非受體酪氨酸激酶抑制劑CYT387 對多發性骨髓瘤細胞增殖、凋亡影響及作用機制

石 磊， 王宇彤， 褚 彬， 丁 寧

1. 北京積水潭醫院 血液科，北京100096；2. 北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所淋巴腫瘤科惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京100142

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是漿細胞異常增殖的惡性腫瘤，以老年發病較為常見。 白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)介導的非受體酪氨酸激酶/信號轉導及轉錄激活因子(janus kinase/signal transducer and activator of tranions， JAK/STAT)信號在腫瘤漿細胞的發育、生長、抗凋亡以及耐藥發生中具有重要意義[1]。 IL-6/JAK/STAT通路在包括MM 在內的多種惡性腫瘤發病機制中起到核心作用[2]。 MM 中的IL-6 主要由骨髓基質細胞與巨噬細胞分泌產生[3]。 基質細胞和骨髓瘤細胞之間通過相互作用，使微環境中IL-6 含量增加[4-5]。 自分泌或旁分泌的IL-6 可與細胞膜表面的異二聚體IL-6 受體gp80 及gp130 結合，形成具有生物活性的六聚體三元復合體，并誘導下游JAK 激酶發生磷酸化，從而激活下游STATs、絲裂原活化蛋白激酶、 磷脂酰肌醇-3 激酶等信號通路[6-7]。STAT3 作為一種重要的轉錄因子，參與調控細胞增殖、轉移等多種靶基因表達，抑制MM 中IL-6 信號，可上調腫瘤細胞對于對硼替佐米治療的敏感性[8-9]。 CYT387 為一種高效的JAK 抑制劑。 目前，JAK 抑制劑在MM 中的潛在治療作用研究較少。本研究旨在探討JAK 抑制劑CYT387 對MM 細胞增殖、凋亡的影響及其調控IL-6/JAK/STAT 信號通路的作用機制。 現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系及患者樣本獲取 MM 細胞株XG-7、U266、RPMI-8266、LP-1 均購自美國ATCC 細胞庫及德國DSMZ 細胞庫。 所有細胞培養條件為IMDM培養基或DMEM 培養基＋10%胎牛血清，培養基內需添加谷氨酰胺與青霉素—鏈霉素。 所有細胞均通過短串聯重復序列鑒定。 選取北京積水潭醫院自2012 年3 月至2015 年3 月收治的26 例MM 患者為研究對象。 對所有患者的的骨髓、髓外腫物等組織進行免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)檢測。 同時選取外周血存在漿細胞的患者中IHC 檢 測 磷 酸 化JAK2 (phosphorylated-JAK2， p-JAK2)陰性患者1 例及p-JAK2 陽性患者2 例的外周血標本進行細胞活力測定檢驗。 采用密度梯度離心分離法采集患者外周血單個核細胞，并利用CD38 分離磁珠對腫瘤細胞進行分選。 本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 細胞活力與凋亡檢測 對4 個MM 細胞株(XG-7、U266、RPMI-8266、LP-1) 與1 例p-JAK2陰性、2 例p-JAK2 陽性MM 患者的原代腫瘤細胞，分別應用0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 和20.00 μmol/L 的CYT387 和對照藥物二甲基亞砜(DMSO)進行處理。 孵育72 h 后，采用CellTiter-Glo細胞活力檢測試劑盒進行細胞活力檢測。 每個濃度組檢測3 次，以CYT387/DMSO 平均值計算細胞活力。 CellTiter-Glo 細胞活力檢測試劑盒購自Promega 公司，Annexin-V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自BD 公司。 所有操作流程均按照說明書嚴格執行。

1.3 蛋白免疫印跡檢測 對4 個MM 細胞株(XG-7、 U266、 RPMI-8266、 LP-1) 的 Total-JAK2、p-JAK2進行蛋白免疫印跡檢測。 對XG-7 細胞株使用不同濃度CYT387(0、1、2、5、10 μmol/L)處理10 min后，加用1 mg/L 的IL-6 刺激，并用蛋白免疫印跡法檢測加用及不加用IL-6 的p-STAT3 水平。分別以5 μmol/L CYT387 對LP-1 細胞株處理12、24、48 h。 采用蛋白免疫印跡檢測細胞提取物中半胱氨酸蛋白酶3(cysteine aspartic acid specific protease-3，caspase-3)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)、B 細胞淋巴瘤-特大型(B-cell lymphoma-extra large，BCL-xL)、B 細胞淋巴瘤/白血病2(B-cell lymphoma/leukemia 2，BCL2)水平。 蛋白免疫印跡檢測: 將等量的蛋白質(10 μg)上樣，恒定電壓80 V，跑膠180 min，直到蛋白至預制膠的底部。 聚偏二氟乙烯轉膜后，加入適當的一抗、二抗進行孵育，最后在化學發光系統上進行檢測。 使用Image J 軟件對結果進行定量和分析。

1.4 IHC 檢測 對26 例MM 患者的骨髓組織進行IHC 檢測。 利用磷酸化STAT3 (phosphorylated-STAT3，p-STAT3)和p-JAK2 抗體對福爾馬林固定的石蠟包埋切片進行免疫組化實驗。 石蠟切片經高壓抗原修復、血清封閉、抗體孵育、DAB 顯色等步驟后，由2 位病理科醫師對每例樣本染色進行評分，包括染色強度與陽性百分比。

1.5 統計學方法 采用SPSS 21.0 統計學軟件對數據進行處理。 計量資料用均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t 檢驗。 以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 JAK2 在MM 腫瘤組織與MM 細胞系中表達 26 例MM 腫瘤組織中，13 例(50%)呈p-JAK2陽性表達。 蛋白免疫印跡檢測結果顯示，在XG-7、U266、RPMI-8226、LP-1 細 胞 株 中Total-JAK2、p-JAK2 表達均呈陽性。 見圖1。

2.2 CYT387 對IL-6/JAK/STAT 信號通路STAT3活化的影響 與對照組(0 μmol/L)比較，隨著CYT387 濃度增加，p-STAT3 的表達顯著降低，且呈濃度依賴性(P ＜0.05)。 外源IL-6 的刺激可整體提高p-STAT3 的表達，但并不能改變CTY387 呈濃度依賴性顯著降低p-STAT3 表達的趨勢(P ＜0.05)。 見圖2。

圖1 JAK2 在MM 腫瘤組織與MM 細胞株中表達(a.MM 腫瘤組織中p-JAK2 陽性表達；b.MM 腫瘤組織中p-JAK2 陰性表達；c.4 種MM 細胞株中Total-JAK2、p-JAK2 表達情況)

圖2 CYT387 對IL-6/JAK/STAT 信號通路STAT3 活化的影響(a. 蛋白免疫印跡法；b. 灰度分析)

2.3 CYT387 對MM 細胞增殖活性影響 隨著CYT387 濃度增加，XG-7、U266、RPMI-8266 和LP-1細胞活力降低，且呈濃度依賴性(P ＜0.05，圖3a)。蛋白免疫印跡檢測結果顯示，MM 原代腫瘤細胞的JAK2 的磷酸化情況與IHC 檢測結果一致(圖3b)。隨著CYT387 濃度增加，3 例MM 原代腫瘤細胞活力降低，且呈濃度依賴性，而p-JAK2 陽性的2 例MM 原代腫瘤細胞活力降低更為顯著(P ＜0.05，圖3c)。 見表1、表2、圖3。

2. 4 CYT387調控凋亡通路相關蛋白的表達 蛋白免疫印跡結果顯示，采用5μmol/L 的CYT387 處理LP-1 細胞株12、24、48 h，其凋亡通路相關蛋白caspase-3 表達處于高水平，而BCL-xl、BCL-2、PARP表達水平逐漸下降，CYT387 對凋亡通路蛋白的調節作用具有時間依賴性(P ＜0.05)。 見圖4。

表1 不同濃度CYT387 處理后MM 細胞株細胞活力檢測結果(ˉx±s)

表2 不同濃度CYT387 處理后3 例MM 患者原代腫瘤細胞活力檢測結果(ˉx±s)

圖3 不同濃度CYT387 處理細胞株與MM 原代腫瘤細胞的細胞活力檢測(a.MM 細胞株；b. 蛋白免疫印跡法檢測結果；c. 原代腫瘤細胞)

3 討論

近年來，雖然以蛋白酶體抑制劑和免疫調節劑為代表的新靶向治療藥物及自體造血干細胞移植能明顯提高MM 患者的緩解率，但是MM 仍不可治愈，絕大多數患者終將復發[10]。 復發后患者生存期逐步縮短，最終會因為病情復發、耐藥和/或進展而死亡，因此迫切需要嘗試新的藥物進行挽救性治療以延長生存期。

IL-6/JAK/STAT 信號通路在MM 的腫瘤發病機制中起到重要作用。 STAT3 是STATs 家族成員，是一種重要的DNA 結合轉錄因子，IL-6/JAK 信號通路被激活后，STAT3 可以調控大量下游靶基因的表達。 IL-6 促進肝再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3)的STAT3 依賴性轉錄上調，而高PRL-3 重新磷酸化STAT3 并異常過度激活STAT3 靶 基 因[2]。 JAKs 家 族 蛋 白 包 括JAK1、JAK2、JAK3 和TYK2[6]。 本研究中，約50% MM 患者原代腫瘤細胞及全部4 株MM 細胞株的JAK2 磷酸化陽性，呈現激活狀態，且在MM 患者原代腫瘤細胞中證實了蛋白免疫印跡和IHC 方法的一致性， 為JAK 抑制劑靶向治療MM 提供了理論基礎。

圖4 CYT387 調控凋亡通路相關蛋白的表達(a. 蛋白免疫印跡法；b. 灰度分析結果)

蘆可替尼作為首個應用于臨床的JAK 抑制劑，能增強達雷妥尤單抗介導的MM 細胞株和患者CD138 ＋原代MM 細胞的抗體依賴性細胞毒性[11]。同時，蘆可替尼與硼替佐米、來那度胺、地塞米松聯合，可抑制MM 細胞株的增殖并誘導細胞周期停滯[12]。 蘆可替尼治療同時患有骨髓增殖性腫瘤和冒煙型骨髓瘤的散發病例時，其骨髓瘤血液指標也有所改善[13]，表明其具有抗MM 作用。 其他JAK抑制劑，如INCB20、INCB16562、AZD1480，均在異種移植小鼠模型中展現了良好的抗腫瘤活性[14-16]，但相關研究較少。 CYT387 作為一種新型的JAK 抑制劑，其對MM 細胞的作用罕有報道。

本研究結果顯示，隨著CYT387 濃度增加，所有4 個MM 細胞株及原代MM 細胞的細胞活力呈濃度依賴性降低，尤其是p-JAK2 陽性的原代MM 細胞降低更為明顯，這表明CYT387 對JAK2 被激活的MM 細胞增殖存在明顯抑制作用。 本研究結果還顯示，隨著CYT387 濃度增加，MM 細胞株中p-STAT3的表達呈濃度依賴性顯著降低。 提示CYT387 可抑制JAK 下游STAT3 的激活。 這表明，CYT387 可通過抑制IL6/JAK/STAT 信號通路的激活導致MM 細胞增殖受抑。 而外源IL-6 的刺激雖然可以整體提高p-STAT3 的表達，但并不能改變CTY387 濃度依賴性抑制STAT3 磷酸化的趨勢。 有研究報道，另一種JAK2 抑制劑AG490 可通過抑制JAK2 激酶活性和STAT3 磷酸化，抑制骨髓瘤細胞株的細胞增殖活性[17]，與本研究結果類似。

JAK/STAT 調控的下游信號中細胞凋亡靶點BCL2 家族蛋白的一部分，如BCL2、BCL-xL 等可阻止細胞凋亡。 caspase-3 和其最主要剪切底物PARP，在細胞凋亡中亦起到重要作用。 PARP 在被caspase-3 剪切后失去其酶活力，致使核酸內切酶活性增高，裂解小體間DNA，導致細胞凋亡。 本研究發現，CYT387 呈時間依賴性降低BCL2、BCL-xL、PARP 的表達，并誘導凋亡相關蛋白caspase-3 高表達。 這提示，CYT387 可誘導腫瘤細胞內凋亡相關通路激活，導致MM 細胞凋亡。 Alas 等[18]研究顯示，有JAK1 抑制作用的Piceatannol 與JAK2 抑制劑AG490 也被證明可降低BCL2 和BCL-xL 的表達，致使MM 細胞株對化療藥物誘導的凋亡更加敏感。

綜上所述，CYT387 可通過阻斷MM 細胞內IL-6/JAK/STAT 信號通路，抑制腫瘤增殖，同時可引發凋亡相關蛋白活化，并抑制組織凋亡的相關蛋白活性，從而誘導MM 細胞凋亡，有望為MM 的治療開辟新方向。