松果菊F3'H基因的克隆及表達分析

吳紅松，秋田祐介

（1.日本埼玉工業大學 生命環境化學系，日本深谷 369-0293；2.菏澤學院 生物科學系，山東菏澤 274000）

松果菊是世界上最著名的藥用植物之一，近年來因其觀賞特性而備受關注。目前，針對松果菊的分子研究集中于遺傳多樣性，與花青素生物合成相關的基因研究鮮有報道。

類黃酮3'-羥化酶（Flavonoid 3'-Hydroxylase，F3'H），是花青素合成的關鍵基因，最初由BRUGLIERA等[1]從矮牽牛（Petunia hybrida）中分離并鑒定，目前已報道多種植物含有此基因。研究表明，F3'H負責B環3’位置的羥基化位置和程度，從而形成不同的花青素。因此，鑒定功能基因F3'H是了解松果菊中花青素羥基化和花色形成的重要步驟。研究發現松果菊F3'H（EpF3'H）的表達特點與菊花F3'H（CgF3'H）在菊花所有器官中的表達和百合F3'H（LvF3'H）在百合有色花瓣和無色花瓣中的表達結果相似[3-4]。EpF3'H的表達水平與花發育過程中花青素的形成和積累趨勢基本一致，可能具有協同促進松果菊花瓣中花青素合成和積累的作用。但黃文坤等[5]發現F3'H在紫莖澤蘭類花瓣中的表達低于在葉中的表達，可見F3'H基因在不同品種、組織和生長階段具有不同的時空表達模式，它們的組織特異性表達可能受調控基因的影響

本文利用3'-RACE和5'-RACE法克隆了EpF3'H的cDNA，并分析了該基因在不同組織中的表達，以便開展針對松果菊花色的分子育種計劃。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

松果菊購自Sakata Seed Co.（日本），室外栽培。采摘時將松果菊開花階段分為四個時期，分別命名為S1、S2、S3和S4：S1——花瓣閉合，綠色（長度小于15 mm）；S2——花瓣開始著色（長約20 mm）；S3——花瓣緋紅，剛剛綻開（長約20 mm）；S4——花瓣平展，花色紫紅（長約30 mm）[2]。從不同開花階段中收集花瓣和葉，實驗至少重復三次。收集后立刻液氮預冷，在RNA提取前儲存于-80 ℃。

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），日本Sigma；M-MLV逆轉錄酶，日本Takara；DNase I，日本Takara；3'-RACE和5'-RACE試劑盒，德國Roche。

T100型PCR儀，美國BIO；ABI 3730xl Analyzer型自動測序儀，美國Applied Biosystems；QuantStudio?1型RT-PCR儀，美國Thermo Fisher Scientific。

1.2 EpF3'H全長cDNA的克隆

從不同開花階段（S1～S4）的花、葉中用CTAB法提取總RNA。2 μg RNA為模板，Oligo（dT） 21為引物，用M-MLV逆轉錄酶轉錄，DNase I處理，總體積20 μL，合成得EpF3'H的cDNA。使用3'-RACE和5'-RACE法擴增F3'H基因的全長cDNA片段。

設計一對引物EpF3'H-FP：5'-ATGACTATT CTAACCCTACTATCATACACC-3'，EpF3'H-RP：5'-TTAACCACTTTCATATACTTGAGG-3'。PCR 參 數為：95 ℃預變性5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、90 s，30個循環，最后72 ℃延伸5 min，分離、連接、轉化、測序，獲得全長cDNA片段。

1.3 系統發育分析

使用Genetyx-ver 12軟件對不同植物F3’H蛋白的氨基酸序列進行多序列比對，Clustalw多重比對的相鄰連接法構建系統進化樹，bootstrap檢驗的重復次數為1 000次。

1.4 生物信息學分析

測序得到的EpF3'H基因的序列信息提交到NCBI，通過BLAST與核酸和蛋白質數據庫進行比對搜索，利用NCBI查找開放閱讀框（ORF），預測EpF3'H基因編碼蛋白的理化性質。

1.5 表達分析

采用SYBR green熒光染料進行RT-PCR，每個PCR反應總體積20 μL，引物EpF3'H-FP1：5'-ACAGTGGAATGGGCAATAGC-3'，EpF3'H-RP：5'-TTAACCACTTTCATATACTTGAGG-3'。采用 2-??Cq計算各基因的相對表達量，以EpACT1作為內參基因，實驗重復4次。

2 結果與分析

2.1 EpF3'H基因全長cDNA序列的合成

通過3'-RACE和5'-RACE擴增出cDNA的3'和5'端，從而獲得EpF3'H的全長cDNA序列。ORF為1 533 bp，編碼510個氨基酸（GenBank登錄號OL828207），蛋白分子量為56.49 kD，pI為8.46。通過與NCBI上已登錄的菊花、郁金香、葡萄等的F3'H蛋白序列進行比對，發現克隆的基因為F3'H基因。

2.2 EpF3'H的同源性和結構特征

從NCBI Blast的比對結果中選取來源于其他24種植物的F3'H蛋白與松果菊EpF3'H蛋白，用相鄰連接法構建系統進化樹（見圖1）。從圖1中可以看出，不同物種來源的F3'H蛋白在進化上歸屬不同的分支，EpF3'H與非洲菊雜交種、菊花的F3'H親緣關系較近，處于同一分支上。蛋白質多序列比對分析顯示，EpF3'H與非洲菊雜交種（DQ218417）、菊花(AB523844)高度同源，相似度分別為83.52%和82.67%，這表明EpF3'H是F3'H家族成員。F3'H可通過底物競爭羥基化二氫黃酮醇3'位，合成紫紅色色素的前體物質，EpF3'H可能與其他F3'H蛋白一樣具有相同的催化功能。

圖1 EpF3'H與其他植物F3'H蛋白的系統進化樹分析

通過NCBI保守基序的比對發現，EpF3'H蛋白功能結構域（細胞色素P450結構域）有四個特有保守基序和三個F3'H特有保守基序，表明EpF3'H是典型的F3'H蛋白。

2.3 EpF3'H的基因表達

RT-PCR結果（圖2）顯示，EpF3'H在松果菊的葉和花中均有不同程度的表達。EpF3'H在S4花期中表達量最高，其他時期表達量從高到低依次為S2、S1、S3和葉。可見，EpF3'H的表達模式大致與花青素積累模式相對應。

圖2 EpF3'H基因相對表達量

3 結論

研究表明，EpF3'H參與了松果菊花色形成，也發揮了類似于F3'H在擬南芥等物種中的功能[6]，可決定無色二氫黃酮醇的羥化位置和程度，從而合成不同種類花青素苷。