檳榔加工副產物代料栽培對平菇子實體及物質轉化的影響

包怡紅，賈雨彤，賴章飛，潘飛兵，匡鳳姣

（1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040；3.海南華創檳榔研究院，海南海口 570100；4.海南口味王科技發展有限公司，海南萬寧 571501）

平菇是側耳屬（Pleurotus）中普遍栽培的糙皮側耳、鳳尾菇、白黃側耳等食用菌的統稱[1]。平菇肉質肥厚、味道鮮美、營養豐富，是世界上栽培量較大的食用菌之一，也是我國發展速度較快、栽培面積較廣、經濟效益較高的食用菌。平菇具有耐低溫、出菇快、產量高等特點，應用的栽培原料較為廣泛，如玉米秸稈、棉籽殼等農副產品的下腳料均可[2]。隨著食用菌產業快速發展，闊葉樹木屑資源被大量消耗，菌林矛盾日益突出，栽培料的數量和種類成為制約行業發展的首要問題[3]。

因此，積極尋找代用料栽培食用菌至關重要。目前，關于代料栽培食用菌國內外已有很多報道，Ropciuc 等[4]以咖啡渣為替代料，成功栽培出了活性成分含量較高的平菇。Mandeel 等[5]以廢棄紙板為替代料栽培出的平菇生物學效率較高。徐建俊等[6]研究發現，以桑枝屑代料栽培的香菇含有豐富的礦物質，粗蛋白、粗脂肪和粗纖維，具有較高營養價值和藥用保健性。賈靜等[7]研究發現，以菌糠代替木屑制成培養料栽培元蘑，元蘑可正常生長，當替代料含量為30%時，生長效果最好，證明了以菌糠為替代料栽培元蘑的可行性。

檳榔（Areca catechuL.）是單子葉植物綱、棕櫚科，是海南省的主要經濟作物之一[8]。檳榔是四大南藥之首，蘊含豐富的天然活性物質[9]。檳榔果加工中會產生檳榔核、檳榔蒂等大量的副產物，其中含有多酚、黃酮、纖維素等豐富的營養物質[10]，但是現在多數企業采取直接廢棄的方式，這不僅造成了資源浪費，不能充分實現檳榔的經濟與營養價值，還會對環境造成污染。而食用菌具有強大的富集作用，利用檳榔加工副產物作為食用菌的栽培基質，可以富集檳榔副產物中的營養成分。近年來，對檳榔副產物的利用主要集中在多酚及檳榔堿的提取分離純化研究[11?13]，利用檳榔加工副產物作為食用菌的栽培基質研究還存在不足。

本文利用檳榔加工副產物檳榔核和檳榔蒂分別作為食用菌栽培料，進行可行性研究和主要成分的物質轉化分析，實現檳榔加工副產物變廢為寶，對于檳榔生產加工業以及環境保護都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原材料檳榔核、檳榔蒂 由海南華創檳榔研究中心提供；供試平菇菌種平菇一號 由黑龍江省科學院微生物研究所菌種保藏室提供；玉米芯、聚丙烯塑料袋（16.50 cm×35.00 cm） 購于哈爾濱農副產品批發市場；沒食子酸和蘆丁標準品 上海源葉生物科技公司；無水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、碳酸鈉、硝酸鋁、硫酸銅、硫酸鉀、高氯酸、葡萄糖，瓊脂粉、碳酸鈣和香草醛等 均為分析純，天津市天力化學試劑有限公司。

DY04-13-44-00 立式壓力蒸汽滅菌器筒 上海東亞壓力容器制造有限公司；DH6000A 型電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司；722 型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；pHS-3E 型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 平菇菌種活化 取平菇菌塊（d=4 mm）接種于PDA 平板中央，然后將其置于27 ℃恒溫箱內避光培養，空氣濕度為70%，待菌絲長滿平板后作為試管階段母種。母種經PDA 試管培養基復壯后，再擴繁至50 mL 組培瓶中，置于27 ℃恒溫箱內避光培養，空氣濕度為70%，培養為原種。然后再用玉米芯培養基在栽培袋里27 ℃恒溫培養擴大為栽培種。栽培種培養基組分為：玉米芯88%、麥麩10%、石灰1%、碳酸鈣1%。

1.2.2 培養料試管培養條件優化

1.2.2.1 試管培養 以檳榔副產物檳榔核和檳榔蒂分別作為替代料，玉米芯為常規培養料。按照粒徑大小、含水量、替代料含量設計進行平菇培養料一級篩選。一級配方篩選用試管規格8.0 cm×1.8 cm，每組5 個重復，121 ℃高壓滅菌2 h，冷卻至28 ℃以下，按無菌操作規程接種，在PDA 平板中取菌塊（d=4 mm）接種于試管基質起始點。置于27 ℃恒溫培養箱避光培養，空氣濕度為70%。每隔3 d 在試管外用馬克筆進行前端劃線，測定菌絲生長速度和菌絲體長勢。

菌絲長勢：指菌絲生長的強弱，包括菌絲體潔白程度和濃密程度。觀察記錄菌絲長勢，用“+、++、+++、++++、+++++”分別表示菌絲長勢較差、一般、良好、較好、好。優質菌種菌絲應色澤純正、菌絲粗壯、分枝多而密[14]。

菌絲生長速度（cm/d）=菌絲生長長度（cm）/菌絲生長天數（d）[15]。

1.2.2.2 培養料含水量的選擇 以副產物45%、玉米芯43%、麥麩10%、石灰1%、碳酸鈣1%為培養料配方，改變水分含量，接種至含水量為55%，60%，65%，70%，75%的培養料中，接種量為10%，培養料粒徑大小為0.15～0.3 cm，調節pH 為7.0 左右，進行水分含量的篩選，并以菌絲體生長速率、生長勢為測定指標，確定最適水分含量。

1.2.2.3 培養料粒徑大小的選擇 在最適水分含量條件下，以副產物45%、玉米芯43%、麥麩10%、石灰1%、碳酸鈣1%為培養料配方，將培養料用不同規格的土壤分樣篩篩分為<0.05 cm，0.05～0.15 cm，0.15～0.3 cm，0.3～0.45 cm 和>0.45 cm，5 種粒徑等級，接種量為10%，調節pH 為7.0 左右進行篩選。以菌絲體生長速率、生長勢為測定指標，確定最適粒徑大小。

1.2.2.4 培養料中替代料含量的選擇 在最適粒徑大小和最適水分含量條件下，以副產物0%、15%、30%、45%、60%、75%的替代量進行接種，接種量為10%，調節pH 為7.0 左右，進行篩選。以菌絲體生長速率、生長勢為測定指標，確定最適替代料含量。

1.2.3 平菇栽培試驗 根據初步試管篩選試驗的結果，篩選出4 個適宜平菇生長的配方進行菌袋栽培試驗（不添加副產物為對照組）常用配方：檳榔加工副產物30%～50%、玉米芯78%～38%、麥麩10%、生石灰1%、碳酸鈣1%。

將所有培養料混合后攪拌均勻，每袋裝料量約800 g，每組5 個重復，121 ℃高壓滅菌2 h，冷卻至28 ℃以下，按無菌操作規程接種，接種量為6%，接種于袋料基質起始點。接種后置于發菌室內避光培養，培養溫度為28 ℃，空氣濕度為70%；菌絲長滿，菌袋開口后保持濕度為80%，子實體8 成熟時采收（判斷標準為菌褶全部伸展，菌蓋充分展開[16]。測定生物學效率及子實體中營養成分。

生物學效率（%）=鮮菇質量（g）/干料質量（g）×100[15]。

1.2.4 混合培養料及子實體營養成分的測定

1.2.4.1 樣品處理 取培養料和平菇子實體干燥箱烘干、粉碎、過40 目篩，保存備用。

1.2.4.2 蛋白質含量 按照國標GB 5009.5—2016中的方法測定[17]。

1.2.4.3 多糖含量 據文獻[18]稍作修改，精密稱取樣品10.0 g 置于圓底燒瓶中，加入100 mL 95%乙醇，80 ℃回流2 h，濾渣加入100 mL 蒸餾水，回流提取2 h，抽濾，重復2 次，合并濾液濃縮至一定體積，加無水乙醇至含醇量為80%，放置24 h，抽濾，沉淀依次用乙醇、丙酮、乙醚各10 mL 洗滌，50 ℃烘干，稱重，得粗多糖樣品。稱取待測樣品5.0 mg 加蒸餾水定容至50 mL，冷藏備用。準確吸取待測液2 mL于具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，再迅速加入濃硫酸7 mL，搖勻，40 ℃水浴30 min 后冷卻至室溫，于486 nm 波長處測定吸光度。以葡萄糖為標準品，按上述方法繪制標準曲線為y=7.4193x?0.1757，R2=0.9997，根據標準曲線計算多糖含量。

1.2.4.4 還原糖含量 用DNS 法測定[19]。稱取15 g樣品，加入300 mL 蒸餾水，100 ℃沸水中回流提取3 h，放冷，紗布過濾。濾渣再次加入300 mL 水，沸水回流提取3 h，同樣方法重復提取兩次。合并濾液，定容至100 mL，為待測液。吸取2 mL 待測液，再加入1.5 mL DNS 試劑，塞好試管，沸水浴7 min，以空白為參比，540 nm 波長條件下測定吸光值。以葡萄糖為標準品測定標準曲線為y=0.2571x?0.0081，R2=0.9997。根據標準曲線測定計算還原糖含量。根據實驗測得的還原糖含量乘上系數0.9 得半纖維素含量。

1.2.4.5 總酚含量 參考文獻[20]稍作修改，準確稱取樣品粉末10 g，加入100 mL 70%乙醇，55 ℃超聲輔助提取45 min，重復提取3 次，合并濾液，真空濃縮得粗多酚樣品。準確吸取1 mL 待測液，加入5 mL 10%的福林酚，搖勻，靜置8 min 后加入4 mL 7.5% Na2CO3溶液，搖勻，于常溫下暗反應2 h，在765 nm 波長處測定吸光度，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線為y=0.0124x?0.0176，R2=0.9999。根據標準曲線計算總酚含量。

1.2.4.6 黃酮含量 參考文獻[21]稍作修改，稱取樣品粉末2 g，加入90 mL 55%乙醇，50 ℃超聲波輔助提取30 min，重復提取3 次，合并濾液，真空濃縮得粗樣品。準確吸取1 mL 待測液，加入13 mL 30%乙醇，加入0.7 mL 5% NaNO2溶液，搖勻放置5 min后，加入0.7 mL 10% Al（NO3）3溶液，5 min 后加入5 mL 1 mol/L NaOH 溶液，混勻，用30%乙醇定容，10 min 后于510 nm 波長處測定吸光度。以蘆丁為標準品繪制標準曲線為y=8.2514x+0.0023，R2=0.9991。根據標準曲線計算黃酮含量。

1.2.4.7 培養料營養成分的測定 纖維素含量測定方法參照國標中的方法[22]。半纖維素、蛋白質、多酚、黃酮、還原糖測定方法同上。

1.3 數據處理

采用Excel 2019 對所得實驗數據進行收集和整理，每組實驗至少重復3 次，結果表示為平均值±標準差（±s，n≥3），采用Origin 8.5 軟件進行作圖，采用SPSS 26.0 進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 水分含量對平菇菌絲體生長情況的影響

由表1 可知，隨著水分含量的升高，檳榔核組平菇菌絲體長勢差別不明顯，在含水量為70%時，菌絲潔白度最佳，在含水量為75%時，菌絲潔白度和菌絲密度略有下降。檳榔蒂組在含水量為65%～70%時，菌絲潔白度和菌絲密度最佳，在含水量為75%時菌絲密度降低。其原因可能是隨著水分含量的升高，培養基質的孔隙變小，影響菌絲體正常呼吸，從而影響菌絲體長勢[23]。

表1 水分含量對平菇菌絲體長勢的影響Table 1 Effect of water content on mycelial growth of Pleurotus ostreatus

由圖1 可見，使用不同基質栽培平菇，培養料的最適含水量不同。檳榔蒂組整體生長速度高于檳榔核組。隨著水分含量的升高，平菇菌絲體長速呈先上升后下降的趨勢，其中以檳榔核為替代料的平菇菌絲體長速在水分含量為65%時顯著提高（P<0.05），隨后生長速度顯著降低；以檳榔蒂為替代料時，平菇菌絲體長速在水分含量為70%時達到最高。含水量過低，無法維持食用菌生長所需的水分，若含水量過高，會導致培養料孔隙變小，菌絲體無法正常生長，這與陳秀炳等[24]以棉籽殼為主料栽培杏鮑菇時的研究結果相同。

圖1 水分含量對平菇菌絲體生長速度的影響Fig.1 Effect of water content on mycelial growth rate of Pleurotus ostreatus

2.2 粒徑大小對平菇菌絲體生長情況的影響

由表2 可知，隨著培養料粒徑的增大，平菇菌絲體長勢整體呈現先強后弱的趨勢。檳榔核組在粒徑大小為0.15～0.45 cm 之間，菌絲密度和菌絲潔白度較好。檳榔蒂組在粒徑大小為0.05～0.45 cm 之間，菌絲密度和菌絲潔白度較好。若培養料粒徑過小，培養料顆粒間的孔隙較小，菌絲體無法延伸，無法正常生長，從而影響其濃密程度，導致長勢不佳；若粒徑過大，菌絲體無法爬絲，從而影響其濃密度，也會影響菌絲體長勢。

表2 粒徑大小對平菇菌絲體長勢的影響Table 2 Effect of particle size on mycelial growth of Pleurotus ostreatus

由圖2 可見，使用不同基質栽培平菇，不同粒徑大小的培養料對平菇菌絲體生長速度影響不同，隨著培養料粒徑的增大，平菇菌絲體長速總體呈先上升后下降的趨勢，以檳榔核、檳榔蒂為替代料作培養基質的最適粒徑大小均為0.15～0.3 cm。培養料粒徑較小，通氣性較差，會影響菌絲體的長速，粒徑較大，菌絲體無法正常生長[25]，這與徐德海[26]利用大豆秸稈栽培平菇，采用較小粒徑栽培料進行栽培時，透氣性不佳，導致菌絲生長較緩慢、長勢較差的研究結論相似。

圖2 培養料粒徑大小對平菇菌絲體生長速度的影響Fig.2 Effect of particle size of culture medium on the growth rate of Pleurotus ostreatus

2.3 替代料含量對平菇菌絲體生長情況的影響

由表3 可知，隨著檳榔副產物替代比例的增加，平菇菌絲體長勢逐漸變差，檳榔核組菌絲體潔白度、濃密程度降低。檳榔蒂組菌絲體長勢整體優于檳榔核組，其原因可能是檳榔核中有較多的色素，隨著替代比例的提高，進入菌絲體中的色素增加，導致顏色加深，進而影響了平菇菌絲體長勢。

表3 替代料含量對平菇菌絲體長勢的影響Table 3 Effect of substitute material content on mycelial growth of Pleurotus ostreatus

由圖3 可見，隨著檳榔副產物替代比例的升高，平菇菌絲體的生長速度逐漸下降，當替代比例小于45%時，下降趨勢較為緩慢，當替代比例大于45%時，平菇菌絲體長速下降較為顯著（P<0.05），這可能是由于食用菌分解吸收檳榔副產物能力與常規培養料相比還是較弱。檳榔核質地較密，培養料孔隙度小，菌絲難以延伸。檳榔核中養分難以很快利用，很難提供速效養分。此外，檳榔核、檳榔蒂中含有檳榔堿和單寧等抑菌物質，培養料中若含量過多對平菇菌絲體生長有一定的抑制作用[27]。

圖3 替代料含量對平菇菌絲體生長速度的影響Fig.3 Effect of substitute material content on mycelial growth rate of Pleurotus ostreatus

由以上研究可知，增加檳榔副產物的替代量會降低平菇菌絲體生長速度，但是可以用增加培養天數來解決這一問題。綜合考慮菌絲體生長速度、生長勢，以及提高檳榔副產物的再利用率、降低平菇生產成本，選擇以45%左右替代比例（30%、50%）的副產物含量作為替代料，進行下一步的上袋培養研究，既解決了副產物添加量過多會影響平菇生長周期及生長勢的問題，又充分地實現了檳榔加工副產物的再利用價值。

2.4 不同配方栽培料對平菇生物學效率和子實體成分的影響

采用以下條件進行上袋研究：檳榔核作為替代料，培養基質水分含量分別為65%，粒徑大小0.15～0.3 cm；檳榔蒂作為替代料，培養基質水分含量分別為70%，粒徑大小為0.15～0.3 cm，替代料含量0%、30%、50%為三組進行上袋研究。

2.4.1 對滿袋時間和生物學效率的影響 由表4 可知，以檳榔加工副產物為替代料的配方栽培平菇時，平菇在不同配方培養料上均可正常生長，檳榔蒂組生物學效率整體較檳榔核組高，檳榔蒂50%替代組生物學效率最高，可達到88.67%，此外50%替代組生物學效率均高于30%替代組，這可能是由于栽培袋較試管相比松緊度適宜，通氣條件好，且出菇時需噴水處理，菌絲體會利用培養料溶解在水中的營養物質，導致檳榔核、檳榔蒂50%組雖長速變慢，但吸收利用的營養物質較30%替代組多，生物學效率較高。檳榔核、檳榔蒂50%替代組滿袋時間較長，其原因可能是檳榔核泡水處理發黏，如果加大其用量會使菌包結塊粘連，孔隙變小，透氣性變差，從而影響生長速度。檳榔核中含有的檳榔堿和單寧等抑菌物質比檳榔蒂高，對前期菌絲生長有一定的抑制作用，可以利用增加培養天數來解決這一問題[28]。

表4 平菇在菌袋中的滿袋時間及其生物學效率Table 4 Full bag time and biological efficiency of Pleurotus ostreatus in mycelium mass

2.4.2 對平菇子實體成分含量的影響 由表5 可知，代料栽培的四種平菇子實體中，與對照組相比，多酚、黃酮、多糖含量均顯著提升（P<0.05）。檳榔核50%替代組多酚、黃酮含量均為最高，多酚含量可達到51.05 mg/g，與對照組相比提升了53.21%；黃酮含量可達到0.42 mg/g，與對照組相比提升了133%。檳榔核30%替代組多糖含量最高，可達到42.01%，與對照組相比提升了77.10%。檳榔副產物中含有豐富的活性物質，而食用菌具有強大的富集作用，富集了培養料中的活性物質，使平菇子實體具有更豐富的活性成分。試驗結果表明添加一定比例（30%、50%）檳榔副產物栽培平菇，平菇子實體中黃酮、多酚等活性成分含量顯著提高（P<0.05），能夠生產富有功能活性的食品。

表5 不同配方平菇子實體營養成分含量Table 5 Nutrient content of Pleurotus ostreatus fruiting body in different formulas

2.5 栽培前后培養料中營養成分分析比較

由表6 可知，栽培前后培養料中的纖維素、半纖維素、還原糖、黃酮、多酚含量均有不同程度地下降。檳榔蒂50%替代組纖維素和黃酮含量下降幅度最大，下降幅度分別為59.69%和86.70%；檳榔核50%替代組多酚含量下降最大，下降幅度為46.99%。檳榔蒂30%替代組、檳榔蒂50%替代組、檳榔核50%替代組蛋白質含量略有提高，幅度分別為12.89%、25.17%和18.84%。廢棄培養料中各種營養成分的含量與栽培前培養料中的各營養成分含量以及平菇生長發育過程中對各成分的轉移程度有關[29]。平菇生長發育過程中菌絲體會分泌大量的酶類物質，使平菇廢棄培養料中的纖維素、半纖維素等物質含量顯著降低[30]。平菇為腐生菌，不能自身合成各種所需的營養物質，需從培養基質中分解各種大分子物質來維持自身生長。菌包中菌絲不能直接對培養基質中的營養進行吸收，而是通過自身分泌的胞外酶對大分子物質進行降解成為可吸收的小分子物質[31?32]。在平菇栽培試驗中，檳榔蒂替代組的纖維素利用率整體高于檳榔核組，而檳榔核替代組的半纖維素利用率較高，說明以檳榔核作為替代料栽培食用菌時會較好利用半纖維素進行物質轉化，而檳榔蒂替代組反之。試驗表明，經栽培，培養料中的多種營養成分成分發生了不同程度的轉移，廢棄的培養料中仍含有較豐富的蛋白質、纖維素等營養物質，可以進行循環利用[33]。

表6 平菇栽培基質中理化指標的變化Table 6 Changes of physicochemical indexes in Pleurotus ostreatus cultivation substrate

3 結論

檳榔加工副產物可以部分替代常規培養料栽培平菇。當檳榔核作為替代料時，培養基質水分含量分別為65%，粒徑大小0.15～0.3 cm 時效果最好。當檳榔蒂作為替代料時，培養基質水分含量分別為70%，粒徑大小為0.15～0.3 cm 時效果最好。檳榔核、檳榔蒂以45%左右的比例替代時，既能發揮再利用的價值，食用菌菌絲體生長速度又未減緩太多。

檳榔加工副產物替代料含量為50%時，生物學效率均高于替代料含量30%組，且黃酮、多酚等活性物質含量均有提高。多酚、黃酮含量最高的均為檳榔核50%替代組，分別可達到51.05 mg/g 和0.42 mg/g。利用檳榔加工副產物代料栽培平菇不但解決了資源浪費的問題，還使生產出的平菇具有一定的功能活性。綜上比較，副產物替代比例在30%和50%時平菇具有較高的營養成分，會使平菇的品質有所提高。

四組檳榔加工副產物為替代料的栽培試驗中，栽培料中多酚、黃酮和多糖含量明顯下降，而相應的子實體中多酚、黃酮和多糖較對照組顯著提高（P<0.05）。說明平菇子實體轉化了培養料中的活性成分且經栽培后培養料還具備一定的利用價值。

試驗結果表明檳榔加工副產物可以部分替代普通栽培料培養平菇，并且培養基質中的活性物質可以轉化進入平菇子實體中，提高食用菌的功能性成分，此外廢棄的培養料中仍然含有多種營養成分，測定結果對開展食用菌廢料的綜合利用具有一定的參考價值。