海南紅樹林內(nèi)生真菌Aspergillus sp. HNY16-5C的含氮類次級代謝產(chǎn)物*

肖澤恩，林少娥，佘志剛，陸勇軍，譚振，劉永宏

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院/藥學(xué)院，廣西 南寧 530200

2. 廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200

3. 中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275

4. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌引起的傳染性疾病，世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2020 年全球結(jié)核病報告》［1］顯示，2019 年全球累計約有1 000 萬人患上結(jié)核病，死亡人數(shù)約120萬。近年來，泛耐藥結(jié)核以及與HIV 相關(guān)的結(jié)核病使其臨床治療更加困難和復(fù)雜，迫使人們尋找新的化學(xué)治療方法［2］。由結(jié)核分枝桿菌分泌的酪氨酸磷酸酶B（MptpB 酶）是結(jié)核分枝桿菌的重要毒力因子，是造成肺結(jié)核的關(guān)鍵酶。因此，以MptpB 酶為靶點，快速篩查具有潛在抗結(jié)核活性的化合物吸引了越來越多科學(xué)家的關(guān)注［3］。

本課題組對來源于海南東寨港紅樹林自然保護(hù)區(qū)紅樹無瓣海桑的內(nèi)生真菌Aspergillussp.HNY16-5C進(jìn)行規(guī)模發(fā)酵，對其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，獲得了6 個化合物，分別為brevianamide K（1）、brevianamide V（2）、（R）-brevianamide Q（3）、（R）-brevianamide R（4）、（±）-asperginulin A（5）和brevianamide M（6）（圖1）；利用MptpB酶抑制活性模型，對化合物1～6進(jìn)行了活性測試，首次發(fā)現(xiàn)化合物1 顯示有較強(qiáng)的MptpB 酶抑制活性，是潛在的抗結(jié)核活性化合物。

圖1 化合物1～6的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of compounds 1-6

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

EYELA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1300S（日本東京理化器械株式會社）；MLS-3781L-PC 高壓蒸汽滅菌器（日本Panasonic 公司）；Polaptronic HNQW5 型旋光儀（德國Schmidt-Haensch 公司）；J-810 圓二色光譜儀（日本JASCO 公司）；Bruker Avance 400 核磁儀（瑞士Bruker 公司）；Thermo Finnigan LCQDECA質(zhì)譜儀（美國Thermo公司）；Oxford Gemini S Ultra 晶體衍射儀（英國牛津衍射公司）；LC1620高效液相色譜儀（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；SW-CJ-2F潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；ZWYR-2102立式恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；AL104 萬分之一電子天平（瑞士梅特勒公司）；HH-S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州金壇良友儀器有限公司）；WFH-203B 暗箱式紫外線分析儀（杭州齊威儀器有限公司）；YMC ODS-A 色譜柱（日本YMC公司）；正相薄層層析板GF254 和柱層析硅膠（青島海洋化工廠）；核磁測試用氘代試劑（美國Sigma-Aldrich 公司）；液相用甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 菌株來源

內(nèi)生真菌Aspergillussp. HNY16-5C 由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陸勇軍教授課題組提供，采集自海南東寨港紅樹林自然保護(hù)區(qū)，從紅樹植物無瓣海桑的葉子中分離純化。通過用真菌ITS間隔序列的堿基序列在GenBank 做對比相似性分析，鑒定菌株HNY16-5C 為曲霉屬真菌Aspergillussp.。DNA序列已提交至GenBank（序號JX993829）。該菌種已提交中國菌種保藏中心保存（保藏號CCTCC M 2012358）。

1.3 發(fā)酵條件

種子培養(yǎng)基（PDB）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、海鹽3 g、水1 000 mL；發(fā)酵培養(yǎng)基：江西瓊豐仙桃米50 g，w=3‰海鹽水50 mL。將純化的菌種接到裝有200 mL 土豆培養(yǎng)液的錐形瓶（500 mL）中，在25 ℃搖床培養(yǎng)3～5 d，獲得種子培養(yǎng)液；取2 mL 種子培養(yǎng)液加到裝有大米培養(yǎng)基的錐形瓶（1 000 mL）中，接種100瓶，25 ℃靜置培養(yǎng)28 d。

1.4 提取與分離

用3 倍體積甲醇浸泡菌體3～4 次，每次24 h，減壓濃縮得粗提液，用等體積乙酸乙酯萃取3 次，合并有機(jī)相，減壓濃縮獲得粗浸膏（80.05 g），通過正相硅膠柱層析（200～300 目），以石油醚-乙酸乙酯為流動性進(jìn)行梯度洗脫［V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）= 1∶9～ 0∶10］，獲得8 個組分（Fr.1～ 8）。其中Fr.4經(jīng)正相柱層析［V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=1∶9～ 0∶10］和Sephadex LH-20［V（氯仿）∶V（甲醇）=1∶1］純化得到化合物1（20 mg）和2（17 mg）；Fr.5經(jīng)反相柱層析［V（甲醇）∶V（水）=1∶9～9∶1］、凝膠Sephadex LH-20（甲醇）以及半制備HPLC［V（甲醇）∶V（水）=6∶4］純化得到化合物5（7 mg，tR12 min）；Fr.6 經(jīng)正相柱層析［V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=1∶9～ 0∶10］、凝膠Sephadex LH-20（甲醇）和反相柱層析［V（甲醇）∶V（水）=2∶8～9∶1］純化得到化合物3（11 mg）、4（8 mg）和6（15 mg）。

1.5 MptpB酶抑制活性測試

中山大學(xué)陸勇軍教授課題組以結(jié)核菌H37Rv株基因組DNA 為模板，利用PCR 克隆MptpB 酶基因，并成功在Escherichia coliBL21 中得到高效表達(dá)，獲得有活性的重組MptpB酶，建立了以MptpB酶為靶點的抗肺結(jié)核活性測試模型［4］。在此模型基礎(chǔ)上， 我們對從內(nèi)生真菌Aspergillussp.HNY16-5C 中分離獲得的6 個含氮類化合物進(jìn)行了MptpB酶抑制活性測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色針狀晶體，EI-MSm/z347［M］+，推測其結(jié)構(gòu)中含有N 原子，結(jié)合核磁數(shù)據(jù)推測分子式為C21H22N3O2，不飽和度為13。核磁數(shù)據(jù) 如 下：1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ：10.99（1H，s，18-NH），8.80（1H，s，2-NH），7.39（1H，d，J=7.9 Hz，H-13），7.17（1H，d，J=7.5 Hz，H-16），7.06（1H，t，J= 7.2 Hz，H-15），6.99（1H，t，J= 6.8 Hz，H-14），6.50（1H，s，H-10），6.09（1H，d，J= 2.9 Hz，H-8），6.00（1H，dd，J=14.2，8.8 Hz，H-21），5.05（1H，d，J=8.8 Hz，H-22a），5.00（1H，d，J= 14.2 Hz，H-22b），4.00（2H，t，J= 8.9 Hz，H-6），2.79（2H，dt，J= 8.9，2.9 Hz，H-7），1.44（3H，s，H-23），1.43（3H. s，H-24）；13C NMR（CDCl3，101 MHz）δ：155.0，154.0， 145.0， 144.6， 135.6， 134.0， 126.4，126.1， 121.3， 119.4， 119.2， 112.1， 112.0，110.3，103.1，46.0，39.5，28.1，27.9。與文獻(xiàn)［5］數(shù)據(jù)比對，化合物1鑒定為brevianamide K。

圖2 化合物4的單晶結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The single crystal structure of compound 4

2.2 MptpB酶抑制活性測試結(jié)果

MptpB 酶抑制活性測試結(jié)果顯示，化合物1 具有較強(qiáng)的酶抑制活性，IC50為（7.07±2.76）μmol/L（見圖3），其他化合物無明顯酶抑制活性（IC50>100 μmol/L）。

圖3 化合物1的MptpB酶抑制活性Fig.3 The MptpB inhibitory activities of compound 1

3 結(jié) 語

本文從海南東寨港紅樹植物無瓣海桑的內(nèi)生真菌Aspergillussp. HNY16-5C中分離得到6個含氮類化合物，分別是brevianamide K（1）、brevianamide V（2）、（R）-brevianamide Q（3）、（R）-brevianamide R（4）、（±）-asperginulin A（5）和brevianamide M（6），其中，化合物1～5 為二酮哌嗪類化合物。首次發(fā)現(xiàn)化合物1具有MptpB酶抑制活性，具有開發(fā)為抗結(jié)核分枝桿菌藥物的巨大潛力。