乳腺浸潤性癌中促纖維增生反應的組織學分類及其臨床意義

秦東梅，周文斌，仇 瑋，錢影臣，劉善荷，李 明，黃文斌

根據國家癌癥中心2021年發布的全國癌癥報告顯示，乳腺癌居我國女性惡性腫瘤發病首位[1]。長期以來乳腺癌的臨床治療和預后評估主要集中于對腫瘤細胞的評估，如腫瘤TNM分期、組織學類型、病理分級等。近年，研究發現腫瘤微環境和腫瘤的臨床生物學行為及療效密切相關。腫瘤微環境內的纖維性間質數量及其排列方式，與腫瘤的進展和治療反應有關[2-4]。促纖維增生反應(desmoplastic reaction, DR)是由腫瘤性病變引起的纖維或結締組織的增生，其特征為癌細胞浸潤和伴淋巴細胞、巨噬細胞和中性粒細胞等炎細胞浸潤、募集新生的血管內皮細胞和成纖維細胞[5]。DR組織學分類在結直腸癌、口腔鱗狀細胞癌、胰腺導管腺癌和食管鱗狀細胞癌等實體腫瘤中已有報道，并發現DR組織學分類與腫瘤臨床生物學行為及預后有關[6-9]。目前，乳腺癌中DR組織學分類的臨床意義報道較少，且檢測方法及分析對象尚不一致，其在乳腺癌中的臨床意義尚不清楚。本文分析187例乳腺浸潤性導管癌(invasive ductal carcinoma, IDC)中DR組織學類型與臨床病理學特征的相關性，旨在探討乳腺癌中DR的臨床意義，為乳腺癌患者的臨床生物學行為和預后評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2017年1月～2020年12月南京醫科大學附屬南京醫院和南京醫科大學附屬江寧醫院行手術切除的212例乳腺IDC，通過電子病歷系統收集病理資料，剔除資料不完整及術前行輔助治療的患者，最終收集187例IDC進行檢測。187例乳腺癌患者平均年齡55.7歲(31～90歲)；腫瘤平均最大直徑2.35 cm(0.15～9.8 cm)。組織學分級：Ⅰ級8例，Ⅱ級100例，Ⅲ級79例。脈管侵犯37例，神經侵犯20例。有淋巴結轉移者73例，無淋巴結轉移者106例，8例未送檢淋巴結。根據AJCC(第8版)進行pTNM分期：Ⅰ期61例，Ⅱ期87例，Ⅲ期31例。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 標本均采用10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片，分別行HE和免疫組化EnVision法染色。一抗ER、PR、HER-2和Ki-67均為即用型抗體，購自北京中杉金橋公司。采用全自動免疫組化儀(Dako AutoLink 48)進行染色，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.2熒光原位雜交 組織切片經二甲苯脫蠟，胃酶處理，2×SSC洗滌緩沖液，烤片，在玻片上加入探針，恒溫過夜雜交，室溫下置于0.1%NP-40/2×SSC漂洗，暗處自然干燥，DAPI復染劑滴加于玻片雜交區域，暗處放置10～20 min后，在熒光顯微鏡下選用合適的濾片組觀察玻片。HER-2熒光原位雜交探針，購自北京金普嘉公司。

1.3 結果判讀

1.3.1DR 根據文獻報道組織學分類標準將DR分為成熟型、中間型和未成熟型[10]。DR評估及分類由兩位高年資病理醫師完成，且判讀結果不一致者在雙人共攬顯微鏡下會診，共同判斷。

1.3.2免疫組化 ER、PR陽性定位于細胞核，HER-2陽性定位于細胞膜。ER、PR陽性參考《乳腺癌雌、孕激素受體免疫組織化學檢測指南》，將細胞核著色≥1%定義為陽性[11]。HER-2結果判斷參考《乳腺癌HER-2檢測指南(2019版)》[12]，即無著色或≤10%的浸潤癌細胞呈不完整的、微弱的細胞膜染色為0；>10%的浸潤癌細胞呈不完整的、微弱的細胞膜染色為1+；>10%的浸潤癌細胞呈弱～中等強度的完整細胞膜染色或≤10%的浸潤癌細胞呈強而完整的細胞膜染色為2+；>10%的浸潤癌細胞呈強而完整且均勻的細胞膜染色為3+。Ki-67增殖指數以20%為臨界值，<20%為低表達和≥20%為高表達。

1.3.3FISH 免疫組化檢測HER-2為2+者，將進行HER-2 FISH檢測，FISH判讀標準根據《乳腺癌HER-2檢測指南(2019版)進行[12]。

1.3.4乳腺癌分子分型 根據WHO(2019)乳腺腫瘤分類將乳腺癌分為4種分子分型[13]：(1)Luminal A型：ER陽性，PR陽性≥20%，HER-2陰性且Ki-67增殖指數<20%；(2)Luminal B型：ER陽性，HER-2陰性，Ki-67增殖指數≥20%或PR陽性<20%；另一種為ER陽性，HER-2陽性，Ki-67增殖指數及PR陽性可以任何水平；(3)HER-2過表達型：ER及PR陰性，HER-2陽性；(4)三陰型：ER、PR及HER-2均陰性。

1.3.5腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL) 根據WHO(2019)乳腺腫瘤分類將TIL分為3組：<10%為低度/無浸潤；10%～39%為中度浸潤；40%～90%為高度浸潤[13]。

1.4 統計學分析采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，DR組織學分類與IDC臨床病理學特征、分子分型、TIL的相關性分析采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DR組織學分類與乳腺IDC臨床病理特征的關系187例乳腺IDC中成熟型DR 15例，中間型DR 83例，未成熟型DR 89例。成熟型DR：間質由細而長的纖維和纖維細胞分成多層(圖1)；中間型DR：間質由寬而明亮的嗜酸性玻璃樣變膠原纖維和成纖維細胞組成(圖2)；未成熟型DR：纖維母細胞散亂排列于黏液樣基質內(圖3)。DR組織學分類與乳腺IDC病理分級呈負相關(χ2=19.150，P=0.001)，即具有成熟型DR的IDC病理分級高，而未成熟型DR的IDC則病理分級低。DR組織學分類與IDC患者年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、脈管和神經侵犯、淋巴結轉移和pTNM分期等均無明顯相關性(P>0.05，表1)。

2.2 DR組織學分類與乳腺IDC中ER、PR、HER-2和Ki-67表達的關系ER和PR陽性定位于細胞核，HER-2陽性定位于細胞膜(圖4～6)。DR組織學分類與IDC中ER、PR陽性具有相關性，未成熟型DR在ER/PR陽性的乳腺IDC中高于ER/PR陰性者(χ2=21.601，P<0.001；χ2=21.952，P<0.001，表2)。DR組織學分類與乳腺癌HER-2、Ki-67陽性無明顯相關性(χ2=3.176，P=0.204；χ2=2.286，P=0.319)。

2.3 DR組織學分類與乳腺癌分子分型的關系187例乳腺IDC中Luminal A型68例，Luminal B型79例，HER-2過表達型13例，三陰型27例。DR組織學分類與乳腺癌分子分型密切相關，其中管腔型IDC具有較高比例的未成熟型DR(41.6%，37/89)，而三陰型乳腺癌多為成熟型DR(53.3%，8/15)(P<0.001，表3)。

2.4 DR組織學分類與乳腺IDC中TIL的相關性IDC中TIL具有不同程度浸潤(圖7～9)：DR組織學分類與TIL的浸潤程度具有相關性，成熟型DR的IDC具有高度的TIL(60%，9/15)，而未成熟型DR者TIL則為低度/無浸潤(66.3%，59/89)(P<0.001，表3)。

圖1 成熟型DR：間質由細而長的纖維和纖維細胞分成多層 圖2 中間型DR：間質由寬而明亮的嗜酸性玻璃樣變膠原纖維和成纖維細胞組成 圖3 未成熟型DR：黏液樣間質內膠原纖維束雜亂無章地分布 圖4 腫瘤細胞ER呈彌漫陽性，EnVision法 圖5 腫瘤細胞PR呈彌漫陽性，EnVision法 圖6 腫瘤細胞呈HER-2(3+)，EnVision法 圖7 TIL低度浸潤 圖8 TIL中度浸潤 圖9 TIL高度浸潤

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，位居女性惡性腫瘤病死率的首位。乳腺癌的臨床治療和預后評估主要根據腫瘤大小(T)、淋巴結轉移(N)和遠處轉移(M)的TNM分期進行，但臨床發現具有相同臨床分期或病理組織學參數相同的患者卻常有不同的腫瘤轉歸，提示腫瘤細胞并不能完全預測乳腺癌患者的治療反應及預后。以往研究報道，使用基因工程的方法增加小鼠乳腺間質內I型膠原的含量后，可使其乳腺癌患病率提高3倍，發生肺轉移的幾率也提高3倍[14]。有文獻報道腫瘤間質百分比對三陰型和淋巴結陽性乳腺癌患者具有重要預后價值[15-16]；提示腫瘤間質即腫瘤微環境可能通過多種機制，包括細胞外基質的重塑、炎癥細胞的招募、基質調控通路的連接等促進腫瘤的增殖和擴散。

研究發現隨著惡性腫瘤的進展，腫瘤周圍的微環境可發生動態改變，其中最主要的變化為DR。Ueno等[17]對DR進行組織學分類并將其應用于直腸癌的研究中，他們根據膠原纖維的寬度和間質是否伴黏液樣變將DR分為成熟型、中間型和未成熟型，結果顯示成熟型DR的直腸癌Dukes分期低，而未成熟型DR則Dukes分期高，DR組織學分類與患者5年生存期明顯相關。盧梅等[18]對胰腺導管腺癌腫瘤間質進行研究發現，腫瘤間質成熟度與胰腺癌組織學分級、淋巴結轉移有相關性。本組對食管鱗狀細胞癌中腫瘤間質分析發現，具有未成熟型間質的食管鱗狀細胞癌有較高的pT分期、神經和脈管侵犯、淋巴結轉移和較晚的pTNM分期，且與食管癌患者的無進展生存率有關[19]。Ahn等[4]根據乳腺癌間質的主要成分將乳腺癌間質分為三種主要類型：膠原為主型、成纖維細胞為主型和淋巴細胞為主型，研究結果顯示主要間質類型與乳腺癌臨床病理參數及激素受體狀態和HER-2表達有關，膠原為主型和成纖維細胞為主型與ER表達密切相關，生存分析顯示間質類型與無瘤生存期(disease-free survival, DFS)密切相關，膠原為主型預后相對差，表明腫瘤微環境內的間質不僅影響乳腺癌細胞的生物學行為，且不同的間質類型具有不同的生物學行為。新近研究發現，在乳腺癌中采用靶向腫瘤微環境的策略，使用針對賴氨酰氧化酶類似物2(一種介導膠原纖維交聯的酶)的抗體后，腫瘤間質發生重構，間質膠原的密度顯著降低，腫瘤體積縮小，從而有助于乳腺癌的治療[14]。因此，對于間質不成熟的乳腺癌患者，通過靶向腫瘤微環境使間質重構，抑制腫瘤的生長和侵襲轉移，其有可能成為輔助治療策略。

表1 DR組織學分類與乳腺IDC臨床病理特征的關系

表2 DR組織學分類與乳腺IDC中ER、PR、HER-2和Ki-67增殖指數的關系

本組發現DR組織學分類僅與病理分級有關，即具有成熟型DR的IDC，其病理分級高；而未成熟型DR的IDC則病理分級低。進一步分析發現，DR組織學分類與ER、PR陽性密切相關，ER/PR陽性乳腺癌組織中DR組織學分類多為未成熟型，而與HER-2陽性無關，提示激素受體陽性乳腺癌細胞可能影響腫瘤微環境中相關成分的改變而發揮促進腫瘤進展的作用。分子分型顯示未成熟型DR多見于管腔型IDC，而成熟型DR多為三陰型IDC，提示DR的組織學分類與乳腺癌的分子分型及預后有關，通過觀察評估DR組織學形態不僅能反映乳腺癌微環境的特點，還能有助于乳腺癌的分子分型預測。

TIL是機體對腫瘤細胞的一種反應，也是免疫治療療效預測的組織學特征。文獻雖未報道TIL水平與乳腺癌患者的總生存率和無瘤生存率有關，但幾項大型系統復習和薈萃分析證實，僅在三陰型和HER-2陽性乳腺癌中，TIL高與更好地DFS和總生存期相關[16,20]。本組DR組織學分類和TIL呈負相關，即成熟型DR伴高度TIL，而不成熟型DR伴低度TIL；提示DR可能通過分泌一些細胞因子招募TIL，也有可能是TIL分泌的細胞因子重塑DR，具體機制還需要進一步深入分析。

綜上所述，浸潤性乳腺癌中浸潤前沿DR具有不同的組織學形態，DR組織學分類與乳腺癌的分子分型和TIL密切相關，觀察DR的形態學特征并進行組織學分類，可有助于評估和預測乳腺癌的臨床生物學行為及分子類型，為乳腺癌患者的治療及預后提供參考。

表3 DR組織學分類與乳腺癌分子分型、間質TIL的關系