子午嶺野生豬苓中微皮傘菌分離鑒定

段建鋒 劉亞亞 秦一統 張秀麗

（慶陽市農業科學研究院，甘肅慶陽 745000）

子午嶺坐落于甘肅省東部，地處陜、甘交界處，屬溫帶半濕潤氣候，年平均氣溫7.4~8.5 ℃；年無霜期110~150 d；年降水500~620 mm；年平均相對濕度63%~68%。子午嶺森林濕潤的氣候環境和豐富的腐殖質土層，孕育了豐富的藥用植物和真菌種質資源。該地區初步鑒定統計藥用植物共有101科、298種，其中豬苓、羊肚菌、猴頭菌、雙孢蘑菇、木耳等真菌最為常見[1]。微皮傘Marasmiellus是擔子菌門，層菌綱，傘菌目，小皮傘科，微皮傘屬真菌的總稱[2]。微皮傘屬約含250 個種，其中模式種為檜微皮傘Marasmiellus juniperinusMurrill[3-4]。該屬擔子果皮傘狀、臍菇狀或側耳狀，孢子印白色，世界各地均有分布。我國目前有白蓋微皮傘M.albiceps、白褐微皮傘M.albofuscus、白微皮傘M.candidus等 45 個記錄[5-7]。皮傘的藥用較多，眾多研究表明枝生微皮傘Marasmiellus ramealis和硬柄小皮傘Marasmius oreades具有抗腫瘤、抗菌、調節免疫和抗衰老等功效[8]，安絡小皮傘Marasmius androsaceus具有止痛、治療偏頭痛、風濕關節炎等作用[9]。豬苓作為藥用真菌，以菌核入藥，是我國著名的傳統中藥材。研究分離子午嶺野生豬苓菌核組織，得到菌株Z1j2，運用形態學觀察及rDNA-ITS 分子生物學鑒定的方法鑒定該菌株（GenBank 登錄號為OL351833），并對其生物學特性進行研究，對豐富當地真菌種質資源及后續開發利用具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試豬苓菌種：2019 年9 月于甘肅省慶陽市連家砭子午嶺林區，坐標北緯 36°02'，東經 108°28'，海拔1 260 m，選擇單株產量高、新鮮、有光澤、彈性好的豬苓菌核，低溫處理后帶回實驗室用PDA 培養基[10]進行組織分離而得。

1.2 試驗儀器與試劑

（1）儀器：立式高壓滅菌鍋、恒溫培養箱、電子天平、生物安全柜、水浴鍋等。

（2）試劑：75%乙醇、無水乙醇、葡萄糖、瓊脂粉、無菌水、鹽酸金霉素溶液。

1.3 試驗方法

1.3.1 組織分離

首先將豬苓菌核清洗干凈，放入0.2%的金霉素溶液中浸一下，立即取出，用無菌棉擦干凈，然后按無菌環境操作要求，用無菌刀片從豬苓菌核中間切開，用無菌鑷子在菌核中央挑取0.5 cm 大小的菌肉若干塊，迅速將其放于制備好的PDA 培養基上，每個培養基上放4 塊[11]，放入恒溫培養箱內，25 ℃黑暗條件下恒溫培養[12]。每天觀測分離得到的菌落形態與培養性狀，若發現有菌絲長出，初步分類并待產孢后進行純化，單孢分離純化采用平板稀釋畫線分離法[13]。

1.3.2 形態觀察

采用傳統鑒定方法，宏觀特征肉眼觀察、游標卡尺測量等方法，測量菌落直徑，觀察菌絲顏色。查閱文獻進行檢索、比對、初步定種；將分離純化的菌株接種到PDA 培養基上，25 ℃恒溫培養7 d 后取出，用透明膠帶的膠面輕輕接觸菌落表面，粘取一定量的菌絲體。在載玻片中央滴一滴乳酸酚棉蘭染液，將粘有菌絲體的透明膠帶完全浸入載玻片的染液內，并固定膠帶，自然風干后，在光學顯微鏡下觀察和測量孢子、菌絲形態及大小[14]。

1.4 ITS鑒定

1.4.1 DNA的提取

將原始菌株擴大培養后利用TIANGEN DNA KIT提取原始菌基因組DNA。

1.4.2 PCR擴增、純化及測序

配置PCR 反應液（表1）混勻后在PCR 擴增儀（ABI9700）上進行PCR，反應程序如表2。DNA 的提取、擴增產物的純化與測序均由通用生物系統（安徽）有限公司完成。

表1 PCR反應體系

表2 PCR反應程序

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

1.4.3 ITS序列比對分析

基于測序結果的ITS 序列，通過Chromas 軟件拼接，在NCBI 數據庫中進行ITS 序列的Blast 比對，從GenBank 下載的ITS 序列（表3），依據最大似然率從檢索的結果里挑選出同源性比較高的ITS 序列，先利用ClustalX 在線軟件進行多序列比對，然后利用MEGA7.0 軟件構建系統發育樹，發育樹的每個分支的統計學顯著性分析以最大似然法進行檢驗，重復次數為1000 次，根據ident（百分比）最終確定菌株的分類地位。RensKeLandeweer 等[15]認為通過ITS 區域比對，序列相似性大于99%，鑒別為相同種；序列相似性大于95%且小于99%，鑒別為相同屬。

表3 從GenBank下載的ITS序列來源信息

1.5 菌株Z1j2生物學特性研究

1.5.1 培養溫度試驗

試驗設定 5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃等7 個溫度處理，將純化培養7 d 的菌種，用無菌打孔器制成直徑為0.5 cm 菌餅，接種于PDA 培養基中央，置于以上7 個溫度處理的恒溫培養箱。逐日觀察并采用十字交叉法分別測定菌落的直徑，計算菌絲平均生長速度。

1.5.2 pH試驗

PDA 培 養 基用 0.1 mo1/L HCl 或 NaOH 調 成 pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0等6個梯度后滅菌，制平板，將菌餅接在不同pH 的PDA平板中央，于25 ℃條件下黑暗培養。數據測定及計算方法同1.5.1。

1.5.3 菌株Z1j2致死溫度的測定

在刻度試管中加蒸餾水2 mL，封口并高壓滅菌，冷卻后于無菌環境中接入直徑為0.5 cm的菌餅，置于 25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃的水浴鍋加熱15 min，立即置涼水中冷卻至室溫。將處理后的菌餅接種到PDA平板上。數據測定等同1.5.1。

1.5.4 供試碳源試驗

用蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、甘露醇、果糖代替基礎培養基等量的葡萄糖，配制含不同碳源培養基，接入直徑0.5 cm 的菌餅，置于25 ℃黑暗條件下培養。數據測定等同1.5.1。

1.5.5 供試氮源試驗

用酵母膏、尿素、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨代替基礎培養基等量的蛋白胨，配制含不同氮源培養基，接入直徑0.5 cm 的菌餅，置于25 ℃黑暗條件下培養。數據測定等同1.5.1。

2 結果與分析

2.1 Z1j2菌株的菌落形態特征

在PDA 培養基上，Z1j2 菌株的菌落為白色，絮狀，氣生菌絲發達，蓬松，菌絲具有較強的爬壁能力（圖1、圖2）。25 ℃條件下PDA 培養基上培養7 d后，菌落直徑達81 mm，基本長滿培養皿。在光學顯微鏡和電鏡掃描下觀察到微皮傘菌菌絲形態如圖3、圖4所示。

圖1 菌絲培養7 d形態（正面）

圖2 菌絲培養7 d形態（反面）

圖3 菌絲光學顯微鏡照片（10×40）

圖4 菌絲掃描電鏡照片（×2 000）

2.2 Z1j2菌株的ITS鑒定

為鑒定試驗中分離獲得的Z1j2 菌株與已知真菌的近緣關系，并確定其科學分類地位，利用PCR技術對分離獲得Z1j2 菌株的ITS 序列進行擴增（圖5）并測序，序列的大小為748 bp。與GenBank中已登錄的序列進行比對分析，菌株Z1j2 與微傘菌屬真菌的ITS 序列相似性達99%以上，利用最大似然率構建微皮傘屬系統發育樹，從系統發育樹上看到菌株Z1j2 與參照序列Marasmiellussp.（KJ609164.1）聚在同一小分支中（圖6），支持率為40%，結合菌落形態和ITS 序列分析，分離獲得的Z1j2 菌株為擔子菌門Basidiomycota、傘菌目Agaricales、小皮傘科Marasmiaceae、微皮傘屬Marasmiellus真菌。

圖5 Z1j2菌株的PCR產物

圖6 基于ITS序列（ITS1，5.8S rDNA and ITS4）構建的系統發育樹（最大似然率）

2.3 溫度試驗結果

由圖7 可以看出，隨著培養溫度升高，Z1j2 菌株菌絲平均生長速度逐漸加快，當溫度為25 ℃時菌絲平均生長速度達最大值，且與其他溫度差異顯著。培養溫度在25~30 ℃時菌絲生長較快，但培養溫度進一步升高，菌絲的生長受到抑制。

圖7 不同培養溫度下Z1j2菌株菌絲生長情況

Z1j2 菌株菌絲在 50 ℃，處理 15 min 就不能生長，可見菌絲致死溫度為50 ℃（圖8）。

圖8 Z1j2菌株菌絲致死溫度

2.4 pH試驗結果

由圖9 可以看出，Z1j2 菌株在試驗pH 的培養基上生長表現出差異，隨著pH 升高，菌絲的平均生長速度有下降的趨勢，可見Z1j2 菌株的菌絲生長適宜偏酸性。

圖9 不同pH下Z1j2菌株菌絲生長情況

2.5 碳源試驗結果

由表4 可知，供試6 種碳源中，以可溶性淀粉為碳源時，微皮傘菌Z1j2 菌絲生長最快，菌絲濃密，菌落邊緣規則，日平均生長速度為0.82 cm/d，顯著快于其他碳源，果糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖次之，麥芽糖菌絲日均長速最慢，為0.74 cm/d。綜合菌絲日平均生長速度及長勢，Z1j2 菌株固體培養基中的最佳碳源為可溶性淀粉。

表4 不同碳源對Z1j2菌株菌絲生長的影響

2.6 氮源試驗結果

由表5 可知，以尿素為氮源時Z1j2 菌株菌絲平均生長速度最快，日均長速為0.74 cm/d，顯著快于其他氮源，且菌絲生長粗壯濃密，邊緣規則，爬壁力強；以蛋白胨、酵母膏、硝酸銨、硫酸銨為氮源時，Z1j2 菌絲生長速度無顯著性差異，氯化銨為氮源時菌絲生長最慢。綜合菌絲平均生長速度及長勢，確定尿素為微皮傘菌Z1j2菌株菌絲生長的最佳氮源。

表5 不同氮源對Z1j2菌株菌絲生長的影響

3 小結

對子午嶺野生豬苓菌核中分離出的菌株形態學觀察和分子生物學鑒定結果表明，該菌株（Z1j2）為微皮傘屬Marasmiellus真菌。對Z1j2 菌株的生物學特性研究結果表明，Z1j2 的最適宜生長溫度為25 ℃，極端低溫和高溫都抑制其生長，菌絲致死溫度為50 ℃。該菌株菌絲生長適宜偏酸性的培養基，最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為尿素。目前關于南方小皮傘科物種的報道居多，北方微皮傘屬物種的報道較少。子午嶺作為天然氧吧，動物、植物、微生物等種質資源都極為豐富[16]，希望通過筆者的研究，吸引更多專家學者關注子午嶺野生中藥材和微皮傘屬等真菌物種，以便于今后開發利用更有價值的真菌資源。