α-syn在不同月齡A53T小鼠小腸中表達變化

劉玫秋,陳曦,姜宏

(青島大學國家生理學重點(培育)學科,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)主要包括靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態(tài)障礙等[1]。PD主要病理特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的進行性喪失以及路易小體的出現(xiàn)。路易小體由異常聚集的α-突觸核蛋白(α-syn)所形成。α-syn是一種小分子酸性蛋白質(zhì)，主要表達于突觸前末端，在PD致病中的關鍵作用已被廣泛證實[2]。α-syn在細胞內(nèi)聚集，可促進線粒體損傷，破壞溶酶體和高爾基體等，并增加細胞對氧化應激的易感性，進而促進細胞死亡[3-6]。

研究結(jié)果表明，PD病人非運動癥狀出現(xiàn)比運動癥狀提前10～20年，胃腸功能障礙是PD最常見的非運動癥狀，嚴重影響著病人的生活質(zhì)量[7-9]。根據(jù)BRAAK等[10-11]的學說，α-syn的聚集可能始于外周(包括腸神經(jīng)系統(tǒng))，并由外周沿迷走神經(jīng)向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳播。在PD的不同階段，α-syn在腸中的表達量可能會不同程度地影響胃腸功能。A53T小鼠是攜帶人A53T突變型α-syn基因的PD模型小鼠。在體內(nèi)，基因突變誘導的α-syn的高表達可導致路易小體的形成和黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失[12-13]。純合子的A53T小鼠從6月齡開始表現(xiàn)出PD的運動癥狀，并表現(xiàn)出更早和更嚴重的胃腸運動功能下降。但是，在運動癥狀出現(xiàn)之前小鼠胃腸道中α-syn的表達是否已有改變尚不清楚。因此，本實驗觀察了α-syn在3月齡和6月齡的A53T小鼠小腸中的表達變化。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

野生型(WT)小鼠購于北京維通利華公司；A53T小鼠(B6；C3-Tg(PrnpSNCA*A53T)83Vle/J)購自南京大學模式動物研究所。兩種小鼠均按照SPF級別標準，飼養(yǎng)于溫度為(22±2)℃、濕度為(50±10)%、12 h晝夜循環(huán)光照的安靜環(huán)境中，可自由飲水、進食。選用3月齡和6月齡A53T純合子轉(zhuǎn)基因小鼠和WT小鼠，每組4只。

1.2 實驗試劑

α-syn抗體、Beta tubulin抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；NFH抗體購于美國Santa公司；山羊抗兔和山羊抗鼠抗體購于英國Thermo Fisher Scientific公司；PVDF膜、ECL發(fā)光液均購于美國Millipore公司；山羊血清購于中國Solarbio公司；DAPI染液購于中國Roche公司；冷凍切片包埋劑購于日本TaKaRa公司；Triton X-100購于韓國Biosharp公司；Tween-20購于美國Sigma公司。

1.3 蛋白免疫印跡法檢測小鼠小腸組織中α-syn蛋白表達

將小鼠麻醉后，取其鄰近十二指腸的空腸1 cm。向裝有小腸組織的EP管內(nèi)加入300 μL組織裂解液，用研磨器充分研磨，在冰上進行裂解，靜置30 min后，在4 ℃下以1 200 r/min離心20 min，吸取上清置于新的EP管中，采用BCA法檢測蛋白濃度。按照每孔20 μg蛋白計算上樣量，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳(80 V、30 min，120 V、60 min)后，電轉(zhuǎn)到0.22 μm的PVDF膜上，加100 g/L脫脂奶粉于室溫搖床孵育2 h；加入相應的一抗(α-syn滴度為1∶1 000，Beta tubulin滴度為1∶10 000)，4 ℃搖床孵育過夜(時間>16 h)，用TBST溶液洗3次，每次10 min；分別加入山羊抗兔和山羊抗鼠(滴度均為1∶10 000)的HRP-IgG二抗并室溫孵育1.5 h，然后使用TBST溶液洗3次，每次10 min。ECL發(fā)光液顯影后用Image J軟件讀取條帶灰度值，對α-syn表達水平進行分析。

1.4 免疫熒光實驗

取小鼠近十二指腸的空腸1 cm，放入40 g/L多聚甲醛內(nèi)浸泡1周，之后將小腸分別置于200 g/L和300 g/L蔗糖溶液中梯度沉糖。將沉糖處理后的小腸于冷凍切片機上切成15 μm厚的冷凍切片，并貼到多聚賴氨酸處理過的病理級別載玻片上，在常溫下晾干(24 h)。用0.01 mol/L的PBS清洗包埋劑，然后用體積分數(shù)0.1的山羊血清封閉2 h；加入α-syn(滴度1∶250)和NFH(滴度1∶500)一抗4 ℃孵育過夜，用0.01 mol/L PBST溶液洗3次，每次10 min；分別加入山羊抗兔(滴度1∶500)和山羊抗鼠(滴度1∶500)的二抗并室溫孵育1.5 h，然后用0.01 mol/L PBST溶液洗3次，每次10 min。封片，加入體積分數(shù)0.7的甘油后蓋上蓋玻片，晾干后進行熒光觀察。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 不同月齡WT和A53T小鼠小腸組織α-syn表達比較

蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，與同月齡WT組小鼠相比，3月齡、6月齡A53T組小鼠小腸組織α-syn表達量顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義(F=3.107、2.955，P<0.05)；6月齡A53T組小鼠小腸的α-syn表達量比3月齡A53T組小鼠增加21.71%，兩組相比差異具有統(tǒng)計學意義(F=2.836，P<0.05)。說明A53T小鼠小腸組織α-syn的表達遠高于WT小鼠，6月齡A53T小鼠小腸組織α-syn的表達高于3月齡A53T小鼠。見表1。

表1 不同月齡WT和A53T小鼠小腸組織α-syn表達的比較

2.2 免疫熒光檢測不同月齡WT和A53T小鼠小腸組織α-syn表達

免疫熒光實驗結(jié)果顯示，與同月齡WT組小鼠相比，3月齡、6月齡A53T組小鼠小腸組織α-syn表達量顯著增高；6月齡A53T組小鼠小腸組織α-syn表達量明顯高于3月齡A53T組小鼠。見圖1。

3月齡WT小鼠(A、C)和A53T小鼠(B、D)小腸α-syn染色，6月齡WT小鼠(E、G)和A53T小鼠(F、H)小腸α-syn染色。標尺=100 μm。

3 討 論

本實驗通過蛋白免疫印跡和免疫熒光方法證實，與同月齡的WT小鼠相比較，3月齡和6月齡A53T小鼠小腸組織α-syn表達顯著增加，且隨年齡的增長，A53T小鼠小腸組織α-syn的表達增加。

PD是一種多系統(tǒng)受累的神經(jīng)退行性疾病，其臨床癥狀不僅包括運動癥狀，還包括便秘、胃排空延遲、唾液分泌過多、吞咽困難、惡心以及嗅覺障礙、抑郁和睡眠障礙等非運動癥狀[8]。其中，胃腸道功能障礙是PD發(fā)展過程中一種常見非運動癥狀[14]。2003年，BRAAK等的學說認為，腸道中的α-syn可向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳播，最初傳播到舌咽和迷走神經(jīng)背側(cè)運動核以及嗅球，隨后逐漸傳播到中腦黑質(zhì)區(qū)，最終達到皮質(zhì)層[15]。由于在PD病人的疾病早期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了腸道中α-syn的異常沉積，故推測腸神經(jīng)系統(tǒng)可能是α-syn的一個起始病理位點。α-syn主要位于Meissner和Auerbach’s神經(jīng)叢的腸神經(jīng)元中[16-18]。最近的研究結(jié)果還表明，多種危險因素可能單獨或共同導致α-syn在腸道表達的增加，例如腸道菌群、腸道炎癥和腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞功能障礙等[19-21]。了解腸道中的α-syn是如何開始聚集的，將有助于治療胃腸功能障礙，并可能有助于預防或延緩PD的發(fā)生和發(fā)展。

與PD相關的特異性遺傳突變首先發(fā)現(xiàn)于1997年，其中A53T點突變屬于常染色體顯性遺傳，該突變引起的PD通常具備早發(fā)性以及病情進展迅速等特點[22-23]。α-syn第53位的丙氨酸被蘇氨酸替代后，能促進可溶性的α-syn寡聚體或原纖維的形成，并可以作為種子促進α-syn在神經(jīng)元之間的傳播。在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，表達人突變型α-syn的A53T轉(zhuǎn)基因小鼠應用最為廣泛。過度表達人A53T突變型α-syn的小鼠隨年齡增長會表現(xiàn)出嚴重的運動障礙以及α-syn病[14,24]。研究發(fā)現(xiàn)，在A53T小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元和脊髓運動神經(jīng)元的細胞質(zhì)中存在包裹體，包裹體中包含人α-syn和硝基化的α-syn，并且運動神經(jīng)元在A53T小鼠中耗竭可達75%[13,25]。有研究通過檢測A53T純合子小鼠的食物攝入量、結(jié)腸動力以及結(jié)腸和回腸環(huán)形肌的收縮活動發(fā)現(xiàn)，3月齡純合子A53T小鼠的進食量與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比雖然無明顯變化，但腸道運輸時間比非轉(zhuǎn)基因小鼠延遲2 h左右，同時結(jié)腸和回腸環(huán)形肌運動反應幅度也明顯下降；6月齡純合子A53T小鼠的胃腸道運輸功能逐漸降低，腸道運輸時間延遲超過3 h，與此同時，結(jié)腸和回腸環(huán)形肌運動反應幅度進一步降低[26-27]。本實驗結(jié)果顯示，3月齡A53T小鼠小腸組織α-syn的表達已經(jīng)較同月齡WT小鼠出現(xiàn)明顯增加，6月齡A53T小鼠小腸組織α-syn表達亦比3月齡A53T小鼠增加。這說明小腸組織α-syn和PD的胃腸功能障礙可能存在聯(lián)系。A53T小鼠在3月齡出現(xiàn)結(jié)腸動力障礙時，并未出現(xiàn)PD的運動癥狀，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也未出現(xiàn)α-syn的病理性聚集，甚至到6月齡時，中樞神經(jīng)系統(tǒng)也未有α-syn的病理性聚集[26]，但事實上此時腸道中的α-syn已經(jīng)增加。因此，腸內(nèi)α-syn的表達量可能作為PD的一項早期診斷指標，本實驗結(jié)果為此提供了數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，在未出現(xiàn)運動癥狀的3月齡A53T小鼠小腸中組織有α-syn的表達增加，并且隨年齡增長，A53T小鼠小腸組織α-syn表達也增加。