冬小麥品種(系)品質(zhì)相關(guān)基因的分子標記檢測

昝香存，常瑩瑩，韓留鵬，高 崇，趙明忠，董海濱，齊學禮，王永霞，胡 琳

(河南省農(nóng)業(yè)科學院作物分子育種研究院/河南省小麥生物學重點實驗室/河南省麥類種質(zhì)資源創(chuàng)新與改良重點實驗室，河南鄭州 450002)

面條是中國傳統(tǒng)主食之一，其品質(zhì)主要受冬小麥蛋白質(zhì)含量、面筋強度、面粉色澤、多酚氧化酶(PPO)活性、淀粉特性以及1BL·1RS易位的影響。其中，小麥的面筋強度主要受高分子量谷蛋白亞基、1B/1R易位等因素的影響。位點上的5+10亞基以及位點上的7+8亞基對面筋強度影響較大，利用Dx5和By8標記可準確快速地檢測小麥品種中是否含有5+l0和7+8優(yōu)質(zhì)亞基。1BL·1RS易位在中國小麥育種中廣泛應用，但1BL·1RS易位易導致面筋強度減弱，對面條加工品質(zhì)的負面效應明顯，利用H2O分子標記可快速、準確地檢測1BL·1RS易位的存在。

黃色素含量和PPO活性是影響面制品色澤及其穩(wěn)定性的主要因素。其中，黃色素含量受多個基因位點的調(diào)控，其中位于第七部分同源群上的QTL效應最大。He等開發(fā)了黃色素含量基因標記YP7A和YP7B，利用前者可有效區(qū)分小麥7A染色體上基因的等位變異(與高黃色素含量相關(guān))和(與低黃色素含量相關(guān))，利用后者可有效區(qū)分小麥7B染色體上位點的等位變異(與中等黃色素含量相關(guān))和(與低黃色素含量相關(guān))、(與高黃色素含量相關(guān))。蘆 靜等研究發(fā)現(xiàn)，用YP7A標記檢測出的等位變異和與黃色素含量顯著相關(guān)，而用YP7B標記檢測出的等位變異和與黃色素含量沒有表現(xiàn)出顯著相關(guān)，因而，YP7A標記可作為黃色素含量的輔助選擇標記。PPO活性是引起面制品顏色褐變的主要因素，其受環(huán)境和基因型的共同影響，但基因型是其主要的影響因素。控制PPO活性的主效基因位于2AL和2DL染色體上，位于2AL染色體上基因的效應明顯大于位于2DL染色體上的基因。利用Sun等開發(fā)的共顯性STS標記PPO18可有效區(qū)分2AL染色體上基因的等位變異和。

分子標記輔助選擇是品質(zhì)遺傳改良的有效途徑。胡鳳靈等利用、、、、 1BL·1RS、和基因的特異性分子標記對221份中國冬小麥品種(系)進行檢測，明確了高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)、低分子量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)相關(guān)基因的等位變異以及1BL·1RS易位的分布頻率。胡鳳靈等和楊芳萍等利用分子標記YP7A分別檢測了基因的等位變異在冬小麥品種(系)中的分布頻率。肖永貴等利用基因的功能標記PPO18、PPO29和PPO16檢測311份中國冬小麥品種，發(fā)現(xiàn)中國冬麥區(qū)低PPO活性基因和的分布頻率相對較高，分別為58.2%和59.8%。定期利用分子標記檢測育成品種(系)中品質(zhì)相關(guān)基因的分布情況，可為品質(zhì)育種研究和親本選配提供有價值的信息，加快小麥品質(zhì)改良的步伐。本研究利用Dx5、By8、YP7A、PPO18和H2O特異性分子標記，對2010年以來中國冬小麥主產(chǎn)省份育成的266份小麥品種(系)進行檢測，了解10年來育成小麥品種(系)的面筋強度、PPO活性、黃色素含量及1BL·1RS易位相關(guān)基因的分布情況，以期為優(yōu)質(zhì)面條小麥新品種選育和選配具有優(yōu)質(zhì)基因或聚合一定優(yōu)質(zhì)基因的親本提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料共266份，其中河南166份、安徽15份、江蘇16份、陜西14份、山東23份、河北20份，北京12份(表1)，于2019年秋種植在河南省農(nóng)科院試驗基地。供試材料大部分為2010年以后審定的品種(系)，少部分為正在參加各類區(qū)域試驗的新品系及自主選育的高代品系。

表1 266份冬小麥品種(系)品質(zhì)相關(guān)基因的分子標記檢測結(jié)果Table 1 Identification of quality-related genes in 266 winter wheat cultivars(lines) using molecular markers

(續(xù)表2 Continued table 2)

(續(xù)表2 Continued table 2)

1.2 基因組DNA的提取

于小麥越冬期進行田間葉片取樣。用CTAB法提取植株葉片的基因組DNA。用NanoDrop紫外分光光度計檢測DNA的濃度，稀釋為40～60 ng·μL后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分子標記的檢測

Dx5、By8、H2O、YP7A和PPO18標記的引物序列及其他相關(guān)信息見表2。PCR反應體系均為10 μL，包括上、下游引物(20 mmol·L)各0.2 μL，PCR Mix 5 μL，DNA模板(50 ng·μL)1 μL，用ddHO補足至10 μL。Dx5、By8、H2O、PPO18和YP7A標記的PCR擴增程序參考相應的文獻。所有引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

表2 檢測目標基因等位變異所用的標記及其引物信息Table 1 Markers and primers information for detecting alleles of the target genes

2 結(jié)果與分析

2.1 Dx5基因的分子標記檢測結(jié)果

用標記Dx5對供試材料的基因進行檢測，部分材料的檢測結(jié)果如圖1A所示。266份材料中，有85份可擴增出450 bp的特異性片段，說明這85份材料中含有基因，分布頻率為 32.0%(表1和表3)。基因在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率存在較大差異，分布頻率從高到低依次為山東(60.9%)>河北 (45.0%)>江蘇(37.5%)>陜西(28.6%)>河南 (27.7%)>北京(25.0%)>安徽(20.0%)(表3)。

2.2 By8基因的分子標記檢測結(jié)果

用標記By8對供試材料的基因進行檢測，部分材料的檢測結(jié)果如圖1B所示。266份材料中，有77份材料可以擴增出527 bp的特異性片段，說明這77份材料含有基因，分布頻率為28.9%。基因在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率從高到低依次為山東(65.2%)>河北 (45.0%)>江蘇(31.3%)>北京 (25.0%)>陜西 (21.4%)>河南(24.1%)>安徽(13.3%)(表3)。

2.3 1BL·1RS易位的分子標記檢測結(jié)果

用標記H2O對供試材料的1BL·1RS易位進行檢測，部分材料的檢測結(jié)果如圖1C所示。266份材料中，有122份材料可擴增出1 598 bp的特征條帶，說明這122份材料含有1BL·1RS易位，分布頻率為45.9%，而其他144份材料不含1BL·1RS易位。1BL·1RS易位在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率不同，分布頻率從高到低依次為江蘇(81.3%)>河南(57.2%)>陜西(35.7%)>安徽(20.0%)>河北(15.0%)>山東(8.7%)>北京(8.3%)(表3)。

2.4 Ppo-A1基因的分子標記檢測結(jié)果

用共顯性標記PPO18對供試材料的基因進行檢測，部分材料的檢測結(jié)果如圖1D所示。266份材料中，有144份材料可擴增出685 bp的特征條帶，說明這144份材料含有高PPO活性等位基因，分布頻率為54.1%；有122份材料可擴增出876 bp的特征條帶，說明這122份材料含有低PPO活性等位基因，分布頻率為45.9%。和等位基因在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率存在較大差異，其中，的分布頻率從高到低依次為山東(95.7%)>北京(83.3%)>河北(75.0%)>陜西(42.9%)>江蘇 (37.5%)>安徽(40.0)>河南(34.3%)，在不同小麥主產(chǎn)省份的分布頻率高低排序則相反(表3)。

A：標記Dx5的PCR擴增結(jié)果；B：標記By8的PCR擴增結(jié)果；C：標記H2O的PCR擴增結(jié)果；D：標記PPO18的PCR擴增結(jié)果。M：DL2000；1：徐麥15158；2：囤麥259；3：鄭麥1833；4：新麥45；5：西農(nóng)529；6：洛麥40；7：偉隆169；8：鄭麥0943；9：鄭麥379；10：華麥2801；11：豐德存麥21；12：石優(yōu)4399；13：濟麥38。圖2同。

2.5 Psy-A1基因的分子標記檢測結(jié)果

用共顯性標記YP7A對供試材料的基因進行檢測，部分材料的檢測結(jié)果如圖2所示。266份材料中，有203份材料可擴增出194 bp的特征條帶，說明這203份材料含有高黃色素含量等位基因，分布頻率為76.3%；有63份材料可擴增出231 bp的特征條帶，說明這63份材料含有低黃色素含量等位基因，分布頻率為23.7%。和等位基因在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率存在較大差異， 其中，的分布頻率從高到低依次為山東(100.0%)>北京(83.3%)>河北 (80.0%)>河南(77.1%)>安徽(66.7)>江蘇 (56.3%)>陜西(50.0%)，在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率高低排序則相反(表3)。

表3 品質(zhì)相關(guān)基因等位變異和1B/1R易位在不同小麥主產(chǎn)省份的分布頻率Table 3 Distribution frequencies of alleles and 1B/1R translocation of quality-related genes in major wheat producing provinces

圖2 標記YP7A對部分小麥品種(系)的PCR檢測結(jié)果

2.6 聚合優(yōu)質(zhì)等位基因材料的分布

由表4可知，在266份材料中，聚合多種優(yōu)質(zhì)基因的品種(系)較少，其中攜帶///基因組合且不含1BL·1RS易位的材料僅有2份，分布頻率為0.8%，分別為藁優(yōu)5766和鄭石9170；攜帶///基因組合且不含1BL·1RS易位的材料有23份，分布頻率為8.7%。其中，來自河南的有8份，來自山東的有8份，來自河北和北京的分別有6份；攜帶//基因組合但含1BL·1RS易位的材料有12份，分布頻率為4.5%。

表4 聚合品質(zhì)性狀優(yōu)異等位基因的小麥品種(系)Table 4 Cultivars(lines) with excellent gene combinations for quality traits

3 討 論

3.1 Dx5、 By8基因和1BL·1RS易位在品質(zhì)育種中的應用

面筋強度是影響面條品質(zhì)的主要因素之一。和對面筋強度的貢獻比較大。本研究檢測的266份小麥品種(系)中，和的分布頻率分別為32.3%和28.9%，與胡鳳靈等的研究結(jié)果相比，的分布頻率稍有上升，的分布頻率略有下降。和在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率差異均較大，在山東、河北品種(系)中的分布頻率相對較高，分別為60.9%和65.2%、45.0%和45.0%，說明近10年來山東和河北在小麥品質(zhì)育種中注重優(yōu)質(zhì)亞基基因和的應用和 選擇。

1BL·1RS易位對面筋強度有負面影響，但1BL·1RS易位系在抗病、豐產(chǎn)、耐旱以及花后葉片保持綠色等方面具有明顯的優(yōu)勢，備受育種家的青睞。因此，1BL·1RS易位在中國乃至世界范圍內(nèi)被廣泛利用。本研究檢測的266份小麥品種(系)中，含有1BL·1RS易位的品種(系)占供試材料的 45.9%，與前人的研究結(jié)果相比，呈增加趨勢，說明近10年來 1BL·1RS易位系在中國小麥育種中仍被廣泛應用。本研究結(jié)果表明， 1BL·1RS易位品種(系)在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率存在較大差異，其中江蘇和河南的材料中1BL·1RS易位的分布頻率較高，而在河北、山東和北京的材料中分布頻率較低，這可能與本研究收集的材料有關(guān)，也可能與育種家選用的親本材料或在選育過程中注重的選擇目標有關(guān)。對于河南來說，1BL·1RS易位出現(xiàn)的頻率較高，其主要原因可能是河南為中國糧食生產(chǎn)核心區(qū)，是國家的糧倉，承擔著保障國家糧食安全的重擔，在產(chǎn)量壓力選擇下，1BL·1RS易位系作為育種親本應用較多，并在后代選擇中注重抗病性、豐產(chǎn)性和抗逆性的綜合考慮，所以在河南選育的小麥品種(系)中，1BL·1RS易位系出現(xiàn)的頻率較高。

在未來小麥品質(zhì)改良方面，選育強筋小麥品種時一方面可選用不含1BL·1RS易位的親本材料，另一方面應從改良1BL·1RS易位系的品質(zhì)入手。本研究篩選出12份聚合//基因的易位系材料，這為1BL·1RS易位系的品質(zhì)改良提供了研究材料。

3.2 YP7A、PPO18標記在品質(zhì)育種中的應用

面制品色澤是面條小麥育種的主要目標之一。用基因特異性標記能快速鑒定品質(zhì)性狀的基因型，為育種提供簡單易行的鑒定方法。本研究利用YP7A標記檢測基因在266份冬小麥品種(系)中的等位變異，結(jié)果表明，含有和的品種(系)分別占供試材料的75.9%和24.1%，這與楊芳萍等的研究結(jié)果一致，均為的分布頻率遠高于。和在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率差異較大，其中和在陜西品種(系)中的分布頻率均為50.0%，這與張影全等的研究結(jié)果一致；在北京品種(系)中的分布頻率為83.3%，與楊芳萍等的研究結(jié)果(75.0%)相比，呈增長趨勢；此外，在山東和河北品種(系)中的分布頻率也很高，尤其是山東23份材料中全部含有。原因可能與育種家選用的親本材料基因型有關(guān)，也可能與人們對營養(yǎng)品質(zhì)的需求增加，導致育種家對的定向選擇有關(guān)。

小麥籽粒PPO催化褐變反應，導致面條感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值下降，選育低PPO活性小麥品種(系)也是面條小麥品質(zhì)改良的重要目標之一。本研究用PPO18標記對供試材料進行檢測，發(fā)現(xiàn)266份材料中含有的品種(系)占全部供試材料的45.5%，這與王黎明等的結(jié)果 (48.5%)基本一致，而與肖永貴等(58.2%)和胡鳳靈等(53.8%)的研究結(jié)果相比，的分布頻率有所降低。出現(xiàn)這種差異的原因可能在于供試材料的來源及構(gòu)成不同。本研究還發(fā)現(xiàn)，和在不同小麥主產(chǎn)省份品種(系)中的分布頻率存在明顯差異，與低PPO活性相關(guān)的在山東、北京和河北品種(系)的分布頻率較高，而河南和江蘇品種(系)的分布頻率較低，這與育種家所選用的親本材料有關(guān)，以及長期選擇過程中對小麥品種PPO活性選擇的重視程度不同，導致不同省份之間存在較大的差異，因此，河南和江蘇小麥育種工作者應加大低PPO活性小麥品種(系)選擇的力度。

4 結(jié) 論

明確了近10年來小麥主要生產(chǎn)省份新育成品種(系)中、、、基因和1BL·1RS易位的分布情況，并分別篩選到2和23份含有///和///基因組合且均不含 1BL·1RS易位的材料，可作為優(yōu)質(zhì)面條小麥育種的親本材料；篩選到12份含有//基因組合且含有1BL·1RS易位的材料，可作為1BL·1RS易位系品質(zhì)改良的研究 材料。