馬齒莧多不飽和脂肪酸成分分析及對HepG2 細胞脂質堆積的影響

李冠文，王輝敏，楊金梅，陳 超，張娜郡，秦 楠，劉 星

（山西中醫藥大學中藥與食品工程學院，山西榆次 030619）

非過量飲酒以及其他損害肝臟因素造成肝細胞脂肪沉積變性等特征的綜合病癥被稱之為非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）[1]。全球肥胖的流行顯著增加了NAFLD 的患病率，使NAFLD 成為西方國家最常見的慢性肝病病因，據統計肥胖成年人病發率已達到50.7%[2?3]，長此以往NAFLD 將會與糖尿病、高胰島素血癥、高血壓等病癥結合逐漸演變為脂肪性肝炎，從而增加肝硬化、門靜脈高壓癥以及肝癌等疾病高發風險[4?6]。近年來國內外對NAFLD 的治療方式逐漸從對藥物的全部依賴轉變為調整飲食習慣[7?10]，有利于功能食品以及藥食同源中藥材的長遠發展。

脂肪酸（fatty acid，FA）是具有長的碳氫鏈和1 個羧基末端的有機化合物的總稱。自然界中約有70 多種不同種類的脂肪酸，其碳鏈長度范圍為C12～C18。按照脂肪酸碳鏈結構中雙鍵數的多少可將其劃分為飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）、單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）和多不飽和脂肪酸PUFAs。近年來研究發現，PUFAs在抗炎、抗氧化、抗癌、調節血脂、增強免疫、改善記憶力以及促進生長發育等方面具有顯著的效果[11?14]。石計朋[15]通過實驗研究推測ω-3 系列PUFAs 可以通過激活PI3K/AKT/β-catenin 信號軸間接促進神經細胞的增殖和遷移、抑制神經細胞的凋亡，從而發揮對受損腦組織和神經細胞的治療作用。PUFAs 同時具有抗炎和炎癥消退作用，陳英杰等[16?17]通過酶聯免疫吸附測定法檢測血清中腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1、IL-6 等指標判斷PUFAs 是否對重型顱腦損傷患者炎癥反應以及神經細胞有影響，結果表明ω-3 系列PUFAs 可以減輕傷后發生炎癥反應，減少神經膠質和神經元細胞損害，從而起到抗炎和神經保護作用。Ayumi 等[18]研究認為PUFAs具有抗癌、抗腫瘤作用是由于腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）中的基質金屬蛋白酶（MMP）-9 在體內外均會受到ω-3 系列PUFAs 的抑制造成的。胡慧蕓[19]認為PUFAs 具有顯著的降血脂功效，并將實驗室制備的PUFAs 軟膠囊通過動物試驗研究進行驗證，證實了PUFAs 可以顯著降低混合型高脂血癥大鼠的血脂水平、明顯減輕混合型高脂血癥大鼠的炎癥反應，其作用機制可能分別與脂質代謝相關基因HMGR、PPARα、SREBP-1c 的表達有關、與調節驗證信號通路AMPK/SIRT1/NF-κB 及VCAM-1 的表達有關。而馬齒莧作為藥食同源植物資源之一，性味酸寒，具有清熱解毒，涼血止血等功效，現代藥理學作用研究也表明馬齒莧在抗炎、抗氧化、抗腫瘤等方面有顯著效果[20]，由于近年來國內外學者對藥食同源馬齒莧中藥材中的脂肪酸成分研究較少以及國內對PUFAs作用逐步重視，因此本試驗基于國內外各學者以及本實驗室人員前期試驗基礎對馬齒莧脂肪酸成分進行深入創新研究。

本試驗通過對比馬齒莧全草油和純化油脂肪酸成分相對含量，明確純化油的純化程度，并將純化油作用于油酸誘導成功的脂質堆積肝癌細胞模型，在檢測血脂指標HDL-C、LDL-C、TC、TG 水平變化后明確馬齒莧純化油對脂質沉積的影響，進而初探馬齒莧純化油中PUFAs 的降脂能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮馬齒莧全草 山東濱州種植基地；人肝癌細胞HepG2 上海泛柯實業有限公司；MTT、HDLC、LDL-C、TC、TG 試劑盒 南京建成生物科技有限公司；石油醚、尿素、無水乙醇、異丙醇、鹽酸、無水硫酸鈉、正己烷、濃硫酸（以上試劑均為分析純）、甲醇（色譜純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；胰酶、優級胎牛血清、DMED 高糖培養基、牛血清白蛋白（不含脂肪酸）、多聚甲醛固定液 北京索萊寶科技有限公司；蘇丹紅、油酸（分析純） 上海麥克林生化科技有限公司。

YM-828H 多功能加熱破壁料理機 中山市優盟電器有限公司；SB25-120 超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；SY-2000 旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；GZX-9140MBE 電熱鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；AR223CN 電子天平 奧豪斯儀器有限公司；Agilent Technologies 7890B/5977B 氣相色譜-質譜聯用儀鄭州澤銘科技有限公司；BDS400 倒置生物顯微鏡重慶奧特光學儀器有限責任公司；SPECTRA MAX190酶標儀 北京生原誠業科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 馬齒莧全草油的制備 將山東濱州種植基地的新鮮馬齒莧全草洗凈、破壁后適當瀝干。準確稱取10.00 g 左右瀝干物于平底燒瓶中，按照料液比1:22（m:V）加入60～90 ℃石油醚220 mL，并于超聲溫度70 ℃、超聲時間61 min、超聲功率500 W條件下進行提取，提取液濃縮（比例為49:1，V:V）干燥恒重后即得馬齒莧全草油樣品[21]。

1.2.2 馬齒莧純化油的制備 準確稱取12.00 g 尿素于60 ℃水浴條件下溶于120 mL 95%乙醇溶液中，即得樣液A。將樣液A 趁熱迅速置于1.00 g 馬齒莧全草油樣品中使樣品溶解，在60 ℃水浴條件下持續攪拌10 min 后冷卻至室溫，置于?20 ℃條件下進行下一步結晶，6 h 后取出迅速抽濾，將濾液旋轉蒸發后恒重，即得浸膏物。將浸膏物中加入5 mL 蒸餾水，用HCl 調節pH 至5～6 后加10 mL 石油醚進行萃取，用蒸餾水洗滌石油醚層直至尿素試紙檢測無尿素即可停止，無水硫酸鈉干燥4 h 后，即可得到馬齒莧純化油[21]。

1.2.3 馬齒莧脂肪酸純化前后組成分析

1.2.3.1 馬齒莧全草油、純化油樣品的甲酯化 稱量馬齒莧全草油、純化油樣品各100 mg，向其中各依次加入3 mL 正己烷和2 mL 5% H2SO4-甲醇溶液，搖勻3 min 后置于60 ℃條件下水浴30 min，再次各加入3 mL 蒸餾水，搖勻2 min，等分層清晰后取上清液，經0.45 μm 有機濾膜過濾后備用。

1.2.3.2 氣相色譜-質譜聯用儀檢測條件 GC 條件：PEG-20M 彈性石英毛細管柱，30 m×0.25 m×0.25 μm，載氣為N2，載氣流速為0.8 mL·min?1，程序升溫從180 ℃開始（保持2 min），以3 ℃·min?1升溫到230 ℃，保持10 min，進樣口溫度250 ℃，出樣口溫度200 ℃，檢測電壓350 V，不分流進樣。

MS 條件：EI 離子源，電子能量70 eV，發射電流200 μA，掃描范圍20～550 amu，全離子掃描。

1.2.4 馬齒莧純化油對HepG2 細胞增殖和脂質堆積的影響

1.2.4.1 不同馬齒莧純化油濃度對HepG2 細胞存活率的影響 將培養的HepG2 細胞用胰酶消化后接種于96 孔板中，使每孔細胞數量大致為1×104個后，置于CO2培養箱貼壁培養24 h，各個孔分別加入100 μL 用5% BSA 配制的濃度分別為0、10、20、40、60、80、100、200、400、800、1600 μg/mL 的馬齒莧純化油，最后用完全培養基補足體積，使得每孔總體積為200 μL，各給藥濃度設置5 個重復。置于CO2培養箱中作用24 h 后，參照MTT 試劑盒用法測定不同馬齒莧純化油濃度所對應的細胞存活率。

1.2.4.2 油紅O 染色法觀察油酸誘導的HepG2 細胞內脂滴形成情況 將正常培養的HepG2 細胞用胰酶消化后接種于6 孔板中，加入培養基正常培養24 h后棄去培養液并用PBS 清洗。將6 孔板分為兩組：0.5%不含脂肪酸的牛血清白蛋白（fatty acid-free bovine serum albumin，BSA）組和0.5 mmol/L 油酸（使用0.5% BSA 配制而成）組，各設置3 個復孔。各孔板中加入對應組別溶液3 mL，放入培養箱培養24 h。取出6 孔板棄去培養液，用PBS 清洗2 遍后每孔加入2 mL 4%多聚甲醛細胞固定液固定30 min。固定結束后棄去固定液，用PBS 清洗2 遍，靜置30 s，再向每孔加入2 mL 現配的60%異丙醇滴洗20～30 s，棄去異丙醇后靜置1 min。之后每孔加入油紅O 染色液（油紅原液:蒸餾水=3:2，V:V）2 mL，密閉染色20 min 后將染色液棄去，加入2 mL 60%異丙醇分化10 s，靜置1 min，再加入PBS 清洗2 遍，各孔再加入3 mL PBS 即可置于倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4.3 造模后不同組別細胞內血脂指標水平變化情況 將正常培養的HepG2 細胞用胰酶消化后接種于96 孔板中，置于CO2培養箱貼壁培養24 h，并將接種細胞的孔分為5 組（每組設置5 個重復）：對照組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。造模：對照組中加入0.5% BSA 溶液200 μL，其余組別各加入200 μL 0.5 mmol/L 的油酸進行誘導造模，放入培養箱培養24 h。給藥：取出細胞后棄去溶液并用PBS 清洗，在對照組和模型組中各加入0.5%BSA 溶液200 μL，低、中、高劑量組分別加入60、80、100 μg/mL 的馬齒莧純化油各200 μL，置于CO2培養箱中作用24 h 后取出，并參照HDL-C、LDL-C、TC、TG 各試劑盒說明書進行濃度測定。

1.3 數據處理

各組數據均采用Graphpad Prism V6.01 軟件進行分析并通過t檢驗的方法進行統計學分析，P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 馬齒莧脂肪酸純化前后成分對比

對馬齒莧脂肪酸成分進行分析有利于掌握每種成分的相對含量，且可以明確富集純化的程度，從而得到馬齒莧脂肪酸富集前后PUFAs 的純度變化。由表1 脂肪酸成分分析表可以得知，馬齒莧全草油中含有的PUFAs 相對含量為27.6104%，PUFAs 種類主要為亞油酸和α-亞麻酸。除PUFAs 之外還有SFA：月桂酸、肉豆蔻酸、十五碳酸、棕櫚酸、花生酸、十七碳酸、硬脂酸、二十二碳酸、二十三碳酸和二十四碳酸共10 種，相對含量總和為67.1861%；MUFA：棕櫚油酸和油酸共兩種，相對含量總和為5.2035%。而馬齒莧純化油中的PUFAs 相對含量高達73.9015%，其中的PUFAs 種類除亞油酸和α-亞麻酸外還增添了γ-亞麻酸，在全草油中未檢測出此物質的原因可能是全草油中γ-亞麻酸含量低于儀器檢測下限，而純化后馬齒莧純化油中的γ-亞麻酸濃度明顯升高，高于檢測下限使得此物質被檢出。而且馬齒莧純化油中SFA 相對含量總和為18.7997%，MUFA 相對含量總和為7.2988%，與馬齒莧全草油相比，除MUFA 中的油酸外，馬齒莧純化油中各SFA以及MUFA 相對含量均有不同程度降低，且馬齒莧純化油中已經無二十三碳酸出現。因此，由表1 可以得出結論：馬齒莧純化油PUFAs 純度（73.9015%）高于全草油PUFAs 純度（27.6104%），且高出46.2911%，純化后純度基本達到實驗預期設想，因此可以純化油進行后續PUFAs 的體外降脂作用研究。

表1 馬齒莧脂肪酸成分含量分析Table 1 Analysis of fatty acid composition in Portulaca oleracea

2.2 不同馬齒莧純化油濃度對細胞存活率的影響

不同給藥濃度對人肝癌HepG2 細胞有一定的影響，在一定程度上可能對細胞造成毒性作用，因此本試驗將采用MTT 法考察不同馬齒莧純化油濃度對細胞存活率的影響，從而確定適宜細胞生長的純化油濃度，避免在后續試驗過程中濃度太高對細胞造成毒性作用。如圖1 所示，不同濃度組別與對照組相比細胞存活率均極顯著降低，當馬齒莧純化油濃度為0～10 μg/mL 時，細胞存活率由100%±1.61%緩慢下降為88.57%±2.88%，濃度在20～100 μg/mL 內時，存活率由86.11%±7.65%緩慢下降為78.89%±3.93%，而當純化油濃度處于200～1600 μg/mL 時，細胞存活率急劇下降，由63.50%±1.72%下降至最低點20.90%±4.87%。結果表明，不同濃度馬齒莧純化油對細胞存活率影響不同，10～60 μg/mL 純化油濃度范圍內雖然細胞存活率較高，但是此范圍內細胞存活率波動幅度不如60～100 μg/mL 濃度范圍內波動幅度穩定，為排除其他因素干擾試驗最終結果且綜合考慮細胞存活率在80%左右以及細胞存活率穩定性較好等情況，本試驗選用純化油濃度在60～100 μg/mL左右范圍進行后續試驗。

圖1 不同馬齒莧純化油濃度對細胞存活率的影響Fig.1 Effect of different Portulaca oleracea purified oil concentration on cell viability

2.3 油紅O 染色法觀察油酸誘導的HepG2 細胞內脂滴形成結果

油紅O 為脂溶性染料，在脂肪中溶解性較強，可特異性與細胞以及動物組織內TG 等中性脂肪著色，因此本試驗采用油紅O 染色法來判斷細胞脂質堆積模型的建立情況。本試驗參照張蕾等[22]的方法采用0.5 mmol/L 油酸誘導肝癌細胞脂肪變性模型。由圖2 可知，經過油紅O 染色后對照組的HepG2 細胞形態正常，細胞呈現不規則形狀且細胞邊緣出現鮮少的粉色脂滴。與對照組相比，模型組細胞在視野范圍內可大致觀察到細胞的形態基本保持正常，并且在細胞外側呈現大量紅色粒狀脂滴。表明使用0.5 mmol/L油酸誘導肝細胞脂肪變性造模成功，可以采用此油酸濃度進行后續試驗。

圖2 對照組和模型組細胞油紅 O 染色情況（40×）Fig.2 Oil red O staining of control group and model group cells (40×)

2.4 造模后不同組別細胞內血脂指標水平變化結果

脂肪是構成身體細胞的重要成分之一，在人體腦神經、肝臟、腎臟等重要器官中含有很多脂肪。本試驗選用HepG2 肝癌細胞進行脂質堆積模型的建造而非選用其他脂肪細胞的原因如下：肝臟為HDLC、LDL-C、TC、TG 合成的重要器官；建造脂肪變性細胞模型時大部分學者均以HepG2 肝癌細胞作為對象[22?23]。

本試驗為了解不同濃度的馬齒莧純化油對HepG2細胞內脂質堆積的影響，在明確純化油濃度范圍為60～100 μg/mL 后，將馬齒莧純化油濃度劃分為低、中、高劑量（即60、80、100 μg/mL）進行細胞內血脂指標HDL-C、LDL-C、TC 以及TG 濃度的測定。

HDL-C 為強大的血管擴張劑，人體內此濃度的升高有利于預防冠心病等發生，對心血管具有保護作用[24]。由表2 可知，與對照組相比，模型組HDLC 濃度由0.2330 mmol/L 急劇降為0.0100 mmol/L（P<0.01），而LDL-C、TC、TG 濃度均有極顯著提高（P<0.01），再次證實HepG2 細胞脂質堆積模型被成功建立。同時隨著給藥濃度的升高，實驗組HDLC 濃度由0.0100 mmol/L 逐漸升高到0.1754 mmol/L（低劑量組）、0.2178 mmol/L（中劑量組）以及0.4325 mmol/L（高劑量組），且均具有極顯著差異（P<0.01），初步表明了馬齒莧純化油中的PUFAs 可以促進HDL-C 合成，此結果與Xie 等[25]學者所得結論“PUFAs 可通過調節參與肝HDL-C 合成的關鍵基因、蛋白和mRNA 表達促進HDL-C 合成”相一致。

表2 HepG2 細胞內HDL-C、LDL-C、TC、TG 濃度結果Table 2 Results of HDL-C,LDL-C,TC and TG in HepG2 cells

LDL-C 是一種運送血液中脂類的一種脂蛋白顆粒，它可以將脂類物質從肝臟運送至血管內皮細胞中從而有效減少臟器內脂質堆積，但是LDL-C 過高會導致過量脂類被運送后沉積于血管內皮細胞造成動脈粥樣硬化等疾病，因此適量的LDL-C 可以有效降低冠心病、血栓等心腦血管疾病發生率[24,26]。由表2結果可以得出：與模型組相比，高劑量組LDL-C 濃度極顯著降低（P<0.01），其余組別與模型組相比濃度無顯著性差異；而與對照組相比，中、高劑量組LDLC 濃度無顯著差異。結果表明高劑量馬齒莧純化油可以通過顯著降低LDL-C 濃度緩解細胞脂質堆積作用，從而使細胞恢復正常生理活動。

TC 是人體血液中所有脂蛋白中所含膽固醇的總和，TC 與人類冠心病、腦卒中、動脈粥樣硬化等疾病息息相關，TC 濃度的減少表明人體內膽固醇堆積較少，一定程度上此物質的降低有利于減少脂質堆積從而達到降血脂作用。由表2 可知，中、高劑量組馬齒莧純化油可通過極顯著降低模型組TC 濃度來緩解脂質堆積作用（P<0.01），但中、高劑量組給藥后的TC 濃度極顯著高于對照組（P<0.01）。結果表明中、高劑量馬齒莧純化油給藥后雖可以緩解細胞脂質堆積但卻無法達到HepG2 細胞正常TG 濃度水平，猜測可能是給藥時間太短造成的。

TG 為人體供能源之一，此物質在肝臟代謝后可被人體吸收成為營養物質，但過多的TG 在體內聚集會造成高脂血癥、非酒精性脂肪肝等，因此適量的TG 可增加人體對營養物質的吸收能力，從而保障人體內分泌平衡[27]。從表2 可以看出，低、中、高劑量組TG 濃度與模型組相比均呈現出極顯著降低現象（P<0.01）且高劑量組TC 濃度與對照組濃度相比無顯著變化，證實馬齒莧純化油中PUFAs 可以通過此條途徑緩解模型組脂質堆積現象，且高劑量純化油給藥后可以使細胞恢復至原始TG 濃度水平。

綜上所述，高劑量組（100 μg/mL）馬齒莧純化油濃度對各項血脂指標均有極顯著影響，且與對照組正常HepG2 細胞內TG、LDL-C 濃度相比無顯著變化，因此可以認為此濃度的馬齒莧純化油對肝臟內脂質堆積具有較好的緩解效果。

3 討論與結論

經過本試驗對馬齒莧全草油和純化油脂肪酸成分的對比，發現馬齒莧全草油中PUFAs 相對含量為27.6104%，經富集純化后的馬齒莧純化油中的PUFAs含量高達73.9015%，表明尿素包合法富集純化馬齒莧全草油是有顯著效果的。而敬思群等[28]試驗結果表明尿素包合法純化馬齒莧全草油后PUFAs 含量可由68.12%升高到91.35%，本試驗結果PUFAs 含量73.9015% <91.35%，造成此現象的原因可能是本試驗耗材選用新鮮馬齒莧而非馬齒莧干藥材；選用馬齒莧的產地不同[29]；提取馬齒莧全草中PUFAs 時所用溶劑、技術不同造成的[30?31]。將馬齒莧純化油應用于HepG2 細胞，發現經100 μg/mL 馬齒莧純化油干預后細胞內HDL-C、LDL-C、TC、TG 濃度與模型組相比均有顯著變化，其中HDL-C 濃度顯著升高，其余濃度顯著降低，初步表明馬齒莧純化油對脂質堆積具有緩解作用，為下一步深入研究降脂機制等的試驗安排奠定了較好的實踐基礎。