乳腺原發癌和淋巴結轉移癌中TGF-β1和p53的間質表達及臨床意義

張會芳，宋婷婷，安 杰，楊 月，韓玉貞

腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)由腫瘤細胞和間質細胞及基質等構成，在腫瘤的浸潤和轉移中發揮重要作用。腫瘤細胞激活形成的癌相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts, CAF)是乳腺癌組織中的主要間質細胞，可分泌多種細胞因子促進乳腺癌的浸潤和轉移。許多研究表明，乳腺癌細胞中TGF-β1和p53的表達與乳腺癌預后有相關性[1-2]。目前，兩者在乳腺癌間質中的表達研究較少，且有關TGF-β1和p53在乳腺原發癌和淋巴結轉移癌間質中的相關性國內外尚未見報道。因此，本文著重探討乳腺原發癌和淋巴結轉移癌間質中TGF-β1和p53的表達及預后價值，以提高臨床與病理醫師的認識水平。

1 材料與方法

1.1 材料收集2011年1月～2016年12月濱州醫學院附屬醫院病理科有淋巴結轉移的非特殊型浸潤性乳腺癌160例，其有完整的隨訪資料，包括患者年齡、腫塊直徑、組織學分級、轉移淋巴結個數、ER、PR、HER-2、Ki-67的表達。患者均為女性，術前均未接受新輔助治療。隨訪截至2020年6月或患者死亡，中位隨訪時間為58個月。

1.2 方法采用免疫組化EnVision法染色。TGF-β1抗體購于博奧森公司，p53抗體和二抗購于北京中杉金橋公司。標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，將切片置于64 ℃烤箱中烘烤1 h，脫蠟至水，高溫高壓法修復抗原后晾涼，3%H2O2去除內源性過氧化物酶，加入一抗TGF-β1(稀釋比1 ∶200)及p53(稀釋比1 ∶200)抗體4 ℃過夜，放置37 ℃恒溫箱中復溫30 min，PBS水洗后加二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，1%鹽酸乙醇分化，脫水透明，中性樹膠封固。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。

1.3 結果判斷腫瘤間質的評判范圍參考文獻報道[3-4]等的標準，原發癌中評判為浸潤性癌區域的腫瘤間質，淋巴結轉移癌中選取被腫瘤細胞和腫瘤間質侵占區域的腫瘤間質，且選取視野四周均有腫瘤細胞浸潤的區域。隨機觀察10個高倍視野，計數間質陽性細胞的平均值。根據陽性細胞著色強度和陽性細胞百分比進行判斷：(1)根據陽性細胞著色強度評分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；(2)陽性細胞百分比評分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項得分結果相加：0～3分為陰性，4～7分為陽性。

1.4 統計學分析采用SPSS 25.0軟件對數據進行統計學分析，組間比較采用χ2檢驗。采用列聯系數法計算相關性；應用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并結合Log-rank檢驗進行生存過程的比較。采用Cox比例風險回歸模型進行單因素和多因素分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺原發癌和淋巴結轉移癌間質中TGF-β1和p53的表達TGF-β1在間質CAF中的表達定位于細胞質(圖1A、B)，p53在間質CAF中的表達定位于細胞核(圖1C、D)。TGF-β1和p53在乳腺原發癌和淋巴結轉移癌間質中，表達的一致率均為87.5%。在乳腺原發癌和淋巴結轉移癌之間，間質中TGF-β1的表達呈正相關(r=0.603，P<0.001，表1)，間質中p53的表達也呈正相關(r=0.604，P<0.001，表2)。

圖1 A.TGF-β1在原發癌間質中呈陽性，EnVision法；B.TGF-β1在淋巴結轉移癌間質中呈陽性，EnVision法；C.p53在原發癌間質中呈陽性，EnVision法；D.p53在淋巴結轉移癌間質中呈陽性，EnVision法

表1 乳腺原發癌和淋巴結轉移癌間質中TGF-β1的表達

表2 乳腺原發癌和淋巴結轉移癌間質中p53的表達

2.2 乳腺癌患者預后的Cox單因素與多因素分析Cox單因素分析結果顯示：腫塊直徑(P=0.002)、轉移淋巴結個數(P<0.001)、ER、PR、HER-2的表達(P均<0.05)、原發癌和轉移癌間質中p53的表達(P均<0.05)，均是患者預后的危險因素。Cox多因素分析結果顯示：轉移淋巴結個數(HR=3.267，95%CI：1.870～5.707)、HER-2的表達(HR=1.938，95%CI：1.161～3.233)、原發癌間質中p53的表達(HR=4.118，95%CI：1.504～11.273)，均是患者預后的獨立危險因素(P均<0.05，表3)。

2.3 TGF-β1和p53的間質表達及預后分析Kaplan-Meier生存曲線結合Log-rank檢驗顯示：在乳腺原發癌和相應淋巴結轉移癌間質中，TGF-β1的表達與預后無關(P均>0.05，圖2A、B)；p53陽性患者的生存率低于陰性患者，差異有統計學意義(P均<0.05，圖2C、D)。在乳腺原發癌和相應淋巴結轉移癌間質中，TGF-β1陽性和p53陰性組患者的預后好于TGF-β1和p53均陽性組，差異有統計學意義(P均<0.05，表4，圖2E、F)。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，TME在乳腺癌的侵襲和轉移中發揮重要作用。TME是指腫瘤存在的微環境，包括周圍的免疫細胞、血管、細胞外基質、成纖維細胞、淋巴細胞、骨髓衍生的炎癥細胞和信號分子等，具有營養支持、免疫逃避、促進轉移等作用。CAF是TME的重要組成部分，具有多種功能，包括基質沉積和重塑以及與癌細胞的廣泛相互信號作用。

TGF-β1在腫瘤發生、發展過程中，由最初的抑癌作用逐漸發展為促癌作用。在多數乳腺癌和其轉移灶中，TGF-β1從抑癌作用到促癌作用的轉化均與磷酸化的Smad2呈正相關，Smad通路是TGF-β1信號通路中的重要途徑。癌細胞分泌的TGF-β1有助于CAF的激活和增殖[5]，其在間質中的表達與CAF呈正相關[6]。在乳腺癌中CAF也可分泌TGF-β1，并激活乳腺癌細胞中的TGF-β1/Smad信號通路，誘導上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)促進乳腺癌細胞的侵襲性表型[7]，而抑制TGF-β1信號傳導可以減少CAF誘導的腫瘤生長和轉移[8]，TGF-β1可以維持CAF活性狀態，也是CAF促進乳腺癌惡化所必需的[9]。此外，對前列腺癌[10-11]、結直腸癌[12]、胃癌[13]等相關性研究中發現CAF中TGF-β1信號的激活與腫瘤細胞的侵襲和轉移也密切相關。也有研究表明，腫瘤細胞中高表達TGF-β1和TGF-βⅡ型受體的乳腺癌患者有更長的無瘤生存期和總生存期[14]，也有研究發現血液中TGF-β1含量升高的乳腺癌患者有更好的預后和更少的遠處轉移[15]。另有研究發現，CAF中TGF-β1的表達在乳腺原發癌和淋巴結轉移癌中具有較好的相關性[16]。本實驗結果顯示：TGF-β1在乳腺原發癌及相應淋巴結轉移癌間質中的表達呈正相關，但無論是乳腺原發癌還是淋巴結轉移癌，均未顯示間質中TGF-β1的表達與不良預后相關。因此，有關TGF-β1的表達，尤其間質中TGF-β1的表達與乳腺癌預后的關系有待進一步分析。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析乳腺癌患者的預后：乳腺原發癌(A)和淋巴結轉移癌(B)間質中TGF-β1的表達與生存期的關系；乳腺原發癌(C)和淋巴結轉移癌(D)間質中p53的表達與生存期的關系；乳腺原發癌(E)和淋巴結轉移癌(F)間質中TGF-β1和p53的不同表達與生存期的關系

人類腫瘤50%以上有p53基因的突變，有研究表明p53的高表達與食管鱗狀細胞癌[17]和肝細胞癌[18]的預后不良相關。文獻報道p53的高表達是乳腺癌預后差的重要因素[19]。乳腺癌間質中也存在p53的表達，且與乳腺癌淋巴結轉移及預后有關[20-21]。本實驗結果顯示：在乳腺原發癌和淋巴結轉移癌之間，間質p53的表達呈正相關，且無論原發癌還是淋巴結轉移癌，p53的間質表達均與預后不良相關，原發癌間質p53的表達是判斷預后的獨立危險因素。

許多研究表明，乳腺癌發生轉移后，轉移癌細胞仍保留原發癌細胞產生某些基因、蛋白的特性，如ER、HER-2等表現為高度的一致性[22]。一般認為，原發癌中的CAF是正常纖維母細胞增生活化而來，與癌細胞不同，轉移癌間質中的CAF不是轉移而來，而是由轉移癌細胞周圍的纖維母細胞轉化而來。本課題組前期對乳腺癌腫瘤間質比(tumor-stroma ratio, TSR)的研究表明，原發癌與淋巴結轉移癌中的TSR存在高度一致性[4]。目前，有關轉移癌間質中CAF的TGF-β1和p53表達尚不清楚。本實驗結果顯示，在乳腺原發癌和淋巴結轉移癌中，TGF-β1和p53的間質表達呈正相關，兩者在乳腺原發癌和淋巴結轉移癌間質中的表達呈高度的一致性。這可能是由于原發癌和淋巴結轉移癌細胞有相似的特性，而導致間質TGF-β1和p53表達一致，具體機制有待進一步分析。

TGF-β1調節信號通路中某些促癌基因的轉錄激活需要突變型p53基因的參與，突變型p53基因對TGF-β1信號通路有激活和加強作用，兩者在腫瘤的浸潤和轉移過程中有密切聯系[23-24]。在乳腺癌中TGF-β1的高表達促進腫瘤的進展，如發生p53的突變，其促進作用會進一步增強[25]。其在間質中是否具有同樣的作用，尚不清楚。本實驗結果顯示：在乳腺原發癌和相應淋巴結轉移癌間質中，TGF-β1和p53均陽性組與TGF-β1陽性、p53陰性組相比，前者預后較差；提示在乳腺原發癌和相應淋巴結轉移癌間質中，TGF-β1和p53的作用與乳腺癌細胞相似，間質CAF中p53基因突變可以促進TGF-β1信號通路的轉錄，從而促進乳腺癌的進展。

表3 乳腺癌預后Cox危險因素分析

表4 TGF-β1和p53的間質表達與乳腺癌患者預后的關系