腫瘤壞死因子α對星形膠質(zhì)細(xì)胞激活表型的影響

張丹陽,謝俊霞,王俊

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病[1]。有研究表明，神經(jīng)炎癥在PD中發(fā)揮重要作用[2]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是哺乳動物腦內(nèi)分布最廣泛的一類細(xì)胞[3]。生理狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞參與血-腦脊液屏障的生成和維持，分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子來調(diào)節(jié)突觸發(fā)生、神經(jīng)元分化和神經(jīng)元存活，通常以膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)作為活化標(biāo)志物[4]。病理狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞可由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，加劇或減弱損傷[5-6]。根據(jù)作用的不同，可將星形膠質(zhì)細(xì)胞分為具有促炎作用的A1型和具有抗炎作用的A2型[7]。補體成分3(C3)在A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，可以作為A1型細(xì)胞的標(biāo)志物，同理Pentraxin 3(PTX3)可以作為A2型細(xì)胞的標(biāo)志物[7-9]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)在內(nèi)的多種細(xì)胞因子，對星形膠質(zhì)細(xì)胞具有復(fù)雜的影響。本實驗旨在研究經(jīng)細(xì)胞因子TNF-α處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活表型，探討TNF-α在星形膠質(zhì)細(xì)胞激活中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞(從出生24 h以內(nèi)的大鼠乳鼠中腦獲取)，DMEM/F1基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胰蛋白酶(美國Hyclone公司)，胎牛血清(PBS，中國依科賽生物科技(太倉)有限公司)，青霉素-鏈霉素溶液、CCK-8試劑盒(中國北京索萊寶科技有限公司)，D-多聚賴氨酸、大鼠TNF-α(美國Sigma公司)，大鼠GAPDH、C3、PTX3基因引物(Takara公司，引物序列見表1)，一步法總RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國賽默飛公司)，熒光定量PCR試劑盒(德國QIAGEN公司)。

1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)

實驗前將實驗器具高壓滅菌。150 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶用D-多聚賴氨酸處理過夜，再用高壓滅菌去離子水清洗3次備用。取兩個玻璃培養(yǎng)皿，每皿中加入10～15 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液，置于冰上。取出生24 h內(nèi)大鼠乳鼠，用體積分?jǐn)?shù)0.75醫(yī)用乙醇消毒，斷頸取頭，在解剖顯微鏡下用眼科剪和眼科鑷取中腦置培養(yǎng)皿中，先后使用1 000 μL和200 μL移液槍將組織塊輕輕吹打至消散，加3 mL胰蛋白酶吹打約10次，加3.5 mL完全培養(yǎng)液終止消化，將其吸至50 mL離心管中，以1 000 r/min離心5 min。棄上清，用完全培養(yǎng)液重懸沉淀，將其接種于培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d后，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶封口后固定于空氣浴恒溫?fù)u床上，以220 r/min劇烈振蕩16 h。棄上清液，每個培養(yǎng)瓶中加入10 mL胰蛋白酶，置于37 ℃消化1 min，再加入等量完全培養(yǎng)液終止消化，使用一次性滅菌塑料吸管將培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞吹打下來，將培養(yǎng)液收集到離心管中，以1 000 r/min離心5 min。棄上清，加入完全培養(yǎng)液重懸沉淀，將細(xì)胞接種于孔板或培養(yǎng)瓶中。

表1 PCR引物序列

1.3 CCK-8法檢測TNF-α對星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響

TNF-α濃度梯度分別為0、5、10、20、40、80 μg/L，實驗操作與數(shù)據(jù)處理按照試劑盒說明書進行。

1.4 實驗分組及處理

實驗分為對照組和TNF-α處理組。將原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2 mL細(xì)胞懸液；第2天分組處理細(xì)胞，將兩組細(xì)胞培養(yǎng)液均換成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，TNF-α處理組用TNF-α(10 μg/L)處理，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.5 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測C3和PTX3 mRNA表達(dá)

向6孔板每孔中加入1 mL Trizol，冰上靜置5 min，用1 mL槍頭吹打貼附在板底的星形膠質(zhì)細(xì)胞，用移液槍移入預(yù)先標(biāo)記好的1.5 mL脫酶EP管中，向每管中加入200 μL氯仿，劇烈振蕩混勻后，于冰上靜置5 min，在4 ℃下以12 000 r/min離心15 min。吸取400 μL上層水相，移至另一預(yù)先標(biāo)記好的1.5 mL脫酶EP管中，向每管中加入400 μL異丙醇，輕輕顛倒混勻，冰上靜置10 min，在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min。棄上清，加入DEPC水和無水乙醇配制的體積分?jǐn)?shù)為0.75乙醇溶液1 mL，在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min。棄上清，自然干燥沉淀，每孔加入10 μL DEPC水溶解RNA，置56 ℃干燥箱中10 min，于冰上靜置。測定RNA濃度與光密度(OD)值，OD260/OD280在1.8～2.0之間，表示樣品無污染。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。再根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明進行qPCR。結(jié)果以2-△△ct值表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 TNF-α對星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響

不同濃度(0、5、10、20、40、80 μg/L)的TNF-α作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h以后，細(xì)胞活力分別為1.025±0.121、1.019±0.084、1.073±0.180、1.021±0.060、1.051±0.115、0.719±0.112(n=6)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.69，P<0.001)。其中5、10、20、40 μg/L TNF-α處理組細(xì)胞活力與0 μg/L TNF-α處理組相比較無明顯變化(q=0.100～1.248，P>0.05)；80 μg/L TNF-α作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞活力下降明顯，與0 μg/L TNF-α處理組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=7.932，P<0.001)。故本實驗采用10 μg/L濃度的TNF-α進行細(xì)胞處理。

2.2 TNF-α對星形膠質(zhì)細(xì)胞C3 mRNA表達(dá)影響

TNF-α處理組和對照組細(xì)胞內(nèi)C3mRNA表達(dá)水平分別為30.410±17.872和1.003±0.081(n=6)，TNF-α處理組較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.679，P<0.01)。

2.3 TNF-α對星形膠質(zhì)細(xì)胞PTX3表達(dá)影響

TNF-α處理組和對照組細(xì)胞內(nèi)PTX3mRNA表達(dá)水平分別為0.476±0.261和1.010±0.140(n=6)，TNF-α處理組較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.026，P<0.01)。

3 討 論

腦發(fā)生損傷和疾病后，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增多，形成膠質(zhì)瘢痕[6,10]。在對各種神經(jīng)退行性疾病病人的尸檢中，觀察到病灶腦區(qū)存在大量A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞[7]。既往有研究結(jié)果表明，A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞具有殺傷作用，這種神經(jīng)毒性與A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的脂蛋白有關(guān)[7,11]。A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞具有促進神經(jīng)元存活與組織修復(fù)作用，常由缺血誘導(dǎo)，在正常生理條件下，處于靜息狀態(tài)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的表型更接近于A2型[12-13]。

PD是第二常見的神經(jīng)退行性疾病[1]。研究表明，在脂多糖制備的炎癥模型中，小膠質(zhì)細(xì)胞首先被激活，釋放多種細(xì)胞因子，其中TNF-α、白細(xì)胞介素1α和補體成分1q將星形膠質(zhì)細(xì)胞激活為促炎的A1型[7]。在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶制備的PD動物模型中，觀察到中樞神經(jīng)系統(tǒng)處于長期炎癥狀態(tài)[14]。在PD病程中，神經(jīng)炎癥持續(xù)存在，神經(jīng)炎癥導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1型轉(zhuǎn)變，其產(chǎn)生的神經(jīng)毒性可導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡，而黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元缺失是PD的主要病理特征之一。因此，推測神經(jīng)炎癥在PD發(fā)病早期起重要作用。

體內(nèi)環(huán)境中，存在多種細(xì)胞因子同時作用，其作用機制復(fù)雜，無法觀察到某一細(xì)胞因子的具體作用。本實驗以原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞作為實驗對象，用10 μg/L的TNF-α處理，觀察單一細(xì)胞因子對星形膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)的影響。TNF-α在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要由小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌，通過核因子κB引發(fā)細(xì)胞后續(xù)反應(yīng)[15-17]。C3為A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物，其表達(dá)增加提示星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活為促炎狀態(tài)，而PTX3是A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物，其表達(dá)增加提示星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活為抗炎狀態(tài)。本實驗結(jié)果顯示，在TNF-α單獨作用下，原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)C3表達(dá)較對照組明顯升高，而PTX3表達(dá)水平較對照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。提示在TNF-α作用下，星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活為A1型。本研究結(jié)果為細(xì)胞因子在調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)中的作用提供了新的證據(jù)。