佩蘭黃酮的純化及其抗氧化與抗運動疲勞作用

胡 華

（成都文理學院體育與醫(yī)護學院，四川成都 610401）

社會發(fā)展節(jié)奏的加快，使得人們嘗試各種運動以舒緩身心，但過度的運動量易使身體出現(xiàn)運動性疲勞，影響正常的生活與工作。有研究顯示，運動性疲勞的產(chǎn)生與體內(nèi)自由基的增多有關[1?2]，若機體補充抗氧化劑，使其與內(nèi)源性自由基相互作用，能有效減輕氧化損傷，預防運動性疲勞[3?4]。近年來，部分抗氧化性較好的天然物質(zhì)，如：多糖、黃酮、多酚、生物堿、肽類、氨基酸等，已被發(fā)現(xiàn)具有良好的抗運動疲勞效果[5?7]，而目前關于佩蘭的抗運動效果的相關研究還較少。

佩蘭（Eupatorium fortuneiTurcz.）是菊科植物佩蘭的干燥地上部分，具有醒脾開胃、發(fā)表解暑等功效，分布于南方各省，已被衛(wèi)健委認定為保健食品的添加成分，屬于藥食兩用植物，生物安全性較好，其化學成分主要為揮發(fā)油、黃酮、多糖、生物堿及其它酚酸類化合物等[8?9]，目前，對其揮發(fā)油的活性研究較多，而對其黃酮類化合物的研究較少。許冰[10]研究發(fā)現(xiàn)，佩蘭黃酮化合物的結構類型主要以黃酮類為主，如：蘆丁、槲皮素等，存在較多的酚羥基，而該類化合物通常具有較好的抗氧化作用，但因其提取物的雜質(zhì)較多，可能影響相關活性作用。因此，本研究利用大孔樹脂具有機械篩分與分離純化的特性，探討其純化佩蘭黃酮提取物的最佳條件，比較純化前、后產(chǎn)物的抗氧化能力，同時通過動物實驗考察其抗運動疲勞活性，以期為佩蘭黃酮的深入開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

佩蘭 成都市天泰藥房，經(jīng)鑒定為菊科植物佩蘭的莖；蘆丁標準品 中國食品藥品檢定研究院（批號：100080-201811）；西洋參顆粒 湯臣倍健股份有限公司；D101 型大孔樹脂 天津波鴻樹脂科技有限公司；抗壞血酸、鄰苯三酚、三羥基氨基甲烷（Tris）、硫酸亞鐵等 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；乳酸（lactic acid，LA）、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒（glutathione peroxidase,GSH-Px） 南京建城科技有限公司；試驗用水為純化水。實驗動物：SPF 級健康雄性小鼠80 只，體質(zhì)量19～26 g 成都藥康生物科技有限公司[動物使用許可證號：SYXK（川）2020-230]。

KJ-14B06 型破壁機 深圳市康佳電器有限公司；ME203 型電子天平 梅特勒-托利多有限公司；L5 型紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；RE-3000A 型旋轉蒸發(fā)儀 上海越眾儀器設備有限公司；DHZ-C 型恒溫振蕩器 蘇州培英實驗設備有限公司；SJIA-12N-50B 型立式冷凍干燥機寧波雙嘉儀器有限公司；H3-18KR 型離心機 湖南可成儀器設備有限公司；JA-500 型超聲波清洗器濟寧奧超電子設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 佩蘭黃酮提取 佩蘭經(jīng)完全干燥后粉碎，過80 目篩，準確稱取2.0 g 粉碎后樣品置于60 mL 體積分數(shù)為70%乙醇溶液中，在50 kHz 超聲功率下提取30 min，重復提取4 次后，合并提取液離心，上清液經(jīng)減壓蒸發(fā)溶劑濃縮后，冷凍干燥即得佩蘭黃酮粗提物[11]。

1.2.2 動態(tài)吸附與洗脫

1.2.2.1 吸附條件考察 根據(jù)預實驗結果，固定上樣液pH4.0、上樣流速1.0 mL/min，分別考察60 mL 不同質(zhì)量濃度的上樣液（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL）在裝有預處理后樹脂的玻璃層析柱（2.6 cm×25 cm）的吸附率；固定上樣液濃度3.0 mg/mL，上樣流速1.0 mL/min，以鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH，分別考察60 mL 不同pH 上樣液（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0）的吸附率；不同體積的3.0 mg/mL 上樣液（pH4.0）分別于0.5、1.0、2.0 mL/min 流速上樣后，測定泄漏液中黃酮含量，繪制泄露曲線，確定最佳上樣液體積與流速。

式中：m0為上樣液中的黃酮質(zhì)量，mg；me為吸附后流出液中的黃酮質(zhì)量，mg；η 為吸附率，%。

1.2.2.2 洗脫條件考察 根據(jù)預實驗結果，上樣完成后，經(jīng)50 mL 水洗后，采用100 mL 不同體積分數(shù)（50%、60%、70%、80%、90%）乙醇溶液于2.0 mL/min 流速對最佳吸附條件上樣后的樹脂柱進行洗脫，收集洗脫液，測定其黃酮含量，計算不同體積分數(shù)乙醇的洗脫率，考察洗脫液乙醇的最佳體積分數(shù)；采用體積分數(shù)為70%乙醇溶液分別于1.0、2.0、3.0 mL/min 流速洗脫飽和吸附后的樹脂柱，測定不同體積下洗脫液中黃酮含量，繪制洗脫曲線，確定最佳洗脫液體積與流速。

式中：m0為上樣液中的黃酮質(zhì)量，mg；me為飽和吸附后溶液中的黃酮質(zhì)量，mg；cd為洗脫液中黃酮濃度，mg/mL；V2為洗脫液體積，mL；Dd為洗脫率，%。

1.2.3 黃酮純度測定 以蘆丁作為對照品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測定樣品的黃酮含量[12]，橫坐標為不同質(zhì)量濃度的蘆丁溶液，縱坐標為相應溶液的吸光度值，得到標準曲線方程為：y=15.22x+0.014（R2=0.9998），可知在0.005～0.05 mg/L 的濃度范圍內(nèi)線性關系良好。將樣品溶液稀釋后，采用上述分析方法測定其黃酮濃度后，根據(jù)下式計算樣品的黃酮純度（以蘆丁計）。

式中：c 為樣品中的黃酮濃度，mg/mL；V 為樣品體積，mL；D 為稀釋倍數(shù)；m 為樣品的質(zhì)量，mg；W 為樣品中黃酮純度，%。

1.2.4 抗氧化試驗

1.2.4.1 羥基自由基（?OH）清除能力的測定 兩支試管內(nèi)均加入10 mmol/L 硫酸亞鐵溶液1 mL 和10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，分別繼續(xù)加入1 mL 黃酮純化物溶液和VC溶液（陽性對照）后，各加入8.8 mmol/L雙氧水1 mL，置于37 ℃水浴中30 min 后，于510 nm測定吸光度（As），另以純化水作空白對照（A0），按式（4）計算黃酮純化產(chǎn)物對羥基自由基的清除率，提取物溶液考察同上操作[13]。

1.2.4.2 超氧陰離子自由基（O2??）清除能力的測定兩支試管內(nèi)均加入50 mmol/L Tris-HCl 溶液（pH8.2）5 mL 和5 mL 純化水，置于25 ℃水浴25 min，各加入1 mL 黃酮純化物溶液和VC溶液（陽性對照），分別加入25 mmol/L 領苯三酚0.5 mL，混勻后繼續(xù)置于25 ℃水浴5 min 后，各添加8 mmol/L HCl 溶液1 mL 于510 nm 測定吸光度（As），另以純化水作空白對照（A0），按式（4）計算黃酮純化產(chǎn)物對超氧陰離子自由基的清除率，提取物溶液考察同上操作[14]。

1.2.5 動物實驗

1.2.5.1 實驗準備 80 只小鼠經(jīng)適應性喂養(yǎng)5 d 后，隨機平均分為空白對照組、陽性對照組、提取組和純化組。按照《保健食品功能評價要求》并結合相關文獻研究方法[15?16]，動物設置劑量應不超過人體推薦量30 倍，根據(jù)預實驗結果，各組給藥劑量采用最低有效量的30 倍，其中，陽性對照組給予0.3 mg/g（以體重計，下同）的西洋參顆粒；而提取物組和純化物組分別給予0.3 mg/g 佩蘭黃酮提取物與純化物，所有灌胃溶液體積2 mL，空白對照組則灌胃等體積生理鹽水。所有給藥通過灌胃方式，每天1 次，連續(xù)30 d。

1.2.5.2 爬桿實驗 末次灌胃結束后，各組隨機選取10 只小鼠置于玻璃棒上，記錄其肌肉緊張抱緊爬桿至跌落的時間，反復實驗3 次后，將其累計時間記為爬桿時間[17]。

1.2.5.3 LA、BUN、MDA 濃度與SOD、GSH-Px 活力測定 各組其它小鼠置于水中游泳30 min 取出，休息10 min 后，采血離心，通過試劑盒檢測血清中LA 與BUN 濃度，另切取肝臟，按照相關試劑盒使用說明檢測MDA 濃度與SOD、GSH-Px 活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗平行測定5 次，結果表示采用平均值±標準差，通過SPSS 19.0 軟件進行單因素方差（ANOVA）分析，比較組間差異，P<0.05 認為具有顯著性差異，P<0.01 認為具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 動態(tài)吸附純化條件

2.1.1 上樣液濃度選擇 不同上樣液濃度對D101大孔樹脂吸附佩蘭黃酮的影響，如圖1 所示，隨著上樣液濃度的增大，樹脂對黃酮化合物的吸附率不斷減小，其中，當上樣液質(zhì)量濃度大于3.0 mg/L 時，吸附率開始急劇下降。上樣液濃度過高，樣品溶液中其它雜質(zhì)可能與目標物競爭吸附，可使樹脂提前飽和吸附，從而造成部分佩蘭黃酮化合物的泄漏，降低吸附效率[18]，因此確定最佳上樣液濃度為3.0 mg/L。

圖1 上樣液濃度對佩蘭黃酮的吸附率影響Fig.1 Effect of different loading solution concentration on adsorption rate of Eupatorium fortunei Turcz.flavonoids

2.1.2 上樣液pH 選擇 不同上樣液pH 對D101 大孔樹脂吸附佩蘭黃酮的影響，如圖2 所示。從圖2可知，樹脂對黃酮化合物的吸附隨上樣液pH 增大而先增大再減小，當溶液pH 為4.0 時，吸附率達到最大。由于佩蘭黃酮化合物結構的基本母核為2-苯基色原酮，存在較多的酚羥基與羰基，因而在弱酸性環(huán)境下，易呈分子形態(tài)與樹脂中吸附位點相互作用，致使吸附率升高[19]，因此確定最佳上樣液pH 為4.0。

圖2 上樣液pH 對佩蘭黃酮的吸附率影響Fig.2 Effect of different pH value of loading solution on adsorption rate of Eupatorium fortunei Turcz.flavonoids

2.1.3 泄漏曲線 當吸附一段時間后，流出液中黃酮化合物的含量約為上樣液濃度10%時，認為黃酮開始泄漏，繪制不同流速下D101 大孔樹脂的泄露曲線，結果見圖3。從圖3 可知，當上樣流速逐漸增大，泄漏點對應的上樣液體積從約80 mL 減小至40 mL。可能由于大孔樹脂對黃酮化合物的吸附存在膜擴散與粒擴散過程，若流速過快，佩蘭黃酮尚未與樹脂充分相互作用，但上樣流速過慢，使得純化時間較長，不利于推廣應用，綜合考慮吸附效率與純化效果，選擇最佳上樣流速為1.0 mL/min，上樣液體積為60 mL。

圖3 不同流速下大孔樹脂的吸附泄漏曲線Fig.3 Adsorption leakage curve of the macroporous resin in different flow rate

2.2 動態(tài)洗脫純化條件

2.2.1 洗脫液體積分數(shù)選擇 采用一定體積分數(shù)的乙醇溶液作為洗脫液，考察不同體積分數(shù)的乙醇溶液對佩蘭黃酮化合物的洗脫率影響，結果見圖4。從圖4 可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，黃酮化合物的洗脫率逐漸上升，當增大至70%后，開始出現(xiàn)下降。這是由于乙醇的體積分數(shù)越高，其對弱極性的黃酮化合物洗脫能力越強，但體積分數(shù)過高，吸附在樹脂中醇溶性雜質(zhì)也可能被洗脫，造成“競爭解吸”[20]，導致洗脫率下降，因此選擇乙醇溶液體積分數(shù)為70%。

圖4 不同體積分數(shù)的乙醇溶液對洗脫率的影響Fig.4 Effect of different ethyl alcohol concentration on elution rate

2.2.2 洗脫曲線 在不同流速下，采用體積分數(shù)70%乙醇溶液洗脫飽和吸附后的D101 大孔樹脂，收集洗脫液，測定黃酮化合物含量，繪制洗脫曲線，如圖5 所示。隨著洗脫流速的增大，峰形逐漸變寬，且完全洗脫黃酮化合物的乙醇用量增多，而洗脫流速偏低洗脫曲線峰形尖銳且對稱，因此選擇最佳洗脫流速為1.0mL/min，洗脫液體積100 mL。

圖5 不同流速下大孔樹脂的洗脫曲線Fig.5 Elution curve of the macroporous resin at different flow rate

2.3 最佳純化工藝驗證

綜合上述結果，確定D101 大孔樹脂純化佩蘭黃酮化合物的最佳條件：上樣濃度與流速分別為3.0 mg/L和1.0 mL/min，上樣液pH 與體積分別為4.0 與60 mL，洗脫液體積分數(shù)與體積分別為70%與100 mL，洗脫流速為1.0 mL/min。在該最佳純化條件下，佩蘭黃酮化合物在產(chǎn)物中純度由24.2%增大至69.4%，約提高了2.87 倍，韓秋菊等[21]曾采用D101 大孔樹脂純化藁本黃酮，純度約為純化前2.05 倍；李倩[22]則采用D101 大孔樹脂純化新疆圓柏黃酮，純度約為純化前2.79 倍，表明采用D101 大孔樹脂純化佩蘭黃酮工藝可行。

2.4 純化前后產(chǎn)物的抗氧化作用

2.4.1 ?OH 清除率的比較 ?OH 化學性質(zhì)活潑，可與體內(nèi)多數(shù)細胞相互作用，致使發(fā)生脂質(zhì)過氧化、核酸斷裂、蛋白質(zhì)與多糖解聚等不良反應[23]。以VC作陽性對照，考察不同濃度的佩蘭黃酮提取物與純化物對?OH 清除率的影響，結果見圖6。從圖6 可見，佩蘭黃酮的提取物與純化物對?OH 的清除能力均隨濃度的提高而增大，佩蘭黃酮純化物的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）為0.47 mg/mL 低于提取物（0.61 mg/mL），表明純化工藝有利于提高其清除?OH 能力，但在相同濃度下其清除?OH 的作用低于VC。

圖6 不同物質(zhì)對?OH 的清除能力Fig.6 Scavenging ability of different substances on hydroxyl radical

2.4.2 O2??清除率的比較 O2??與體內(nèi)細胞化合物中羥基結合后的產(chǎn)物會破壞細胞的DNA，影響其正常功能。以VC作陽性對照，考察不同濃度的佩蘭黃酮提取物與純化物對O2??清除率的影響，結果見圖7。從圖7 可見，兩種物質(zhì)對O2??的清除能力均隨濃度的提高而增大，但純化物的IC50值（0.42 mg/mL）低于提取物0.52 mg/mL，表明純化后的佩蘭黃酮對O2??的清除能力更強，但二者的清除作用均低于等濃度VC。

圖7 不同物質(zhì)對O2??的清除能力Fig.7 Scavenging ability of different substances on superoxide anion radical

2.5 抗運動性疲勞作用

2.5.1 爬桿時間 小鼠爬桿是全身能量消耗性運動，因此可通過觀察不同組別小鼠的爬桿時間，衡量其運動耐力，結果見表1。從表1 可見，與空白對照組相比，提取組與純化組小鼠的爬桿時間分別平均延長1.2min 和2.4 min，具有顯著差異（P<0.05，P<0.01），表明佩蘭黃酮有助于緩解機體運動疲勞，延長運動時間，而純化組小鼠的爬桿時間較提取組延長，具有極顯著差異（P<0.01），表明樹脂純化工藝有利于提高佩蘭黃酮產(chǎn)物的活性，但二者爬桿時間均低于陽性對照組。

表1 不同組小鼠的爬桿時間 （n=10）Table 1 The climbing time in mice of different groups (n=10)

2.5.2 體內(nèi)LA 與BUN 濃度 LA 是在機體劇烈運動后，肌肉耗氧加劇體內(nèi)供氧不足的條件下，血糖經(jīng)糖酵解生成的產(chǎn)物。體內(nèi)乳酸含量越高，生理環(huán)境pH 下降越快，從而影響骨骼肌的收縮強度，產(chǎn)生疲勞感[24]。從表2 結果可見，與空白對照組相比，提取組與純化組小鼠的血清中LA 平均濃度分別降低1.17、2.43 mmol/L，具有顯著差異（P<0.05，P<0.01），且純化組小鼠的LA 平均濃度較提取組下降約1.26 mmol/L，具有顯著性差異（P<0.05），表明純化后的佩蘭黃酮更有利于延緩體內(nèi)LA 的生成或加速其代謝，但其LA 濃度仍高于陽性對照組。

BUN 作為劇烈運動后，蛋白質(zhì)的分解代謝產(chǎn)物，可用于評價機體的疲勞狀態(tài)。從表2 結果可知，與空白對照組相較，提取組與純化組小鼠的血清中BUN 平均濃度分別降低0.61、1.34 mmol/L，差異顯著（P<0.05，P<0.01），同時純化組小鼠的BUN 平均濃度較提取組下降約0.73 mmol/L，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明純化后的佩蘭黃酮更有利于減少體內(nèi)BUN 的積累，但其BUN 濃度仍高于陽性對照組。

表2 不同組小鼠的LA 與BUN 濃度（n=10）Table 2 The contents of LA and BUN in mice of different groups (n=10)

2.5.3 MDA 濃度與SOD、GSH-Px 活性 運動性疲勞的產(chǎn)生主要源于劇烈運動下，體內(nèi)產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基，同時血漿脂質(zhì)過氧化物濃度上升，從而誘導體內(nèi)蛋白質(zhì)氧化，生成MDA。MDA 濃度過高導致組織和細胞的氧化損傷，使得體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡[25]。從表3 可見，與空白對照組相較，提取組與純化組小鼠的血清中MDA 平均濃度分別降低0.31、0.74 mmol/L，具有顯著性差異（P<0.05，P<0.01），而純化組小鼠MDA 平均濃度較提取組下降約0.43 mmol/L，表明純化后的佩蘭黃酮有助于減小體內(nèi)氧化程度，避免MDA 的生成，但與陽性對照組相較，仍明顯偏高。

SOD 與GSH-Px 是重要的抗氧化酶，其中SOD可與超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應生成過氧化氫和氧氣，而GSH-Px 可將過氧化氫或其它有機過氧化物還原成水和醇，從而減緩體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應，實現(xiàn)阻斷自由基的的氧化破壞過程[26]。從表3 可知，與空白對照組相較，提取組小鼠的SOD 與GSHPx 平均活力分別提高22.27、24.64 U/mL，具有顯著性差異（P<0.05）；而純化組小鼠的SOD 與GSHPx 平均活力分別提高42.21、54.45 U/mL，具有極顯著性差異（P<0.01），表明純化后的佩蘭黃酮更有利于增強體內(nèi)SOD 與GSH-Px 活性，但上述結果均低于陽性對照組。

表3 不同組小鼠的MDA 濃度和SOD、GSH-Px活性（n=10）Table 3 MDA content and SOD,GSH-Px activity in mice of different groups (n=10)

3 結論

本研究考察D101 大孔樹脂純化佩蘭黃酮的最佳條件，并比較了不同產(chǎn)物的抗氧化與抗運動疲勞活性。試驗結果表明，當上樣濃度與流速分別為3.0 mg/L和1.0 mL/min，上樣液pH 與體積分別為4.0 與60 mL，洗脫液體積分數(shù)與體積分別為70%與100 mL，洗脫流速為1.0 mL/min 時，佩蘭黃酮化合物在產(chǎn)物中純度由24.2%增大至69.4%，約為純化前2.87 倍。佩蘭黃酮純化物對?OH 與O2??的IC50值分別為0.47、0.42 mg/mL 均高于提取物，表明采取大孔樹脂純化工藝有利于提高佩蘭黃酮產(chǎn)物的抗氧化能力。純化后的佩蘭黃酮能夠延長小鼠的運動時間，減少其體內(nèi)LA 與BUN 的生成，并有助于增強體內(nèi)SOD 與GSH-Px 的活力，進而降低MDA 的生成，從而有利于提高動物的運動耐力。但純化后佩蘭黃酮化合物的種類仍有待進一步分離鑒定，以明確其具體抗運動疲勞機制。