料學家們需要更加關注包括納米Ag、TiO2、ZnO、Ca(OH)2等在內的新型納米材料的制備及其應用技術[98-99]。微生物清洗與加固技術為保護修復方法和工藝的革新提供了新契機，但目前該技術的理論研究與應用實踐之間還存在較大差距，文物領域生物技術專業人員的匱乏限制了該技術的進一步改進和推廣。微生物清洗和加固文物過程中使用的生物體、酶、可能形成的其他次生產物等殘留物及其危害風險也需要深入評估，進而促進生物技術更加高效、安全、可持續地應用于文物保護。盡管生物清洗和生物加固技術仍需不斷創新和發展，但運用生物技術開展文物保護修復必將成為未來新趨勢。