動物神經性疾病相關神經遞質檢測技術進展

羅蓀琳 ， 范瑞祺， ， 張婉君， ， 賈 栗 ， 苑曉燕 ， 陳義強

(1.中國農業大學動物科學技術學院 動物營養學國家重點實驗室 ， 北京 海淀 100193 ；2.中國人民解放軍疾病預防控制中心 ， 北京 豐臺 100171)

神經遞質是機體中神經信號傳遞的內源性化學物質，在神經系統中發揮重要功能。動物神經性疾病(如癲癇)的發生往往伴隨著神經遞質含量的變化，并且神經系統相關的藥物開發(如麻醉劑)與外源性化合物(如有機磷農藥)對動物的神經毒性研究中通常以神經遞質的含量變化作為檢測指標，因此在獸醫領域神經遞質的定量測定是十分重要的。

根據神經遞質的化學本質，可將其分為單胺類神經遞質、膽堿類神經遞質、氨基酸類神經遞質和肽類神經遞質等(表1)。不同種類神經遞質化學特性不同，適用的檢測方法也不盡相同。神經遞質檢測常需要分離技術和檢測方法聯用測定，前者常用方法主要是色譜法和毛細管電泳法，后者主要儀器包括質譜檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器和紫外可見檢測器等[1]。本文總結了近年來與動物神經性疾病發生密切相關的四類神經遞質(單胺類神經遞質、膽堿類神經遞質、氨基酸類神經遞質和肽類神經遞質)的檢測技術進展，以期為獸醫神經性疾病臨床診療和藥物開發提供一定幫助。

表1 神經遞質分類

1 單胺類神經遞質

單胺類神經遞質包括兒茶酚胺和吲哚胺類，前者主要包含多巴胺(Dopamine,DA)、去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)和腎上腺素(Epinephrine,E)，后者主要包括5-羥色胺(Serotonin,5-HT)和5-羥基色氨酸(5-hydroxytryptophan,5-HTP)，參與記憶、睡眠、感覺傳遞等生理過程[2-3]以及獸藥噻拉嗪等的作用途徑[4]。常見單胺類神經遞質的分子結構式見圖1。

圖1 常見單胺類神經遞質分子式

液相色譜法是測定單胺類神經遞質的最常用方法，在使用反相液相色譜時，由于單胺類神經遞質具有強極性，在色譜柱上保留時間短，需要通過衍生化處理改善單胺類神經遞質的色譜保留行為[5]，如以苯甲酰氯[6]作為衍生化試劑的液相色譜串聯質譜方法檢測單胺類神經遞質。親水相互作用色譜可替代反相液相色譜，Konieczna等[7]建立了分散液-液微萃取的液相色譜-親水相互作用色譜-質譜方法測定單胺神經遞質及其各自的前體和代謝物。為適應不同樣品中神經遞質的檢測，Li等[8]建立了苯硼酸輔助的雙功能固相萃取結合液相色譜串聯質譜方法實現尿中單胺類神經遞質的臨床常規檢測。Fuertig等[9]加入氘代內標，無需衍生即可通過液相色譜串聯質譜定量分析包括DA、5-HT等在內的11種物質。盡管許多研究使用高效液相色譜與質譜聯用技術測定單胺類神經遞質含量，但試驗發現與高效液相色譜聯用的檢測器不同時，檢測效果存在差異。一項研究分別使用高效液相色譜與紫外、熒光和質譜檢測器聯用，測定小鼠不同腦組織中單胺類神經遞質水平，結果顯示使用熒光檢測器的檢測結果更好，定量限低且基質效應弱[10]。這說明不同樣品中神經遞質的最優檢測方法不同，一種檢測方法的建立無法適用于所有檢測樣品，需要針對不同物種、不同樣品基質等條件分別建立合適的檢測方法。另外，微透析活體采樣技術也廣泛用于體內神經遞質含量的實時監測，但微透析取樣后的樣品量少，如何能使用少量樣品準確定量神經遞質含量也是一個挑戰。Carreo等[11]建立了一種用于微透析樣品中DA、5-HT等定量分析的液相色譜串聯質譜方法，該方法精密度和檢測限均能滿足測定要求。

2 膽堿類神經遞質

乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh)是最主要的膽堿類神經遞質，由膽堿和乙酰輔酶A在膽堿乙酰移位酶的催化作用下合成，參與記憶、學習和認知、運動、攝食、壓力等生理過程[12]，與動物熱應激、麻醉藥物作用發揮等[13-14]有重要聯系。ACh的分子結構式見圖2。

圖2 乙酰膽堿分子式

ACh同樣可用色譜法進行測定，如液相色譜串聯質譜方法對血漿[15]以及大鼠不同腦區[16]ACh含量進行測定。色譜法測定ACh的難點在于內源性化合物γ-丁酰甜菜堿與ACh結構相似，容易干擾ACh的測定。Lamy等[17]建立了一種高靈敏度親水相互作用色譜-質譜方法，可有效分離ACh與γ-丁酰甜菜堿。

此外，還可使用傳感器法[18]和熒光探針[19]測定ACh。傳感器檢測技術研究不斷尋求新的材料構建生物傳感器，Chauhan等[20]建立了將乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶固定在改性氟摻雜氧化錫上構成的生物傳感器，用于測定血清樣品中的ACh水平，該方法具有較高的靈敏度和較低的檢測限。近年來單獨檢測ACh的方法建立較少，大多建立的新方法是用于ACh與其他種類神經遞質共同檢測，如液相色譜串聯質譜法同時測定嚙齒動物腦脊液中[21]和大鼠腦中[22]ACh與多種氨基酸類神經遞質。

3 氨基酸類神經遞質

氨基酸類神經遞質種類較多，包括谷氨酸(Glutamate,Glu)、γ-氨基丁酸(4-aminobutyric acid,GABA)、谷氨酰胺(Glutamine,Gln)、甘氨酸(Glycine,Gly)等，此類神經遞質參與調節情緒、感知傳遞等生理過程[2]，與動物癲癇[23]、肝性腦病[24]等疾病相關[25-27]。常見氨基酸類神經遞質的分子結構式見圖3。

圖3 常見氨基酸類神經遞質分子式

氨基酸測定即可直接使用氨基酸分析儀進行樣本中游離氨基酸批量測定[28]，一般多用高效液相色譜法檢測氨基酸類神經遞質,但氨基酸分子結構小,且大多沒有光學性質,因此一般先將其衍生化,再利用色譜法進行分析，即柱前衍生[29]。常用的衍生劑有鄰苯二甲醛[29]、異硫氰酸苯酯[30]等。測定氨基酸類神經遞質時色譜常與熒光檢測器聯用，Cui等[31]開發了一種高效液相色譜-熒光法測定抑郁大鼠腦組織7種氨基酸類神經遞質含量；Li等[32]通過高效液相色譜-熒光檢測器結合鄰苯二甲醛衍生定量檢測小鼠腦缺血后大腦皮層和血漿中的18種氨基酸；Huang等[33]建立了高效液相色譜-熒光法同時測定糖尿病大鼠皮質和海馬中與糖尿病腦病發病機制相關的9種神經遞質。許多文獻通過液質聯用測定氨基酸類神經遞質。Yan等[34]通過高效液相色譜-串聯質譜法測定大鼠腦中的5種神經遞質，用于研究刺槐水提物對失眠大鼠模型的催眠作用。使用4′-碳酰氯玫瑰胺作為衍生試劑，基于原位超聲輔助衍生化分散液-液微萃取結合高效液相色譜-串聯質譜方法，可分析阿爾茨海默病大鼠尿液中的氨基酸和單胺類神經遞質及其代謝物[35]。液相色譜法串聯質譜結合微透析可實現對大鼠突觸間隙中氨基酸類神經遞質水平的同步檢測[36]。毛細管電泳也適用于手性氨基酸拆分和復雜樣品中的氨基酸分析[37]，結合激光誘導熒光檢測器，在鄰苯二甲醛衍生下用熒光硫醇快速標記氨基酸神經遞質可進行高通量分析[38]。

4 肽類神經遞質

肽類神經遞質包括谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、內源性阿片肽(Endogenous opioid peptides,EOP)和腦啡肽(Enkephalin,ENK)等，參與睡眠、情緒調節、學習記憶等生理過程，與犬脊髓損傷[39]等動物疾病發生有關。常見肽類神經遞質的分子結構式見圖4。

圖4 常見肽類神經遞質分子式

早期的肽類物質含量測定多采用免疫親和法，隨著聯用技術的發展，液相色譜結合微透析法檢測肽類的方法逐漸豐富，近年來這些方法還在不斷改進，Wilson等[40]使用同位素內標建立毛細管液相色譜-串聯質譜方法對大鼠海馬中神經肽進行定量分析；Al-Hasani等[41]開發了一種光遺傳性微透析探針結合液相色譜串聯質譜方法用于測定阿片肽等神經遞質含量。此外，肽類神經遞質的活體原位實時監測可采用電化學法(如快速掃描循環伏安法[42])進行。

總結與展望

神經遞質是神經系統的信使，將神經中樞的信號傳至各個組織和器官，在動物機體內發揮著重要作用。近年來，隨著質譜技術的發展，在神經遞質測定中色譜與質譜聯用方法不斷改進，尤其是液相色譜串聯質譜法。活體采樣微透析法、電化學法以及各種傳感器技術都有不同程度的發展，各種小分子物質被嘗試用作生物探頭，如納米材料、熒光材料。許多研究證明，神經性病變往往是多種神經遞質濃度改變的綜合結果，因此多神經遞質的同步測定方法亟需建立。為滿足獸醫領域神經遞質定量分析需求，未來亟需發展活體原位實時測定的高靈敏度、高通量多神經遞質同步測定方法。