小麥面粉蛋白質量評價模型構建及蛋白質量再評價

晁岳恩

(河南省農業科學院小麥研究所，河南鄭州 450002)

小麥是世界上廣泛種植的農作物之一，可加工成多種多樣的食品。在成熟的小麥籽粒中，貯藏蛋白的含量約占籽粒干重的10%～15%[1]，其含量和類型影響著面筋的強度和粘彈性，決定了小麥面粉的最終加工用途[2-4]。

面筋蛋白主要由麥谷蛋白和醇溶蛋白組成，麥谷蛋白按分子量大小又可分成高分子量麥谷蛋白(HMW-GS)、低分子量麥谷蛋白(LMW-GS)。通常認為，HMW-GS約占小麥貯藏蛋白的10%左右，通過分子間或分子內二硫鍵作用形成面筋骨架，決定著面團的強度和延展性[5-7]。LMW-GS約占小麥貯藏蛋白三分之一，占麥谷蛋白的60%左右，由于其編碼基因拷貝數多、分子量小、且在電泳圖譜上與大量的醇溶蛋白重疊，因而有關LMW-GS及其編碼基因與品質參數之間關系的報道相對較少[8]。有研究認為，LMW-GS與面團強度有密切關系[9-11]。

醇溶蛋白約占小麥貯藏蛋白的40%左右，在食品加工時，以單體蛋白形式通過非共價鍵作用結合到面筋中，主要影響面團的粘性和延展性。也有研究認為，醇溶蛋白也可以通過分子間二硫鍵結合到面筋中，進而影響面團的強度[12-14]。

小麥面粉蛋白類型復雜，由于缺乏簡單可行的蛋白質量評價模型，不同蛋白類型對面粉品質的貢獻難以量化比較。研究表明，面粉蛋白中的自由巰基和二硫鍵對面團結構及面團穩定性有重要影響[15-17]。當面粉加水揉混時，面粉蛋白質的自由巰基與分子內或分子間其他巰基相互結合，形成穩定的共價二硫鍵，決定著面筋的結構和特性[17-19]。因此，面團的二硫鍵是決定面團流變學特性及烘焙質量的關鍵因素[20-22]。面粉蛋白的巰基含量與面粉質量相關性是否顯著、可否利用巰基含量量化蛋白與面粉質量的關系尚未有相關報道。因此，本研究擬分析面粉質量與巰基集團相關性，并構建面粉不同蛋白類型對其質量貢獻的量化評價模型，為小麥面粉蛋白的研究提供參考評價工具。

1 材料與方法

1.1 材 料

在2017-2018年度，11個不同品質類型的小麥品種(鄭麥366、新麥26和西農979為強筋品種；周麥32、鄭麥379、鄭麥119、鄭麥101和鄭麥158為中強筋品種；矮抗58、鄭麥369為中筋品種；鄭麥103為中筋品種但品質接近弱筋)種植在河南省農業科學院試驗基地，管理同當地大田，成熟、收獲后磨粉，測定品質特性及巰基含量。

1.2 方 法

1.2.1 磨粉及面粉品質指標測定

制粉：參照AACC 26-20方法，用BUHLER實驗磨磨粉，根據籽粒的硬度確定潤麥加水量，硬麥為16.5%，中等類型為15.5%，軟質麥為 14.0%，潤麥時間為16～18 h。面粉水分含量按AACC-4-15A測定。

面筋參數：用瑞典Perten公司的2200型面筋儀(Glutomatic)，按GB/T 14608-93測定小麥粉濕面筋含量及濕面筋指數。

粉質參數：用德國Brabender公司的810104型粉質儀(Farinograph)，按GB/T 14614-93測定吸水率、面團形成時間、穩定時間、弱化度等面團流變學特性參數。

1.2.2 硫及巰基含量測定

硫含量檢測：稱取10 mg面粉，加入200 μL濃硝酸在95 ℃下消化30 min；115 ℃下消化90 min，冷卻至室溫后用超純水定容至1 mL。采用液相離子色譜儀(IC-2001; TOSOH,Japan)測定硫元素含量，陰離子標準液來自Wako Pure Chemicals(Japan),詳細操作采用Maruyama的優化方法[23]。

總巰基和自由巰基含量及二硫鍵含量測定參考Wang等[24]的方法。三次重復。

1.3 蛋白評價模型建立及蛋白質量再評價

根據面粉特性與巰基含量的相關性，建立基于自由巰基和二硫鍵含量的蛋白質量評價模型。從NCBI數據庫下載不同類型的面粉蛋白氨基酸序列(高、低分子量麥谷蛋白、醇溶蛋白、燕麥類似蛋白、硬度蛋白等)，巰基和二硫鍵含量預測使用在線程序(SCRATCH Protein Predictor：http://scratch.proteomics.ics.uci.edu)，利用評價模型對各面粉蛋白進行評分。

1.4 數據分析

使用SPSS 2.1對面粉質量與巰基含量的相關性進行分析。

2 結果與分析

2.1 面粉質量分析

從表1可以看出，11個品種中，鄭麥158的粗蛋白含量較低(13.5%)，但面團穩定時間最長(16.5 min)，面筋指數達到第二高；周麥32的粗蛋白含量最高(19.8%)，面團穩定時間和面筋指數值處于中高位；鄭麥119含有第二高的粗蛋白含量和最高濕面筋含量，其面團穩定時間和面筋指數值并不高。推測在不同小麥品種中，相對于貯藏蛋白的含量而言，貯藏蛋白的類型對面粉質量的影響更大。

2.2 巰基含量分析

由表2可知，在11個品種中，鄭麥103的總硫、自由巰基和總巰基含量最低；鄭麥119的硫含量最高，但自由巰基、總巰基和分子內二硫鍵含量均處于最低水平，推測鄭麥119面粉中的半胱氨酸含量比例較低；新麥26的總巰基、分子內二硫鍵的含量最高，但自由巰基含量卻不是最高，推測其蛋白質肽鏈內的半胱氨酸殘基相互結合成分子內二硫鍵的比例較高。

2.3 巰基含量與面粉質量的相關性分析

對面粉品質和巰基含量之間的相關性進行分析，結果(表3)發現，硫含量與粗蛋白、濕面筋含量之間存在顯著正相關關系，但與面團強度參數(面筋指數、穩定時間)之間無顯著相關性，因此，硫元素含量不適合作為衡量面粉品質的參數。自由巰基含量與穩定時間存在極顯著正相關關系，

表1 不同品種的面粉品質特性Table 1 Processing quality of various wheat cultivars

表2 不同小麥品種面粉中的巰基含量Table 2 Sulfur and sulfhydryl group contents in various cultivars

與面筋指數之間存在顯著的正相關關系，所以自由巰基含量可以作為衡量面粉品質的參數。二硫鍵含量與面團強度重要參數穩定時間之間沒有顯著相關性，建議作為補充參數使用。綜上所述，可以建立如下衡量小麥貯藏蛋白與面團強度的關系模型：

分值=0.9x+0.3y

其中，x為某個蛋白質的自由巰基數量，y為這個蛋白質的分子內二硫鍵數量；系數0.9取自自由巰基與面團穩定時間的相關系數近似值，0.3為分子內二硫鍵與面團穩定時間的相關系數近 似值。

表3 小麥巰基集團與面粉品質參數的相關性分析Table 3 Correlations between flour processing quality parameters,sulfur content,and sulfhydryl group content in wheat

2.4 面粉不同蛋白類型的量化評價

從NCBI數據庫下載89個不同類型的面粉蛋白和1個尚未提交數據庫的燕麥類似蛋白，利用在線軟件預測其分子內二硫鍵以及自由巰基含量。根據軟件分析原理，分子內二硫鍵和自由巰基分屬兩個獨立的預測。因此，當一個蛋白預測無分子內二硫鍵時，其半胱氨酸數量全部視為自由巰基數量；預測含有分子內二硫鍵時，總半胱氨酸數量減去形成二硫鍵的半胱氨酸數量，剩余的半胱氨酸數量即為自由巰基數量。相關面粉蛋白的自由巰基、二硫鍵及評估分值見表4。

表4 基于在線巰基預測結果的面粉蛋白質量評價Table 4 Predicted number of disulfide bonds in GSPs and evaluation scores calculated in this study

(續表4 Continued table 4)

(續表4 Continued table 4)

在被評估的24個高分子麥谷蛋白中，評分最高的是6.3分的1Dy10.1亞基，其次為Dx5和 1Dy3(4.5分)，11個亞基得到3.6的評分，另有7個亞基得分1.8分。從面團強度貢獻方面分析，1Dy10.1、Dx5和1Dy3可以認定為優質亞基，11個3.6分的屬中等類型亞基，7個得分僅1.8可以看做是劣質亞基。

在36個低分子麥谷蛋白亞基中，Glu-B3和Glu-D3位點編碼的蛋白得分均達到7.2分，超過了得分最高的高分子麥谷蛋白1Dy10.1亞基，但Glu-A3的12個亞基里面，僅有3個亞基評分達到7.2分，其余評分均沒有超過3.6分。表明Glu-B3和Glu-D3位點的編碼蛋白對面團強度貢獻較大。

在所評估的27個醇溶蛋白中，4個ω-醇溶蛋白由于缺乏半胱氨酸殘基，不能形成分子內或分子間二硫鍵，評分為0；6個γ-醇溶蛋白中，有3個評分達到7.2及以上；2個δ-醇溶蛋白中有一個評分也達到了7.2分；3個γ-黑麥類似的醇溶蛋白(gamma secalin)都在8分以上，表明這類型的醇溶蛋白對面團強度有較大貢獻；12個被評估的α-或α/β-類醇溶蛋白中，有3個評分達到5.4分，超過了大多數高分子麥谷蛋白的分值。

除上述麥谷蛋白和醇溶蛋白外，重新評估了兩個燕麥類似(avenin-like)蛋白和兩個硬度相關蛋白(puroindoline)。在燕麥類似蛋白中，一個B型的蛋白得到了所有面粉蛋白的最高分(16.2分)，另一個A型的也獲得了與普通高分子麥谷蛋白相似的3.6分。

3 討 論

面團穩定時間和面筋指數是衡量面團強度的常用指標。本研究結果顯示，自由巰基含量與面團穩定時間存在極顯著正相關關系，且自由巰基含量與面筋指數之間存在顯著的正相關關系(表3)；分子內二硫鍵的含量與面團穩定時間存在正相關關系。很多研究已證實，自由巰基在面粉質量中具有重要作用[15-19]。因此，依托這兩個系數構建蛋白分析模型在理論上是可行的，但模型評估結果的正確性依賴于自由巰基預測的準確性，以及該蛋白在總面粉蛋白含量中的比例。

在高分子麥谷蛋白類型中，相關研究已證實，Dx5、Dy10亞基屬于優質亞基，對面團強度的貢獻較大[25]。而基于模型評價的分值也表明，1Dy10.1和Dx5亞基得分較高，可以認定為優質亞基；另一個得分較高的亞基是1Dy3，分值和Dx5同為3.6分，可以認定為優質亞基。高分子麥谷蛋白含量約占面粉蛋白總量的7%～15%，可以解釋45%～70%的面粉及終端應用特性[6-7]，但從本模型的評分結果看，高分子麥谷蛋白難以達到45%～70%強度貢獻值。

低分子麥谷蛋白含量約占面粉總蛋白的33%、麥谷蛋白總量的60%[8]，并且在3個編碼位點中，Glu-B3、Glu-D3位點編碼蛋白得分均達到7.2分，Glu-A3位點也有少部分蛋白評分為7.2分。雖然傳統觀點認為，高分子麥谷蛋白對面團強度的貢獻最大，但根據本研究的評估結果以及低分子麥谷蛋白占總蛋白含量的比例推測，低分子麥谷蛋白在面團強度方面的貢獻可能更大。已有研究認為，低分子量麥谷蛋白在面團強度方面具有重要作用[9-11，26-27]。我們在品質育種過程中也發現，高分子麥谷蛋白亞基組合完全相同的品種，其面團強度指標也會有很大差異，推測高分子麥谷蛋白并不是面團強度的主要決定者。例如，本研究中的鄭麥369、鄭麥119和鄭麥158的親本之一都是鄭麥366，蛋白電泳顯示這四個品種的高分子麥谷蛋白亞基組合完全一樣，但面粉質量有很大差異(表1)。

在線預測結果表明，醇溶蛋白并不像傳統觀點認為的缺乏自由巰基，僅靠非共價鍵結合到面筋中，對面筋強度沒有貢獻；除ω-醇溶蛋白類型以外，在其他種類的醇溶蛋白中如γ類、α(α/β)類以及黑麥類似的醇溶蛋白，對于面團強度也有貢獻，這也與傳統觀點認為的、醇溶蛋白主要以非共價結合的方式填充到面筋骨架中不同。也有部分部分研究認為，醇溶蛋白中含有半胱氨酸殘基，有可能以分子間二硫鍵的形式結合到面筋中[13-14，28-29]。

依據本模型評分結果，分值最高的蛋白為B型燕麥類似蛋白(16.2分)，證實了燕麥類似類蛋白與面粉品質特性有密切關系[30]。我們利用轉錄組測序結合蛋白電泳研究發現，在鄭麥366、鄭麥369、鄭麥158和鄭麥119四個品種中，高分子麥谷蛋白亞基組合完全一致且基因表達水平無顯著差異，但燕麥類似蛋白及部分醇溶蛋白的基因表達有顯著差異，也暗示這兩類蛋白可能與面粉質量有密切關系(結果待發表)。

因此，在今后的優質小麥育種中，除了要繼續重視高分子麥谷蛋白的作用外，還要進一步加強對Glu-B3和Glu-D3位點編碼蛋白、燕麥類似蛋白及部分醇溶蛋白的研究，為優質小麥育種提供技術支撐。

4 結 論

建立的基于巰基含量的蛋白質量評價模型，可用于小麥面粉蛋白品質研究、優質小麥育種等工作。

低分子量麥谷蛋白、特別是Glu-B3和Glu-D3位點編碼蛋白，可能是面團強度的主要來源。

燕麥類似蛋白可能對面團強度具有較大 效應。