智能化抗酸桿菌檢測在結核診斷中的應用

趙 業，張凱聞，梁 麗，熊 焰，李 挺

結核病是結核桿菌感染導致的慢性傳染病，我國結核病病例數居全球前列，其防治工作是醫療人員的重要任務[1]。結核病的治愈率和疫情的有效控制需具有及時和準確的診斷，檢測結核桿菌的手段多種多樣，其中抗酸染色又稱為Ziehl-Neelsen染色[2]。長期以來抗酸染色的操作和診斷均為人工完成，染色質量難以保證，診斷不僅費時、費力，且陽性率低。近年隨著全自動染色機在病理科的應用，抗酸染色切片質量明顯提高，在一定程度上提高了病理醫師檢測陽性桿菌的工作效率，但其費時、費力的瓶頸仍未能得到突破。本實驗室自主研發CNN平臺的結核桿菌識別人工智能(tuberculosis bacillus finder, TB-Finder)，作為抗酸染色病理檢測的初篩手段，在臨床試驗中具有高度敏感性和較高的特異性，為徹底解決結核桿菌抗酸染色病理診斷的難題提供強有力的工具[3]。本文將Benchmark全自動染色和TB-Finder應用于抗酸染色的病理診斷，創建智能化抗酸桿菌檢測模式，對比其與傳統抗酸桿菌檢測模式(手工染色+人工閱片)的實驗效率、染色質量和診斷準確率，探討智能化抗酸桿菌檢測在結核病理診斷中的價值及流程優化。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年7月～2020年7月北京大學第一醫院病理科診斷肉芽腫性病變的石蠟包埋標本150例，常規4.5 μm厚切片。每例均帶已確定抗酸陽性的對照組織，70 ℃烤片40 min。本實驗經北京大學第一醫院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 儀器與試劑

1.2.1儀器 Benchmark自動染色機，Sukura封片機，標簽打印機，Leica切片機，Leica水浴，Leica烤片臺，3DHISTECH掃描儀。

1.2.2試劑 堿性復紅，無水乙醇，石碳酸，亞甲基藍，1%鹽酸乙醇，蘇木精，Depar脫蠟液，LCS液，Wash清洗液，蒸餾水等。

1.3 實驗方法

1.3.1手工染色 操作步驟：(1)切片脫蠟至水；(2)入石碳酸復紅液1 h，入37 ℃或56 ℃溫箱孵育30 min；(3)蒸餾水洗凈；(4)0.5%鹽酸乙醇分化；(5)蒸餾水洗，用0.1%亞甲基藍水溶液復染10 min；(6)蒸餾水洗，經95%乙醇分化；(7)100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固[3]。

1.3.2Benchmark全自動染色 (1)檢查：開機后檢查機器是否運轉正常，查看緩沖試劑桶內的試劑及廢液桶，確保有能夠完成當次染色的液位；(2)備片：在電腦中選擇需要的染色項目方案，打印標簽，貼于切片，制片并烘干；(3)運行：將玻片平放在染色托上，標簽側朝外，組織朝上，確定四角鎖定好后關閉載片倉，將染色項目試劑放入試劑臺，打開試劑蓋，點擊“運行”，機器自動掃描每張玻片和試劑，電腦顯示工作狀態圖為黃色并出現倒計時，染色自動開始；(4)完成：工作狀態圖為綠色，取下玻片，運行清洗項目(圖1)。

圖1 自動染色機基本結構

1.4 病理診斷

1.4.1人工診斷 由兩位病理醫師分別閱片、作出病理診斷；診斷一致的病例，記錄為最終診斷；診斷不一致的病例，共同閱片、討論、達成一致，作為該病例的最終診斷。

1.4.2智能化診斷 采用TB-Finder初篩+病理醫師復核的模式。(1)采用3DHISTECH掃描儀掃描抗酸染色切片，數字切片提交TB-Finder。(2)TB-Finder初篩采用兩階段模型設計，第一階段為目標檢測階段，目的為識全切片圖像上的所有桿菌候選物，采用具備State-of-the-art性能的目標檢測神經網絡RetinaNet基礎網絡結構，并加入可變卷積、Swish激活函數、半精度訓練等優化設計。采用包圍框標注記錄桿菌在截圖上的頂點位置，最終模型在測試集上達到mAP@0.5=0.88。第二階段為分類階段，根據第一階段的檢測結果將整張切片分為陰性、陽性。從第一階段的檢測結果中選出置信度最高的10個桿菌候選物，將檢測框置信度、檢測框大小作為特征值輸入SVM模型。根據500例具有活檢診斷記錄的抗酸桿菌切片，其中200例原始診斷為桿菌陽性、300例診斷為陰性，采用6 ∶2 ∶2的數據拆分比例，模型在測試集上達敏感性100%和特異性76%。(3)病理醫師復核：TB-Finder標注的陽性桿菌，病理醫師對數字圖片進行復核，有疑問的病例在光鏡下進行驗證。(4)最終病理診斷：TB-Finder初篩為陰性者為抗酸陰性；TB-Finder初篩為陽性者，需經病理醫師在數字切片或光鏡下確認，仍為陽性者為抗酸陽性(圖2)，反之為抗酸陰性[4]。

圖2 結核病-人工智能+人工復核陽性病例數字圖像，抗酸染色

1.5 染色切片質量評估由兩位病理醫師分別對手工和自動染色切片進行質量評分。評分標椎：(1)整體顏色：顏色不一致1分，一致性好2分；(2)菌體顏色：淺紅色1分，紫紅色2分(陰性病例的評分參考陽性對照組織)；(3)背景顏色：不著色1分，藍色2分；(4)脫片：部分脫片1分，無脫片2分；(5)污染：有雜質1分，無雜質2分。上述各項評分相加為總評分：5分為差，6～8分為良，9～10分為優[5]，取兩位醫師評分的平均值作為該切片的最終評分。

2 結果

2.1 抗酸檢測陽性率150例樣本經智能化檢測模式的陽性率為29.3%(44/150)，傳統檢測模式的陽性率為6.6%(10/150)。

2.2 切片質量評分手工染色150例，切片質量評分5～10分，平均7.8分，優98張，良45張，差7張，優良率95.3%(優65.3%、良30%)。自動染色150例，切片質量評分7～10分，平均8.9分，優112張，良38張，差0張，優良率100%(優74.7%、良25.3%)；兩者差異有顯著性(P<0.05)。

2.3 效率(1)染色：手工染色全流程耗時約110 min(含脫蠟)，自動染色約48 min，自動染色節約時間62 min。手工染色，一次最多染4～8張，自動染色一次通量為20張。(2)診斷：人工閱片每張切片平均耗時30 min，TB-Finder則只需2 min，另行切片掃描和人工復核，智能化系統每張切片平均耗時10 min。(3)染色+診斷全流程：智能化平臺每張切片耗時12 min，傳統模式每張切片耗時57 min，智能化平臺節約時間成本約78%。

2.4 人工閱片和TB-Finder閱片的比較150例機染切片，醫師人工閱片陽性21例。TB-Finder閱片陽性54例，不一致病例33例，均為人工閱片陰性，TB-Finder閱片陽性。

3 討論

長期以來抗酸染色均為手工完成，存在不穩定因素較多，對操作者的技術要求高，導致染色質量難以控制。結核桿菌長度僅約4 μm，直徑不足1 μm，是影響結核病理診斷的主要因素[5-6]。因此，提高抗酸染色切片質量，降低尋找陽性桿菌的難度，是提升抗酸染色在結核病理診斷中應用價值的兩大要素。

人工智能源于1956年美國召開的人工智能達特茅斯夏季研討會[7]，CNN是近年發展的一種非常高效的人工智能，尤其在圖像識別領域取得驚人的突破，同時具備高效率、客觀穩定、長時間高負荷工作等優點。與復雜的組織細胞形態相比，結核桿菌形態簡單，識別難度小，將人工智能引入抗酸染色切片的初篩可提高檢出率。本課題組根據CNN平臺自主研發的結核桿菌識別人工智能TB-Finder，作為抗酸染色病理檢測的初篩手段，具有高度敏感性和較高的特異性[4]。

盡管人工智能在尋找抗酸桿菌的工作中具有顯著優勢，但其適應能力遠不如病理醫師，因此一致性好、色彩鮮亮、對比度好的染色切片是其發揮強大工作能力的基礎。手工染色切片受多種不確定因素的影響，嚴重影響了人工智能的工作效率。Benchmark全自動染色機是由染色模塊、緩沖液模塊、廢液收集模塊于一體的統一機械化運行，從而確保染色環境的相對封閉，減少了人為和外界環境變化的干擾，同時恒量的液體滴加和標準化的機械操作，使每一次染色的濃度均能保持一致，最終保證了切片顏色的均勻性和一致性。本組150例石蠟樣本，每個樣本連續切片2張，平行進行手工抗酸染色和自動抗酸染色，自動染色組(平均分8.9分、優良率100%)切片染色質量評分高于手工染色組(平均7.8分、優良率95.3%)。因此，與手工染色相比，自動染色更能匹配人工智能的應用，順應了人工智能時代病理發展的潮流。

本組將Benchmark全自動染色和TB-Finder整合應用于抗酸染色的病理診斷，創建智能化抗酸桿菌檢測平臺，對比傳統抗酸桿菌檢測模式(手工染色+人工閱片)，病理診斷陽性率明顯提高(智能化模式29.3%vs傳統模式6.60%)，且染色過程節約了時間成本，TB-Finder初篩又為病理醫師節約了大量閱片時間。本組結果顯示，染色加診斷全流程，智能化平臺比傳統模式節約時間成本約78%。

先進技術的應用極大提升了生產力，但卻并非完全替代人的作用。首先，在染色環節，由于機器的工作是連續不間斷的，出現錯誤需從新開始，降低效率。因此，應做好前期的準備工作，尤其是標簽準備、廢液桶及試劑瓶液位、染色試劑的剩余完成次數等關鍵環節需操作人員重點關注。為保證機器穩定、高效的運行，經常維護，定期清洗，注意試劑pH值的把控，嚴格規范操作等細節都是必不可少的。其次，自動化雖然降低了人的勞動強度，提高了工作效率，但制作優質的抗酸染色切片仍需實驗人員具備高度的責任心和精益求精的工作作風。最后，病理診斷必須由病理醫師完成。本實驗人工閱片和TB-Finder判讀結果不一致者33例(22%)，將其病例的TB-Finder標注圖像由病理醫師復核，其中23例為真陽性，不一致的原因是人工閱片漏診所致；其中10例TB-Finder找到的陽性菌不在肉芽組織和壞死中，被醫師判為非致病菌，屬于假陽性。由此可見，在實際應用中病理醫師應認識到TB-Finder的局限性，尤其是無法鑒別致病菌和非致病菌。因此，TB-Finder的檢測結果必須經病理醫師復核確認后，才能作出抗酸染色陽性的診斷。

綜上所述，由自動染色、人工智能組成的智能化抗酸桿菌檢測平臺，不僅提高了工作效率，降低勞動強度，減少漏診率，提高結核的檢出率，還有助于規范質量控制和減少環境污染，使抗酸染色在結核診斷中發揮重要作用，值得臨床推廣。