Ghsr-/-小鼠黑質ATP敏感性鉀通道亞基表達改變

呂吉榮,肖雪,焦倩,陳曦,杜希恂,姜宏

(青島大學國家生理學重點(培育)學科,山東 青島 266071)

生長激素促分泌素受體1a(GHSR1a)是一種廣泛分布在下丘腦、垂體、腹側被蓋區、中縫核、海馬和黑質致密部等區域的G蛋白偶聯受體[1]。ghrelin是其唯一的內源性配體[2]。本實驗室前期研究結果證實，ghrelin-GHSR1a可以通過改善線粒體功能，拮抗魚藤酮和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導的多巴胺(DA)能神經元細胞的死亡[3-4]。同時，GHSR1a還具有本構型活性，即在缺乏配體或激動劑的情況下，受體仍能自發地維持激活并維持下游信號轉導通路的活性[5-6]。已有研究結果表明，在小鼠腦內黑質立體定位注射GHSR1a拮抗劑可誘導DA能神經元中GHSR1a表達下調，并導致小鼠運動功能障礙[7]。

ATP敏感性鉀通道(KATP通道)作為一種內向整流鉀通道，由4個內向整流鉀通道Kir6.X亞基(Kir6.1或Kir6.2)和4個磺酰脲受體(SUR)亞基組成，具有改善細胞內能量代謝水平和穩定內環境的作用[8-10]。近年來的研究表明，KATP通道的選擇性激活可能參與了帕金森病(PD)中黑質DA能神經元的損傷[11-12]。PD病人尸檢結果顯示，腦內黑質殘存的DA能神經元上雖然同時表達有SUR1、SUR2B和Kir6.2等3種不同類型的KATP通道，但只有SUR1mRNA水平顯著升高，其余亞基表達均無改變[12]。本實驗室前期研究結果證實，在3、6和9月齡的PD轉基因小鼠黑質中KATP通道SUR1亞基的蛋白和mRNA表達水平均顯著上調。亦有研究證實，ghrelin-GHSR1a可以通過激活KATP通道調節迷走神經節狀神經核的興奮性。而GHSR1a是否也參與調節疾病進展過程中KATP通道各亞單位的表達變化尚不清楚。因此，本研究選取3月齡GHSR1a敲除(Ghsr-/-)小鼠和同窩野生型(WT)小鼠，應用蛋白免疫印跡和實時熒光定量PCR方法對黑質的KATP通道各亞基蛋白及mRNA水平進行檢測，為闡明GHSR1a與KATP通道在PD發病中的相互作用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 所用Ghsr-/-小鼠均購自上海南方模式生物科技發展有限公司。Ghsr+/-小鼠與Ghsr+/-小鼠雜交得到下一代小鼠，通過基因鑒定得到Ghsr-/-小鼠及相應的同窩WT小鼠。本實驗選用3月齡的Ghsr-/-雄性小鼠和同窩WT雄性小鼠作為研究對象，每組5只。小鼠在室溫(23±1)℃、12 h晝夜循環光照的環境下進行飼養，可自由飲水與進食。所有動物實驗操作均遵循醫學倫理學原則。

1.1.2實驗儀器及試劑 SUR1抗體、SUR2B抗體、Kir6.2抗體均購自美國Abcam公司；β-actin抗體購自中國Bioss公司；山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗均購自美國Santa Cruz公司；SDS-PAGE分離膠緩沖液和SDS-PAGE濃縮膠緩沖液均購自美國Sigma公司；ECL發光液、PVDF膜購自美國Millpore公司；RIPA裂解液、過硫酸銨(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、BCA試劑盒、Loading buffer均購自中國碧云天公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自美國Thermo公司；SYBR Premix Ex Taq(2×)購自日本Takara公司。所用實驗儀器包括電泳儀、電轉儀、天能GIS凝膠圖像處理系統、高速低溫離心機、實時熒光定量PCR儀、分光光度計。

1.1.3實驗液體配制 0.01 mol/L PBS：稱取4.0 g Na2HPO4·12H2O、0.4 g NaH2PO4·2H2O以及9.0 g NaCl，用雙蒸水定容至1 L。電泳緩沖液：稱取Tris 1.51 g、甘氨酸7.20 g、SDS 0.50 g,使用雙蒸水定容至1 L，調節pH值至8.3。轉膜緩沖液：稱取Tris 3.0 g、甘氨酸14.4 g，分別加入800 mL的雙蒸水和200 mL的甲醇，調節pH值至8.3。TBST溶液：稱取Tris 2.42 g、NaCl 8.00 g，用雙蒸水定容至1 L，加入1 mL Tween-20，調節pH至7.5。封閉液：用TBST溶液配制的50 g/L脫脂奶粉。

1.2 蛋白免疫印跡法檢測黑質SUR1、SUR2B和Kir6.2蛋白的表達

小鼠用異氟烷深度麻醉后，斷頭取腦。根據腦圖譜，分別取出大腦雙側黑質區域，并置于預冷的1.5 mL EP管中，分別向EP管內加入100 μL的RIPA裂解液。在冰上用電動研磨棒充分研磨至管內腦組織完全溶解，再置于冰上裂解30 min。把裂解好的組織放入離心機中，在4 ℃下以12 000 r/min的速度離心20 min。離心后取出EP管，將上清液轉移到新的EP管中，應用BCA法測定波長562 nm處的吸光度，繪制標準曲線，并計算出待測樣本的濃度。配制100 g/L分離膠和50 g/L濃縮膠，按照樣品上樣量準確上樣，蛋白經SDS-PAGE電泳后，濕轉到PVDF膜上，轉膜完成后，將PVDF膜置于50 g/L脫脂奶粉封閉液中，室溫搖床孵育2 h；分別加入一抗SUR1(1∶1 000)、SUR2B(1∶1 000)、Kir6.2(1∶1 000)以及β-actin(1∶1 000)，于4 ℃搖床上低速搖動孵育過夜；用1×TBST溶液漂洗3次，每次10 min；加入用1×TBST溶液配制的山羊抗兔二抗(1∶10 000)、山羊抗鼠二抗(1∶10 000)，室溫搖床孵育1.5 h；再用1×TBST溶液漂洗3次，每次10 min。將PVDF膜置于ECL顯影液中孵育1 min，再將PVDF膜置于顯影儀中顯影并拍攝。用Image J 10.0分析軟件對條帶進行灰度值分析，以SUR1、SUR2B、Kir6.2與β-actin的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.3 實時熒光定量PCR方法檢測黑質中SUR1、SUR2B和Kir6.2的mRNA表達

用TRIzol提取小鼠黑質RNA，按照Thermo公司逆轉錄試劑盒操作說明，配制兩步反應體系，先42 ℃變性60 min、25 ℃反轉錄5 min，然后升溫至70 ℃、作用5 min使反轉錄酶失活，于4 ℃冷卻，將mRNA反轉錄合成cDNA。采用SYBR Green染料法定量檢測目的基因SUR1、SUR2B、Kir6.2及內參照基因GAPDH的表達，按照熒光定量PCR說明書配制PCR反應體系，采用兩步法經過40個循環完成擴增，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。PCR擴增引物及其序列見表1。

1.4 統計學分析

表1 PCR引物及其序列

2 結 果

2.1 Ghsr-/-小鼠黑質SUR1、SUR2B、Kir6.2的蛋白表達變化

Ghsr-/-組和WT組3月齡小鼠黑質KATP通道亞基SUR1蛋白表達水平分別為0.996±0.120和0.473±0.076(n=5)，差異有統計學意義(t=3.389，P<0.05)；SUR2B蛋白表達水平分別為0.899±0.142和0.798±0.118(n=5)，差異無統計學意義(t=0.492，P>0.05)；Kir6.2蛋白表達水平分別為0.827±0.081和0.728±0.065(n=5)，差異亦無統計學意義(t=0.860，P>0.05)。

2.2 Ghsr-/-小鼠黑質SUR1、SUR2B、Kir6.2的mRNA表達變化

Ghsr-/-組和WT組3月齡小鼠黑質KATP通道亞基SUR1mRNA的表達水平分別為1.024±0.074和0.990±0.047(n=5)，SUR2BmRNA的表達水平分別為1.012±0.082和1.212±0.421(n=5)，而Kir6.2mRNA的表達水平分別為1.137±0.466和1.209±0.118(n=5)，兩組比較差異均無統計學意義(t=0.294～1.546，P>0.05)。

3 討 論

GHSR1a和KATP通道都廣泛分布于中樞神經系統[13-14]。GHSR1a主要通過與ghrelin結合發揮作用，但是其在缺乏配體激活時也能夠對學習記憶、生長發育等發揮調節作用，這就是GHSR1a的本構型活性[15]。先前有研究結果表明，GHSR1a和多巴胺受體1型(DRD1)結合可以在中腦和海馬的神經元亞群中共表達，且可在體外形成異源二聚體，從而進一步修飾G蛋白，擴增DA信號[16-18]。然而，在PD特異性誘導的多能干細胞來源的DA能神經元中GHSR1a的表達顯著降低，提示GHSR1a與PD密切相關[19]。本實驗選取Ghsr-/-小鼠作為實驗對象，通過蛋白免疫印跡法檢測到腦內黑質DA能神經元KATP通道SUR1亞基蛋白表達水平顯著下調，而SUR2B、Kir6.2亞基蛋白表達均未發生明顯改變。本研究同時應用實時熒光定量PCR方法檢測了KATP通道各亞基mRNA表達水平變化，結果顯示，Ghsr-/-小鼠黑質SUR1、SUR2B及Kir6.2的mRNA表達水平均未發生改變。我們推測這可能與GHSR1a基因敲除后DA能神經元內蛋白質降解異常有關，GHSR1a基因敲除一方面可能引起神經元內自噬的過度激活，另一方面可能引起蛋白泛素化水平異常，使蛋白降解增加。但具體機制還有待于進一步探討。

SUR1是構成KATP通道的亞基之一，屬于三磷酸腺苷結合盒轉運體(ABC)蛋白家族，它主要調節KATP通道對ATP、腺苷和藥物的敏感性[20-22]。本實驗室前期研究證實，攜帶人A53T突變型α-syn的轉基因PD模型小鼠黑質KATP通道的SUR1蛋白表達水平顯著上調，而Kir6.2和SUR2B的表達無明顯變化。另有研究結果顯示，PD病人DA能神經元中SUR1的表達水平比正常人高2倍[23]。KATP通道SUR1亞單位的表達上調能夠激活腺苷酸激活蛋白激酶，促進KATP通道的跨膜轉運，進而促進其開放[24-25]。但是在PD發病過程中，SUR1的表達異常對于黑質DA能神經元具有何種作用尚不明確。到目前為止，KATP通道在PD中的作用還存在一定的爭議。在PD發病早期，KATP通道的激活可以促進DA釋放，從而保護神經元。然而，隨著疾病的進一步發展，KATP通道會持續激活，造成DA能神經元損傷[26-27]。因此，由GHSR1a基因敲除介導的KATP通道SUR1亞單位表達變化的機制及其在PD中的作用還有待于進一步探討。本文研究結果為GHSR1a與KATP通道在PD中的作用研究提供了理論依據。