寶藿苷Ⅰ對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷保護作用

王仕穎,孫崇崇,鄭丹雯,王曉雯,陳文芳

(青島大學基礎醫學院生理學與病理生理學系,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是第二大常見的神經退行性疾病，主要病理表現為黑質致密部多巴胺(DA)能神經元的選擇性死亡[1]。研究結果表明，α-突觸核蛋白(α-synuclein)的過表達和錯誤折疊與PD的發展密切相關，它在病理狀態下易聚集形成不溶性的纖維蛋白沉淀，導致神經元變性死亡[2]。淫羊藿是一種傳統中草藥，在中國被廣泛用于治療骨質疏松癥、補腎壯陽、改善學習記憶功能等[3-5]。寶藿苷Ⅰ是淫羊藿的主要藥理活性成分之一，多項研究已經證實寶藿苷Ⅰ具有豐富的藥理作用，如抗腫瘤、抗骨質疏松等[6-7]。研究發現，寶藿苷Ⅰ可以通過抗氧化減輕大鼠的神經元損傷，還能夠通過雌激素受體(ER)抑制破骨細胞的分化和骨的吸收[8-9]。但是寶藿苷Ⅰ對DA能神經元的損傷是否具有保護作用尚未見報道。本研究應用1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)損傷人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，探討寶藿苷Ⅰ對MPP+誘導神經細胞損傷的保護作用及其可能機制。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用SH-SY5Y細胞購自中國科學院上海細胞庫；寶藿苷Ⅰ購自上海同田生物技術有限公司，用二甲基亞砜(DMSO)配制成0.10 μmol/L溶液；MPP+購自Sigma公司，用磷酸鹽緩沖液配制成濃度10 mmol/L的溶液；ER特異性阻斷劑ICI 182,780購自Sigma公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)購自Duchefa公司；DMEM高糖培養液和胎牛血清購自BI公司；青霉素/鏈霉素儲存液購自北京索萊寶科技有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒購自雅酶公司；兔抗α-synuclein抗體和兔抗β-actin抗體購自CST公司；山羊抗兔IgG-HRP二抗購自雅酶公司；ECL發光液購自Vazyme公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 SH-SY5Y細胞分別接種于96孔板和6孔板內，加入含體積分數0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養液，在37 ℃、體積分數0.05 CO2條件下進行培養。

1.2.2MTT方法檢測細胞活力 該實驗分為對照組(A組)、MPP+組(B組)、MPP++0.01 μmol/L寶藿苷Ⅰ組(C組)、MPP++0.10 μmol/L寶藿苷Ⅰ組(D組)、MPP++1.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ組(E組)、MPP++10.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ組(F組)、MPP++20.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ組(G組)。將SH-SY5Y細胞接種于96孔板，用不同濃度寶藿苷Ⅰ(前2組不用寶藿苷Ⅰ處理，后5組寶藿苷Ⅰ濃度分別為0.01、0.10、1.00、10.00、20.00 μmol/L)處理24 h，再加1 mmol/L 的MPP+(對照組除外)作用24 h，棄掉96孔板內的培養液，加5 g/L的MTT 20 μL，置37 ℃培養箱內孵育4 h；再將MTT輕輕吸出，每孔加入100 μL的DMSO溶解沉淀，室溫避光搖床孵育10 min，待沉淀完全溶解后，用酶標儀讀取光密度值，計算細胞存活率，根據細胞存活率篩選出寶藿苷Ⅰ的最佳用藥濃度。

1.2.3免疫印跡法(Western blot)檢測α-synuclein的表達 用6孔板培養細胞，該實驗分為對照組、MPP+組、MPP++寶藿苷Ⅰ組、MPP++寶藿苷Ⅰ+ICI 182,780組、寶藿苷Ⅰ組。對照組和MPP+組的細胞分別給予體積分數0.001的DMSO和1 mmol/L 的MPP+處理；MPP++寶藿苷Ⅰ組細胞先應用0.10 μmol/L的寶藿苷Ⅰ預保護24 h，再給予1 mmol/L的MPP+作用24 h；MPP++寶藿苷Ⅰ+ICI 182,780組先應用1.00 μmol/L的ICI 182,780處理1 h，再給予寶藿苷Ⅰ和MPP+處理；寶藿苷Ⅰ組給予0.10 μmol/L寶藿苷Ⅰ作用48 h。藥物處理細胞后，棄去細胞培養液，每孔加入裂解液(lysis∶PMSF=99∶1)100 μL，冰上裂解30 min后用細胞刮刮下蛋白，收集至1.5 mL的EP管中。在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，離心后取上清80 μL，使用BCA法測蛋白濃度。每組取15 μg蛋白上樣并進行電泳，電泳完成后轉膜，轉膜條件為300 mA、90 min。應用50 g/L脫脂奶粉將膜封閉1 h，加入α-synuclein、β-actin一抗，4 ℃搖床孵育過夜，再加入HRP標記山羊抗兔IgG二抗孵育1 h，使用ECL發光液顯影檢測。應用Image J軟件進行分析，目的蛋白的表達以α-synuclein與β-actin灰度值的比值表示。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 不同濃度寶藿苷Ⅰ對MPP+誘導的細胞存活率的影響

MTT檢測結果顯示，各組細胞存活率比較差異有顯著性(F=51.070，P<0.01)。組間兩兩比較，應用MPP+處理后，SH-SY5Y細胞存活率明顯下降(q=3.751，P<0.05)；0.10、1.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ可有效對抗MPP+誘導SH-SY5Y細胞存活率下降(q=5.549、5.453，P<0.01)，且寶藿苷Ⅰ在0.10 μmol/L時效果最顯著；而10.00和20.00 μmol/L的寶藿苷Ⅰ則會加重MPP+誘導的細胞損傷(q=6.408、13.650，P<0.01)。故選用0.10 μmol/L的寶藿苷Ⅰ進行后續實驗。見表1。

2.2 寶藿苷Ⅰ對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞α-synuclein蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，各組細胞α-synuclein蛋白表達比較差異有顯著性(F=7.913，P<0.01)。組間兩兩比較，與對照組相比，MPP+組SH-SY5Y細胞中α-synuclein蛋白表達水平明顯增高(q=5.709，P<0.01)；而MPP++寶藿苷Ⅰ組細胞中α-synuclein蛋白表達水平較MPP+組明顯降低(q=3.485，P<0.05)；ICI 182,780預處理可以阻斷寶藿苷Ⅰ的神經保護作用(q=4.350，P<0.05)；寶藿苷Ⅰ單獨應用對α-synuclein蛋白的表達無明顯影響。見圖1。

表1 不同濃度寶藿苷Ⅰ對MPP+誘導的細胞存活率的影響

①Western blot檢測各組細胞中α-synuclein蛋白表達；②各組細胞α-synuclein蛋白表達水平的比較(n=4)。Control為對照組，MPP+為MPP+組，Bao+MPP+為MPP++寶藿苷Ⅰ組，Bao+MPP++ICI為MPP++寶藿苷Ⅰ+ ICI 182,780組，Bao為寶藿苷Ⅰ組。與對照組相比較，**q=5.709，P<0.01；與MPP+組相比較，∧q=3.485，P<0.05；與MPP++寶藿苷Ⅰ組相比較，#q=4.350，P<0.05。

3 討 論

PD主要的病理改變為路易小體的堆積和黑質致密帶DA能神經元的變性死亡，其機制與α-synuclein的聚集有關[2,10-12]。Parkin蛋白通過與神經突觸素-1相互作用引起α-synuclein的泛素化，從而促進路易小體的形成[13]。研究表明，過度表達的α-synuclein可抑制囊泡內吞而影響神經傳遞過程，并且通過破壞DA的合成、儲存、回收、再攝取和流出而導致PD[14]。

近年來，大量研究已證實傳統中草藥活性成分可以改善PD模型的病理進程[15]。本課題組前期的工作已證實，淫羊藿主要活性成分淫羊藿苷、淫羊藿素可通過ER途徑發揮其對DA能神經元的保護作用。寶藿苷Ⅰ作為淫羊藿總黃酮的重要活性成分，具有多種藥理作用。在鵝膏蕈氨酸誘導的腦功能障礙大鼠模型中，寶藿苷Ⅰ可以通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號傳導對抗鵝膏蕈氨酸誘導的認知缺陷[16]。在過氧化氫(H2O2)誘導的高度分化的大鼠神經元PC12細胞模型中，寶藿苷Ⅰ通過減弱細胞內活性氧的產生、線粒體損傷和激活糖原合酶激酶-3β來抑制H2O2誘導的細胞死亡[17]。此外，在側腦室注射脂多糖所致急性神經炎癥的大鼠模型中，寶藿苷Ⅰ預處理不僅能抑制小膠質細胞和星形膠質細胞的活化，還可以通過抑制TOLL樣受體4(TLR4)/髓樣分化因子88(MyD88)/核因子κB(NF-κB)通路顯著逆轉多種炎癥因子的表達[18]。為探討寶藿苷Ⅰ對DA能神經元的保護作用及其機制，本研究利用MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷，觀察寶藿苷Ⅰ是否能發揮神經保護作用。結果顯示，0.10、1.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ能明顯對抗MPP+對SH-SY5Y細胞損傷，而10.00、20.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ對SH-SY5Y細胞具有毒性作用；0.10 μmol/L寶藿苷Ⅰ預保護可以顯著抑制MPP+誘導的α-synuclein表達上調。在本課題組前期的研究中，ER激動劑17β-雌二醇(E2)能夠明顯降低MPP+的毒性作用，但E2作為一種雌激素，長期使用可對人體產生嚴重的副作用。因此，從傳統中藥中尋找具有類雌激素樣作用且副作用相對更小的植物雌激素，對中國傳統中藥的推廣應用具有重要意義。已有研究表明，寶藿苷Ⅰ可以通過ER依賴性途徑在刺激大鼠骨肉瘤UMR-106細胞增殖、堿性磷酸酶活性和NF-κB受體活化因子配體基因表達等方面發揮與雌激素相似的骨保護作用[19]。為進一步探討寶藿苷Ⅰ神經保護作用是否與ER信號途徑有關，本研究觀察了ER特異性阻斷劑ICI 182,780對寶藿苷Ⅰ神經保護作用的阻斷效應，結果顯示寶藿苷Ⅰ對α-synuclein蛋白表達的抑制作用可被ICI 182,780所阻斷。以上結果表明，寶藿苷Ⅰ通過激活雌激素信號途徑抑制MPP+誘導的α-synuclein蛋白表達上調，發揮保護DA能神經元的作用。

綜上所述，寶藿苷Ⅰ能夠抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷，其機制可能與ER信號途徑有關。本文結果為研究寶藿苷Ⅰ神經保護作用的靶點和可能機制提供了新的實驗依據。