一株野生泡囊側耳的鑒定及生物學特性研究

肖玉軍 孔令家 黃中華 楊 梅 唐莉靜 柳成益

（攀枝花市農林科學研究院，四川攀枝花 617001）

側耳屬真菌分布非常廣泛，是世界上主要人工栽培的食用菌之一，具有重要經濟價值[1]。泡囊側耳Pleurotus cystidiosus，又名鮑魚菇、臺灣平菇、櫟側耳等，隸屬于擔子菌亞門Basidiomycotina、層菌綱Hymenomycetes、傘菌目Agaricales、口蘑科Tricholomataceae、側耳屬Pleurotus[2]，是一種食藥兼用的珍稀菌類之一。泡囊側耳是中高溫木腐型食用菌，主要分布在亞熱帶和熱帶地區，中國主要分布于臺灣地區、福建省、浙江省等[3]。研究表明，泡囊側耳含有豐富的營養成分[4-6]和多種生物活性物質，具有抗腫瘤[7]、抗氧化[8-9]，抑菌[10]和降血糖[11]等功效，具有較高的藥用價值。

目前，對泡囊側耳的研究主要集中于栽培技術和栽培料配方，營養成分、活性物質、藥理功效等方面及野生種質資源收集馴化方面研究報道較少[3]。由于野生泡囊側耳種質資源稀缺，產量低，致使可供人工栽培的品種少，一定程度上制約了其產業化和規模化發展，無法滿足市場需求。因此，挖掘和開發利用泡囊側耳優質野生資源是解決該問題的主要途徑之一。筆者對采自四川省攀枝花市農林科學研究院芒果種質資源圃的一株野生側耳菌株，進行形態特征和ITS 基因測序分析分類鑒定；同時對該菌株的生物學特性開展研究，為該菌株進一步馴化栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

（1）供試菌株

供試野生側耳子實體采自四川省攀枝花市農林科學研究院芒果種質資源圃，組織分離法[12]分離培養得純化菌株。

（2）供試培養基

綜合PDA 培養基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨 3 g，磷酸二氫鉀 2 g，硫酸鎂 1 g，瓊脂18 g，水1 L，pH自然。

基礎培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀1.5 g，硫酸鎂0.75 g，瓊脂18 g，水1 L，pH自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株形態學鑒定

參照真菌圖譜等工具書，對新鮮子實體的形狀、顏色、菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長度和菌柄直徑等進行觀察、測量和拍照，初步鑒定其分類地位。

1.2.2 分子生物學鑒定

將分離的菌株進行純培養，待菌絲將要長滿時進行DNA 提取，DNA 提取參照柴海云的方法[13]。以提取的基因組DNA 為模板，以真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGC GG- 3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3'）為 引 物[14]，進 行PCR 擴增，反應體系和反應程序參照張妍等[15]方法，PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

登陸GenBank，將測定的序列經BLAST比對，對菌株進行同源性比較分析，在GenBank 中下載相似性較高的序列，用MEGA X 進行系統發育分析和進化樹構建，以Schizophyllum、Tricholoma為外群，用N-J 法（Neighbor-Joining method）構建分子進化樹，進行1 000次自展抽值檢驗分子進化樹可靠性。

1.2.3 生物學特性研究

1.2.3.1 培養基碳源試驗

分別用等質量的半乳糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、木糖、羧基纖維素鈉、甘露醇、山梨醇和肌醇來代替供試基礎培養基中的葡萄糖，每個處理5 次重復。培養基接種供試菌株后，于25 ℃恒溫箱暗光培養。參照高陽等[16]的方法，每天觀察菌絲長勢，測量菌落直徑，計算菌絲平均生長速度。

菌絲平均生長速度（mm/d）=（平均菌落直徑-5）/菌絲生長時間。

1.2.3.2 培養基氮源試驗

分別用等質量牛肉粉、大豆蛋白胨、麥芽浸粉、甘氨酸、酵母粉和胰蛋白胨來代替供試基礎培養基中的蛋白胨，每個處理5 次重復。培養基接種供試菌株后，于25 ℃恒溫箱暗光培養。菌絲生長觀察方法同1.2.3.1。

1.2.3.3 培養溫度試驗

采用綜合PDA 培養基。試驗培養溫度設置為15 ℃、18 ℃、21 ℃、24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃共8 個溫度處理，接種后于恒溫箱暗光培養菌絲。每個處理5次重復。菌絲生長觀察方法同1.2.3.1。

1.2.3.4 培養基pH試驗

用1 mol/L 鹽酸和1 mol/L 的氫氧化鈉將綜合PDA 培養基初始pH 調為5、6、7、8、9、10，每個處理5次重復。接種后于25 ℃恒溫箱暗光培養。菌絲生長觀察方法同1.2.3.1。

1.3 數據處理

試驗數據用統計軟件SPSS Statistics 22.0 分析處理，并采用單因素方差分析多重比較，采用Duncan新復極差法檢驗各處理間的差異性。

2 結果與分析

2.1 鑒定結果

2.1.1 形態學鑒定

該野生菌株子實體（圖1）中等，單生，扇形，菌蓋米白色，寬8~12 cm，長5~7 cm，厚0.6~1.1 cm；菌肉白色，緊實；菌柄短、硬、粗，側生，菌柄長3 cm、粗0.3~1.8 cm；菌蓋邊緣呈不規則波浪形。菌褶從菌柄部呈輻射狀延生，白色，密度中等，不等長，在菌蓋邊緣處縱裂出許多小菌褶，無菌環、菌托。

圖1 野生泡囊側耳子實體和菌落形態

PDA 培養基上，菌落邊緣整齊，菌絲潔白，粗壯，密度中等，菌絲中央形成分生孢子并冒黑色分泌物。這些特征符合《中國大型真菌》[17]中關于泡囊側耳的描述，將該菌初步鑒定為泡囊側耳，暫名為Pc-1。

2.1.2 ITS分析

rDNA ITS 基因測序結果：PCR 擴增產物長度為689 bp。測序結果在Genbank 核酸數據庫中進行BLAST 搜索，與登錄號 MW947482.1、MW947480.1菌株覆蓋率高達100%，相似性達100%。得到序列相似性為96%~100%，全部為側耳屬的不同種。下載相似性最高的ITS 序列，以MH483677.1、JX193694.1 為外群，利用 MEGA X 軟件采用 N-J 法構建系統發育樹（圖2）。從系統發育樹可以看出，Pc-1與側耳屬的Pleurotus cystidiosus聚為一支，結合形態特征，可以判定Pc-1菌株為泡囊側耳。

圖2 Pc-1 ITS系統發育樹

2.2 菌絲生物學特性

2.2.1 培養基碳源試驗結果

由表1 可知，泡囊側耳（Pc-1）菌絲在供試碳源培養基上均能萌發并生長。供試碳源培養基上菌絲生長速度、長勢存在差異，其中含肌醇培養基上菌絲生長最快，平均長速為3.297 mm/d，但與山梨醇（3.221 mm/d）、甘露醇（3.197 mm/d）的平均長速差異不顯著，之后依次是羧基纖維素鈉（3.016 mm/d）、淀 粉（2.989 mm/d）、木 糖（2.912 mm/d）、蔗 糖（2.891 mm/d）、麥 芽 糖（2.863 mm/d）、果 糖（2.485 mm/d）、乳 糖（2.381 mm/d）、半 乳 糖（2.343 mm/d）、葡萄糖（2.312 mm/d）。其中葡萄糖、半乳糖、乳糖培養基間，麥芽糖、蔗糖、木糖培養基間菌絲生長速度無顯著差異，其他之間均存在顯著差異，部分存在極顯著差異。菌絲密度和菌絲長勢，甘露醇、淀粉、蔗糖、麥芽糖為碳源時菌絲濃密，長勢旺盛，肌醇、山梨醇、羧基纖維素鈉、木糖，果糖、葡萄糖次之，最差為含乳糖或半乳糖培養基。綜合菌絲長勢和生長速度，泡囊側耳（Pc-1）菌絲生長最適碳源為甘露醇，其次為淀粉。

表1 供試碳源培養基上Pc-1菌株菌絲生長情況

2.2.2 培養基氮源試驗結果

由表2 可知，泡囊側耳（Pc-1）菌絲在供試氮源培養基上均能萌發并生長。供試氮源培養基上菌絲平均生長速度和長勢存在差異，以酵母粉為氮源的培養基上菌絲生長速度最快，菌絲長速為2.523 mm/d，然后依次是胰蛋白胨（2.477 mm/d），大豆蛋白胨（2.452 mm/d），蛋白胨（2.221 mm/d），牛肉粉（2.111 mm/d），麥芽浸粉（1.997 mm/d），最慢為含甘氨酸培養基，只有1.698 mm/d。酵母粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨培養基間菌絲生長速度無顯著差異，與其他供試氮源培養基存在極顯著差異；蛋白胨、牛肉粉、麥芽浸粉、甘氨酸培養基上菌絲生長速度差異極顯著。菌絲密度和菌絲長勢，酵母粉、胰蛋白胨為氮源時菌絲濃密，長勢旺盛，牛肉粉、大豆蛋白胨次之，蛋白胨再次之，最差為甘氨酸、麥芽浸粉。綜合菌絲長勢和生長速度，酵母粉、胰蛋白胨為泡囊側耳（Pc-1）菌絲生長的最適氮源。

表2 供試氮源培養基上Pc-1菌株菌絲生長情況

2.2.3 培養溫度試驗結果

由表3 可知，培養溫度為15~33 ℃泡囊側耳（Pc-1）菌絲均能生長，溫度對泡囊側耳（Pc-1）菌絲生長有顯著影響，試驗溫度之間菌絲生長速度差異極顯著。溫度對菌絲生長速度的影響由大到小依次是 30 ℃、27 ℃、24 ℃、21 ℃、33 ℃、18 ℃、15 ℃、36 ℃。培養溫度為30 ℃時菌絲生長最快，達4.061 mm/d。30 ℃、33 ℃時菌絲生長速度快速下降，36 ℃菌絲不萌發。溫度低于18 ℃時，菌絲生長緩慢，菌絲稀疏。因此，泡囊側耳（Pc-1）菌絲生長適宜溫度為27~30 ℃，最適溫度為30 ℃。

表3 試驗溫度條件下Pc-1菌株菌絲生長情況

2.2.4 培養基pH試驗結果

由表4 可知，培養基初始pH 為5~10 時泡囊側耳（Pc-1）菌絲均能生長，其在中性及弱堿性培養基上菌絲生長較好。當培養基pH為5時，菌絲生長最慢，長速為2.908 mm/d，長勢較旺盛，菌絲較濃密。當培養基pH 為10 時，菌絲生長最快，長速為4.100 mm/d，長勢旺盛，菌絲濃密。當培養基pH 為6~10 時，菌絲生長速度隨著培養基pH 的上升而加快，菌絲長勢也越來越旺盛，其中pH6、pH7 間菌絲長速無顯著差異，但兩者與其他處理差異達極顯著。因此，泡囊側耳（Pc-1）菌絲生長的適宜培養基pH為8~10，最適pH為10。

表4 不同pH的培養基上Pc-1菌株菌絲生長情況

3 小結與討論

真菌傳統的分類依據主要是考察形態結構，但形態特征易受到環境、基因和地域等因素影響，造成形態多樣性，致使菌物鑒定存在偏差，不能做出準確的鑒定。與傳統分類比較，分子生物學技術鑒定方法更加簡便、準確可靠。內源轉錄間隔期（ITS）位于 rRNA 編碼基因 18 S，5.8 S 和 28 S 之間的小基因片段，長度為600~800 bp，具有較高的保守性，表現為種類相對保守，種間差異較為明顯[18]，已被廣泛用于真菌鑒定和系統發育研究。試驗綜合子實體特征和ITS 序列分析，鑒定該野生菌株（PC-1）為側耳屬，泡囊側耳。進一步對泡囊側耳（Pc-1）生物學特性研究結果表明，Pc-1 菌絲培養階段最適碳源為甘露醇，其次是淀粉，該結果與李蝶等[19]研究結果基本一致，與趙彥杰[20]和黃春燕等[21]結果存在差異；最適氮源是酵母粉、胰蛋白胨，該結果與目前有關囊泡惻然的報道基本相同。菌絲生長適宜溫度為27~30 ℃，最適溫度為30 ℃，溫度高于36 ℃菌絲基本不萌發；菌絲在初始pH5~10 培養基上均可生長，喜好中性及偏堿性培養環境，最適pH 為10，這一結果與大部分泡囊側耳菌株不一致。因此，泡囊側耳不同菌株間的生物學特性存在一定的差異性。試驗只是進行泡囊側耳（Pc-1）生物學特性的初步研究，對各因素之間有無交互作用、出菇特性及生物活性等還需進一步研究。