熱堿法提取制革污泥蛋白質及表征

顧海洋，翟世民，王冬，張麗平，付少海,3

(1.江蘇省紡織品數字噴墨印花工程技術研究中心，江蘇 無錫 214122；2.生態紡織教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫 214122；3.國家先進印染技術創新中心，山東 泰安 271001)

我國作為皮革生產大國，每年皮革產量占全球總產量的23%[1]，每年制革污泥的產量已超過100萬 t， 且每年以10%的速度增長[2-4]。制革污泥含有豐富的蛋白質，含量約為20%～40%，對其提取和利用是制革污泥資源化的重要途徑之一[5-9]。污泥蛋白質的提取主要有物理法[10-11]、化學法[12-13]、生物法[14-15]和聯合處理法[16-18]。本文采用熱堿法處理制革污泥，獲得蛋白質水解液，通過酸化的方式提取制革污泥蛋白質，并分析其基本性質和安全性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

制革污泥，河北齊盛皮革有限公司提供，污泥基本性質見表1；氫氧化鈉、硫酸、硫酸銨、二苯氨基脲均為分析純；福林酚，生物級試劑。

表1 制革污泥的基本性質

KH-200水熱反應釜；ST3100 pH儀；PMK1602ZH電子天平；L550離心機；DZF-6050真空干燥箱。

1.2 實驗方法

制革污泥在運輸前經過壓濾脫水處理，為了模擬制革污泥脫水前的狀態，將制革污泥的含水率調至95%。

1.2.1 制革污泥蛋白質水解液的制備 取100 mL污泥于水熱反應釜中，NaOH加入量為9 g/L，充分攪拌，150 ℃加熱60 min。待冷卻后，測定蛋白質水解液中蛋白質的含量。

1.2.2 制革污泥蛋白的提取 取一定量的污泥蛋白質水解液，用硫酸銨調節pH至7左右，然后加入1.5%(水解液質量)的硅藻土作為吸附劑[19]，在30 ℃下處理2 h。完成吸附后，用1 mol/L H2SO4調節水解液pH至4，在室溫下靜止1 h，離心、烘干獲得污泥蛋白粉末。計算蛋白質提取率(R)。

(1)

式中,Mh為熱堿處理后上清液中蛋白質的含量；Ms為制革污泥中蛋白質的含量。

1.3 分析方法

1.3.1 制革污泥蛋白質的含量分析 采用福林酚法測定污泥上清液蛋白質的含量。

1.3.2 制革污泥蛋白質的純度分析 采用凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2003)測定污泥中蛋白質的含量和污泥蛋白粉末的純度，蛋白質含量計算公式(蛋白質轉化系數為6.25)：

蛋白質含量=氮元素重量比(%)×6.25

(2)

1.3.3 制革污泥蛋白質的元素分析 用有機元素分析儀測量制革污泥蛋白質中C、H、O、N元素含量，采用X射線能譜儀(EDS)測量制革污泥蛋白質中其他元素的含量。

1.3.4 制革污泥蛋白質的Cr元素分析 采用IPC-MS測量制革污泥蛋白質中Cr元素的含量；采用二苯碳酰二肼分光光度法(GB/T 1555.4—1995)測量制革污泥蛋白質中Cr6+的含量。

1.3.5 制革污泥蛋白質的氨基酸分析 采用氨基酸高效液相色譜儀測量制革污泥蛋白質中氨基酸的含量。

1.3.6 制革污泥蛋白質的分子量分析 采用SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)測量制革污泥蛋白質的分子量分布。

2 結果與討論

2.1 NaOH用量對制革污泥蛋白質提取率的影響

圖1為NaOH用量對蛋白質提取率的影響。

圖1 NaOH用量對蛋白質提取率的影響Fig.1 The influence of NaOH dosage on protein extraction rate

由圖1可知，蛋白質的提取率隨著NaOH用量的增加而增大，NaOH用量為9 g/L時，提取率達到最大值71.2%，NaOH用量超過9 g/L，提取率下降。

2.2 處理時間對制革污泥蛋白質提取率的影響

圖2為處理時間對蛋白質提取率的影響。

圖2 處理時間對蛋白質提取率的影響Fig.2 The influence of treatment time on protein extraction rate

由圖2可知，蛋白質的提取率隨著處理時間的延長而增大，處理時間為60 min時，提取率達到最大值70.5%。當處理時間超過60 min時，蛋白質的提取率隨之下降。

2.3 處理溫度對制革污泥蛋白質提取率的影響

圖3為處理溫度對蛋白質提取率的影響。

圖3 處理溫度對蛋白質提取率的影響Fig.3 The influence of temperature on protein extraction rate

由圖3可知，蛋白質的提取率隨著提取溫度的增加而增大，提取溫度為150 ℃時，提取率達到最大值71.9%。處理溫度過150 ℃時，蛋白質的提取率隨之降低。

污泥蛋白質在提取工藝中，存在蛋白質析出溶解和蛋白質分解兩種過程[20]。制革污泥中蛋白質主要來源于微生物細胞和皮屑廢棄物。在熱堿的作用下，污泥微生物細胞破裂，釋放蛋白質；皮屑廢棄物在堿性環境中降解成蛋白質，液相中的蛋白質濃度增加，此時蛋白質的析出過程占主導。隨著NaOH用量、溫度、處理時間的增加，在堿性環境下，蛋白質逐漸水解成氨基酸，最終分解成氨氮，此時蛋白質的分解過程占主導，導致蛋白質的提取率下降。因此，NaOH用量、溫度、處理時間的增加導致蛋白質提取率先增大后減小。

2.4 響應面實驗

根據單因素實驗得出的數據，采用Design-Expert 10軟件設計響應面實驗，分別以處理溫度、處理時間、NaOH用量為自變量，以蛋白質提取率為響應值，設計3因素3水平的響應面實驗。因素水平見表2，結果見表3。

表2 響應面分析因素及水平

表3 響應面實驗結果

蛋白質提取率的回歸線性方程為：

蛋白質提取率(%)=-306.99-3.37A+1.84B+16.41C+7.78×10-4AB+2.78×10-4AC-8.33×10-4BC-0.011A2-0.016B2-0.906C2,方差分析見表4。

表4 方差分析結果

由表4可知，模型P值為0.000 2(<0.01)，極為顯著；失擬項P值為0.332 3(>0.05)，不顯著。說明模型的精確度較高，可以反映各因素對蛋白質提取率的影響關系。圖4為響應面3D圖。

由圖4可知，交互因素中對污泥蛋白提取的影響順序為：溫度×時間>時間×NaOH>溫度×NaOH，與方差分析的結果保持一致。

圖4 響應面3D圖Fig.4 Response surface 3D diagram

根據響應面實驗得到蛋白質提取率的二次回歸方程，計算預測值和實際值之間的歸一化偏差(ND)和歸一化標準差(NSD)[21]。

(3)

(4)

式中PR(exp)——實際的蛋白質提取率，%；

PR(pre)——預測的蛋白質提取率，%；

n——實驗的次數。

根據模型的預測，污泥蛋白最佳的提取條件：溫度148.3 ℃，時間60.3 min，NaOH用量為9.1 g/L，污泥蛋白提取率為72.6%。預測值與單因素實驗得出的結果較為接近。蛋白質提取率預測值與實際值的歸一化偏差和歸一化標準差分別3.8%和1.5%，均低于10%，說明模型準確性較高。

2.5 制革污泥蛋白質分析

將熱堿處理后得到的蛋白質水解液pH調節至4，室溫靜止1 h后得到制革污泥蛋白。

2.5.1 元素分析 制革污泥蛋白為白色粉末狀，粗蛋白含量為83.1%，灰分占6.2%，總Cr含量為1.5 mg/kg， 其中Cr6+含量低于檢出限，制革污泥蛋白的鉻含量符合國家安全標準。表5為制革污泥蛋白的元素組成。

表5 污泥蛋白元素組成

由表5可知，制革污泥蛋白含有Na、Cl、Ca元素表明蛋白質含少量的無機鹽。制革污泥蛋白具有較高的純度，且無機鹽的含量較少。圖5為制革污泥蛋白的SEM圖。

圖5 污泥蛋白質在不同倍數下的SEM圖片Fig.5 SEM images of sludge protein under different magnificationsa.5 000倍;b.10 000倍

由圖5可知，制革污泥蛋白質顆粒較小，顆粒呈不規則的形狀。

2.5.2 紅外分析 污泥蛋白紅外圖譜見圖6。

圖6 制革污泥蛋白FTIR圖Fig.6 FTIR image of tannery sludge protein

2.5.3 氨基酸分析 將污泥蛋白在6 mol/L HCl溶液120 ℃水解22 h，分析制革污泥蛋白氨基酸含量，制革污泥蛋白氨基酸組成見表6。

表6 制革污泥蛋白氨基酸組成

由表6可知，污泥蛋白包含常見的14種氨基酸，氨基酸占制革污泥蛋白總量的31.9%，氨基酸含量較高。其中甘氨酸的含量最高為8.59/100， 其次是谷氨酸為3.8/100。

2.5.4 蛋白質分子量分析 溫度對蛋白質提取率影響較強，因此分析堿處理溫度對蛋白質分子量的影響,結果見圖7。

圖7 制革污泥蛋白分子量分布Fig.7 Molecular weight distribution of tannery sludge protein

由圖7可知，堿處理溫度為100 ℃時，污泥蛋白質分子量分布為5～170 kDa，提取溫度為150 ℃時，污泥蛋白質分子量分布為5～35 kDa，提取溫度為200 ℃時，污泥蛋白質分子量為5～22 kDa。隨著提取溫度的提升，蛋白質的分子量分布逐漸減小。在堿性環境下，溫度提高，加速了蛋白質的水解，大分子蛋白質水解成小分子蛋白質。

3 結論

熱堿法提取制革污泥蛋白質的最佳條件：溫度150 ℃，時間60 min，NaOH用量為9 g/L，蛋白質的提取率為71.2%。純度為83.01%，氨基酸含量占31.07%，無機鹽含量保持在較低的水平。總Cr含量為1.5 mg/kg，其中Cr6+含量低于檢出限，符合國家安全標準(GB 13078—2001)，具有較高的使用價值。