‘小白’草莓花藥培養及組培快繁技術研究

孫行杰 吳忠娟 徐 英 崔麗靜

（1山東省龍口市農業技術推廣中心，煙臺 265701；2山東省招遠市畢郭鎮黨群服務中心，招遠265412；3新泰市林業保護發展中心，新泰 271200；4海陽市果業發展服務中心，海陽 265100）

‘小白’是‘紅顏’草莓脫毒組培芽變品種，2012年獲世界草莓大會銀獎，2014年通過北京種子中心審定[1]。果實長圓錐形，果皮粉色或淺紅色，果肉純白色，可溶性固形物含量13%～16%，有黃桃口味，果個大，平均單果重41.2 g，最大單果重135 g，生長旺盛，冬季連續結果性好，抗白粉病能力較強，667 m2產量3 500～5 000 kg。

近年來，國內電商的快速發展在很大程度上改變了草莓傳統收購和銷售方式，‘小白’硬度大，耐儲藏，非常適合快遞運輸，而且口感極佳，因此種植面積不斷擴大。生產中，草莓苗很容易受到病毒侵染引起品種退化，導致產量下降、品質變劣、抗病性減弱等，嚴重影響草莓種植效益[2]。目前，病毒病尚無有效藥物可以治療，只能通過栽植脫毒種苗進行防治。1974年日本大澤勝次首先證明草莓花藥培養植株為正常倍性，且可脫除病毒，并作為培育無病毒苗木的方法之一[3]；還有研究證明花藥培養所得的再生植株為脫毒植株，脫毒率為100%，可以省去病毒檢測過程[4]。本研究通過對‘小白’草莓花藥進行低溫預處理、篩選合適的激素種類和配比的培養基，對草莓花藥愈傷組織進行誘導和分化，獲得‘小白’草莓脫毒原原種苗，再通過篩選適合的激素種類和配比的培養基對草莓叢生芽進行增殖和生根培養，建立‘小白’草莓花藥培養技術體系，獲得脫毒原原種苗，為草莓無病毒苗在生產上的應用提供可靠的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以草莓品種‘小白’適齡花蕾為材料。11月中旬晴天上午7：00～8：00取正常植株上直徑3～5 mm花蕾（鏡檢為單核靠邊期），置于冰盒中帶回實驗室。

1.2 方法

1.2.1 ‘小白’草莓花蕾預處理 自來水沖洗30 min→蒸餾水沖洗2～3次→放入鋪有濕潤濾紙的培養皿中→密封后放入4 ℃冰箱中冷藏，低溫處理24 h、48 h和72 h，標記為T1、T2和T3。對照不進行低溫處理，標記為CK。

1.2.2 愈傷組織誘導 置于超凈工作臺上→75%酒精表面消毒30 s→無菌水沖洗2～3次→0.1% HgCl2消毒8 min→無菌水沖洗3次→去除花絲→剝取花藥迅速接種于4種愈傷組織誘導培養基中（100 mL三角瓶）。花藥愈傷組織誘導培養基為：MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+IAA 2.0 mg/L；MS+6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L+IAA 4.0 mg/L；MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L；MS+6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L+NAA 4.0 mg/L，分別記做M1、M2、M3和M4。共16個處理，每處理接種5瓶，每瓶接種10個花藥，重復3次。45 d后統計愈傷組織誘導率。

1.2.3 愈傷組織分化 將獲得的‘小白’草莓愈傷組織轉接至愈傷組織分化培養基中（500 mL培養瓶，下同），參照文獻和預試驗結果，花藥愈傷組織分化選用的培養基為：MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.1 mg/L+GA 0.1 mg/L；MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA 0.1 mg/L；MS+6-BA 0.5mg/L+IAA 0.1 mg/L+GA 0.2 mg/L；MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA 0.2 mg/L，分別記做M5、M6、M7和M8。共4個處理，每處理10瓶，每瓶接種5個愈傷組織，重復3次。30 d后統計愈傷組織分化率。

1.2.4 叢生芽增殖 將獲得的‘小白’草莓叢生芽轉接至M5、M6、M7和M8培養基中，共4個處理，每處理接種3瓶，每瓶接種叢生芽1個，重復3次。接種20 d后統計增殖系數。

1.2.5 生根 選用的生根培養基為：1/2MS、1/2MS+IBA 0.1 mg/L、1/2MS+IBA 0.2 mg/L，分別記做M9、M10、M11。共3個處理，每處理5瓶，每瓶接種5株組培苗，重復3次。20 d后統計生根率。

1.2.6 培養條件 上述培養基除生根培養基中加入蔗糖20.0 g/L和活性炭0.5 g/L外，其它培養基中均加入蔗糖30.0 g/L，瓊脂5.5 g/L，pH值為5.8；除愈傷組織誘導和分化兩步接種后需先暗培養2 d外，其他培養條件均為每日光照16 h，光強2 000 lx，培養溫度為25 ℃/20 ℃（晝/夜）

1.3 數據分析

采用SAS 9.0統計軟件處理試驗數據。

2 結果與分析

2.1 不同預處理時間、激素種類和配比對‘小白’花藥愈傷組織誘導率的影響

由表1可以看出，在72 h內，低溫預處理均顯著提高了‘小白’花藥愈傷組織誘導率，其中T1條件下即4 ℃低溫預處理24 h效果最好；6-BA與KT、IAA和NAA的4種激素組合均提高了‘小白’花藥愈傷組織誘導率，其中M2即MS+ 6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L+IAA 4.0 mg/L效果最好。綜合來看，在T1預處理下，采用M2誘導培養基，‘小白’草莓花藥愈傷組織誘導率最高，達到了75.33%，與其他處理差異性均達到了極顯著（見表1）。

表1 不同預處理時間、激素種類和配比對‘小白’花藥愈傷組織誘導率的影響

2.2 不同激素種類和配比對‘小白’花藥愈傷組織分化、再生芽增殖的影響

從表2中可以看出，‘小白’草莓愈傷組織的分化率較低，在M6培養基即MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA 0.1 mg/L中最高，達到18.67%，且叢生芽較大，玻璃化程度較輕；同時，其再生芽增殖系數也最高，達到了3.21，且再生芽長勢健壯，無玻璃化現象。

表2 不同激素種類和配比對‘小白’花藥愈傷組織分化、再生芽增殖的影響

2.3 不同激素種類和配比對‘小白’再生芽生根的影響

由表3可以看出，‘小白’草莓再生芽在M9培養基即1/2MS條件下生根率最高，達到94.67%，在M10培養基中平均根長最長，達到3.24 cm，須根數量也最多，平均7個，但3種培養基間生根率、平均根長、須根數量均無顯著性差異，結合組織培養成本考慮，最佳生根培養基為1/2MS。

表3 不同激素種類和配比對‘小白’再生芽生根的影響

3 討論與結論

草莓花藥經過一段時間的低溫預處理可以顯著提高花藥愈傷組織的誘導率，但不同品種間存在差異[5]。在本試驗中，4 ℃低溫預處理24 h對‘小白’草莓花藥愈傷組織誘導效果最好，這與任建宏等[6]的研究結果一致，而與趙永欽等[7]結果不一致。

適當濃度的細胞分裂素與生長素配合使用，可以誘導草莓花藥產生高質量的愈傷組織。在本試驗中，6-BA、KT、IAA、NAA激素的4種組合均能促進‘小白’花藥愈傷組織的形成，相同濃度下IAA效果好于NAA。而低溫預處理24 h、6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L+IAA 4.0 mg/L的組合誘導率最高，達到了75.33%。

不同激素種類和配比對草莓愈傷組織分化和叢生芽增殖的影響不同。本試驗中，在M6培養基即MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA 0.1 mg/L激素組合處理下，‘小白’草莓花藥愈傷組織分化率和叢生芽增殖系數均顯著高于其他處理，分別達到18.67%和3.21，是適合‘小白’草莓花藥愈傷組織分化與再生芽增殖的培養基配方。

草莓再生芽生根較為容易，本試驗中，‘小白’草莓再生芽在3種培養基中生根率都達到了90%以上，相互間無顯著性差異，這與楊振英等[8]研究結果不同，可能是由于‘小白’草莓生長勢較強，對外源激素依賴程度較低的原因。因此，直接選用不添加任何激素的1/2MS培養基即可滿足‘小白’草莓再生芽的生根需要。