阿司匹林對口腔鱗癌細胞增殖與凋亡影響及機制

叢蓓蓓,徐穎婕,高美華,于習習,王萬春,王芳

(青島市口腔醫院,山東 青島 266001 1 中心實驗室； 2 口腔黏膜科； 3 藥劑科)

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)目前是全球第六大常見惡性腫瘤，在癌癥相關死亡率中排名第八[1]。OSCC的發生與發展是一個復雜的過程，包括大量遺傳和表觀遺傳癌基因的積累和抑制基因的丟失，導致多種信號通路失調，從而破壞細胞增殖和細胞凋亡之間的平衡[2]。即使采取了外科手術結合放療和(或)化療的治療方式，OSCC病人的5年生存率也仍保持在50%～60%[3]。雖然臨床和實驗室研究表明，OSCC細胞已經對臨床化療藥物產生了耐藥性[4]，但是，上皮細胞的惡性轉變需要經歷很長的時間，包括多種細胞和基因的改變，故藥物干預是癌癥轉化之前的最佳手段。阿司匹林是一種眾所周知的非甾體抗炎藥，常用于預防反復發作的短暫性腦缺血或卒中[5]。除了其經典的抗炎功能之外，臨床和流行病學研究表明，阿司匹林可用于多種癌癥的預防或治療[6-8]。研究揭示阿司匹林在結直腸癌的化療預防中起重要的作用[9-12]，但仍需對其他的癌癥，包括口腔癌，進行多項低劑量阿司匹林治療的試驗，從而明確其具體的作用機制及最佳化學預防劑量。本研究探討不同濃度的阿司匹林對口腔鱗癌細胞SCC-9生長的影響，并檢測SCC-9細胞凋亡、細胞增殖等指標。旨在為阿司匹林輔助治療OSCC提供實驗依據，增加對口腔鱗癌發病機制的了解。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人鱗癌細胞系SCC-9購自浙江美森細胞科技有限公司。胎牛血清購于依科賽生物科技有限公司(上海，中國)。DMEM培養液購于Hyclone公司(猶他州洛根，美國)。阿司匹林原料藥、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、甲基噻唑基四唑(MTT)細胞增殖和毒性測定試劑盒、β-actin一抗和HRP標記的二抗均購自索萊寶生物有限公司(北京，中國)。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)試劑盒和Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購于碧云天生物有限公司(上海，中國)。Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自艾科瑞生物工程有限公司(長沙，中國)。抗人Bcl-2一抗、Bax一抗均購自圣克魯斯生物技術公司(得克薩斯州達拉斯，美國)。ECL發光試劑購自賽默飛世爾科技公司(馬薩諸塞州沃爾瑟姆，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養及分組 SCC-9細胞使用含體積分數0.10胎牛血清及體積分數0.01青霉素-鏈霉素的DMEM培養液培養。細胞置于37 ℃、體積分數0.05 CO2的恒溫培養箱中，用2.5 g/L的胰蛋白酶(含EDTA)消化細胞，每2～3 d傳代或更換細胞培養液1次。取對數期生長的SCC-9細胞培養過夜，分為A、B、C、D、E、F組，分別加入含不同濃度(0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L)阿司匹林的培養液，用于后續實驗。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖 取對數期生長的SCC-9細胞接種于96孔細胞培養板，每孔5×103個細胞(體系100 μL)。按照1.2.1方法分組處理，每組設置5個復孔，培養24 h后檢測細胞增殖變化。棄去含藥培養液，加入90 μL新鮮培養液及10 μL的MTT后繼續培養4 h；棄去培養液，每孔再加入110 μL的Formazan溶液，在全自動酶標儀上振蕩約10 min，測定490 nm波長處吸光度值。

1.2.3平板克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力取對數期生長的SCC-9細胞接種于6孔細胞培養板，每孔1×103個細胞(體系1 mL)。按照1.2.1方法分組處理，培養48 h后，棄去含藥培養液，更換為正常DMEM培養液。置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的恒溫培養箱繼續培養3周左右。期間觀察、換液，當6孔板內出現肉眼可見克隆時，終止培養。棄上清，PBS工作液浸洗2次，加入40 g/L多聚甲醛溶液固定15 min。去除固定液，加入1 g/L結晶紫室溫染色5 min，流水清洗染色液，干燥，拍照。通過Image J圖像分析軟件計算克隆數。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數期生長的SCC-9細胞接種于12孔細胞培養板，每孔1×105個細胞(體系1 mL)。按照1.2.1方法分組處理，培養24 h后，用胰蛋白酶消化細胞，PBS清洗2次。用195 μL的Annexin V-FITC結合液重懸細胞，加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液避光孵育20 min。使用DxFLEX流式細胞儀進行凋亡率檢測，并分析結果。

1.2.5實時熒光定量PCR方法檢測Bcl-2和BaxmRNA表達 取對數期生長的SCC-9細胞接種于6孔細胞培養板，每孔1×105個細胞。按照1.2.1方法分組處理培養24 h后，加入Trizol試劑提取總RNA，根據反轉錄試劑盒的說明將總RNA反轉錄成cDNA。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，共40個循環。實驗共重復5次。由PCR反應曲線得到域值循環數(Ct)，以GAPDH作為內參照，采用一步法實時熒光定量PCR分析SCC-9細胞中Bcl-2、Bax基因的表達水平。所用引物及其序列見表1。

表1 PCR引物及其序列

1.2.6Western blot法檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達 取對數期生長的SCC-9細胞接種于6孔細胞培養板，每孔1×105個細胞。按照1.2.1方法分組處理培養24 h后提取總蛋白，使用BCA蛋白質測定試劑盒測量蛋白質濃度，置于120 g/L的SDS-PAGE凝膠上電泳，電轉至PVDF膜上，膜在室溫下用50 g/L脫脂牛奶封閉2 h，并在4 ℃下與一抗孵育過夜。TBST沖洗3次后加入HRP標記的二抗室溫振蕩孵育2 h，TBST沖洗，使用ECL試劑和Fluor Chem Q凝膠成像分析系統對印跡的膜進行曝光和分析。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 不同濃度阿司匹林對SCC-9細胞生長影響

與對照組相比較，經低濃度阿司匹林(1.25、2.50 mmol/L)處理的SCC-9細胞生長狀態良好，細胞呈多邊形或是長梭形，細胞邊緣飽滿，偶可見皺縮細胞；5.00 mmol/L阿司匹林處理組與對照組相比，細胞仍可保持原有的形態，但飽滿程度較差，皺縮細胞增多；高濃度阿司匹林(10.00、20.00 mmol/L)處理后，細胞形態發生顯著變化，細胞皺縮變形，細胞間隙明顯變寬。見圖1。

A、B、C、D、E、F組的阿司匹林濃度分別為0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L。

2.2 不同濃度阿司匹林對SCC-9細胞增殖活力的影響

MTT實驗結果顯示，與對照組相比較，1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L阿司匹林對SCC-9細胞增殖抑制作用越來越顯著。阿司匹林濃度達到5.00 mmol/L時，SCC-9增殖受到抑制，與對照組相比差異有統計學意義(F=30.31，P<0.05)；高濃度阿司匹林(10.00、20.00 mmol/L)顯著影響SCC-9細胞的增殖，與對照組相比差異具有顯著性(P<0.001)。見圖2。

2.3 不同濃度阿司匹林對SCC-9細胞克隆能力的影響

平板克隆形成實驗顯示，接種貼壁細胞成活并形成克隆的數量，直接反映細胞群體的依賴性及增殖能力。與對照組相比，隨著阿司匹林濃度的升高，SCC-9細胞克隆數逐漸降低。5.00、10.00 mmol/L阿司匹林處理SCC-9細胞時，克隆形成率下降，差異具有統計學意義(F=59.68，P<0.05)；當阿司匹林達到20.00 mmol/L時顯著影響SCC-9細胞的增殖，差異具有顯著性(P<0.001)。見圖3。

A、B、C、D、E、F組的阿司匹林濃度分別為0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L。與對照組比較,*P<0.05,***P<0.001。

2.4 不同濃度阿司匹林對SCC-9細胞凋亡影響

流式細胞術檢測的結果顯示，與對照組相比較，不同濃度阿司匹林作用SCC-9細胞后凋亡均有增加，而且與阿司匹林濃度增加程度呈正比。當阿司匹林濃度為2.50、5.00 mmol/L時細胞凋亡數即有所增加，差異有統計學意義(F=816.00，P<0.05)；當阿司匹林的濃度達到10.00、20.00 mmol/L后細胞凋亡數明顯增加，差異具有顯著性(P<0.001)。見圖4。

2.5 不同濃度阿司匹林對SCC-9細胞Bcl-2和Bax基因及其蛋白表達影響

實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測結果顯示，與對照組相比，Bcl-2基因和蛋白表達水平隨阿司匹林濃度升高而降低，Bax反之。與對照組相比，當阿司匹林濃度為2.50 mmol/L時Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平有所降低，差異具有統計學意義(F=215.90、9 473.00，P<0.05)；當濃度達到5.00、10.00、20.00 mmol/L時其表達水平明顯降低，差異均具有顯著意義(P<0.001)；阿司匹林濃度為5.00、10.00、20.00 mmol/L時BaxmRNA和蛋白表達水平與對照組相比明顯升高，差異具有統計學意義(F=1 388.00、4 345.00，P<0.001)。見表2和圖5。

3 討 論

口腔頜面部腫瘤是一種常見的惡性腫瘤，伴隨著腫瘤多藥耐藥這一難題的出現，全球口腔癌生存率并沒有明顯改善，因此開發新型、高效、低毒的抗口腔頜面部腫瘤藥物迫在眉睫[2]。阿司匹林(乙酰水楊酸)是最古老的合成藥物，作為產生前列腺素和血栓素前體的COX(前列腺素內過氧化物合酶)酶的不可逆抑制劑，逐漸發現了阿司匹林除抗炎藥的其他幾種應用。阿司匹林作為一種癌癥化學預防劑和癌癥標志物的主要調節劑，其攝入可用于降低結直腸癌發生的風險[13]，也可以抑制腫瘤細胞本身的生物活性，并干擾支持腫瘤生長的微環境[14]。研究表明，阿司匹林在預防癌癥，特別是在結直腸癌方面具有強大的潛力[9,12]。本文以口腔鱗癌SCC-9細胞為研究對象，初步探索阿司匹林對人口腔頜面部惡性腫瘤的抑制作用。

A、B、C、D、E、F組的阿司匹林濃度分別為0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L。與對照組比較,*P<0.05,***P<0.001。

A、B、C、D、E、F組的阿司匹林濃度分別為0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L。與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

表2 不同濃度阿司匹林對SCC-9細胞Bcl-2和Bax mRNA及其蛋白表達影響

A、B、C、D、E、F組的阿司匹林濃度分別為0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L。

本文研究結果顯示，在低濃度阿司匹林(1.25、2.50 mmol/L)下SCC-9細胞生長狀態良好，細胞飽滿；濃度達到5.00 mmol/L后，隨濃度上升，細胞形態改變，胞膜皺縮，細胞間隙變寬。MTT及克隆形成實驗結果顯示，當阿司匹林濃度高于5.00 mmol/L時，明顯抑制SCC-9細胞的增殖活力。可見，阿司匹林對SCC-9細胞抑制增殖的作用呈濃度依賴性。大量研究結果表明，阿司匹林可降低結直腸、食管、乳房、肺臟等器官的患癌風險[13-15]，但長期服用阿司匹林可以加重病人胃腸道潰瘍及出血的風險。因此，尋找阿司匹林最佳的化學預防劑量至關重要。2.50 mmol/L阿司匹林可抑制乳癌SKBR3細胞的遷移和侵襲能力[16]；5.00 mmol/L阿司匹林即可引起宮頸癌Hela細胞基因組DNA變化[17]。本研究中，阿司匹林達到5.00 mmol/L以上對OSCC細胞出現明顯的抑瘤作用。

目前阿司匹林的抗腫瘤機制尚不明確，可能與其通過抑制COX-2酶的活性發揮抑瘤作用有關。在腫瘤發生過程中，COX-2被誘導并進一步增加PGE2的產生，破壞細胞正常的凋亡過程，最終導致腫瘤細胞增殖失調[18]。已有研究表明，阿司匹林可能通過蛋白磷酸酶2A(PP2A)失活減少β-連環蛋白的細胞質池而降低結腸癌病人的發病率[19]；通過抑制NF-κB通路抑制骨肉瘤的生長和轉移，并增加骨肉瘤對體外和體內化療的敏感性；通過調節多種細胞因子的活性和表達，包括半胱天冬酶、Bcl-2、Bax和VEGF等，抑制人骨髓瘤細胞增殖并誘導其凋亡；通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK1)介導的腫瘤干細胞(CSC)調節機制為侵襲性乳癌提供潛在的治療機會[20-22]。本研究結果表明，阿司匹林可以促進SCC-9細胞的凋亡，且促進凋亡作用與藥物濃度呈正相關。Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡與存活的一個重要控制器。本研究結果顯示，阿司匹林各濃度組中促凋亡蛋白Bax在轉錄水平和蛋白水平上顯著上升，而抑凋亡蛋白Bcl-2則相反。因此，我們認為阿司匹林可能通過誘導細胞凋亡調控口腔鱗癌細胞SCC-9增殖，并且藥物濃度越高其作用越強。

綜上所述，該研究主要驗證了阿司匹林在口腔鱗癌細胞的抗腫瘤作用，為阿司匹林的抗腫瘤作用提供了一定的基礎實驗證據。但本研究仍存在不足之處，在口腔鱗癌細胞中阿司匹林通過何種信號通路調控細胞的增殖與凋亡尚缺乏實驗證據，因此，后續將進一步探討其抑制口腔鱗癌細胞的分子調控機制，為口腔鱗癌化學治療提供新的依據與策略。