血漿羥氯喹濃度監測及在系統性紅斑狼瘡患者中的應用*

劉婷婷，高貝貝，宋帥，金超，3，帥宗文，潘夢璐，楊春蘭，孫璇君

(1.安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科，國家中醫藥管理局中藥化學三級實驗室，合肥 230022；2.安徽醫科大學第二附屬醫院藥劑科，合肥 230601；3.安徽醫科大學藥學院，合肥 230032；4.安徽醫科大學第一附屬醫院風濕免疫科，合肥 230022；5.安徽中醫藥大學第一附屬醫院腎病科，合肥 230031)

羥氯喹(hydroxychloroquine，HCQ) 是4-氨基喹酮類抗瘧藥，也是一種獨特的抗風濕免疫疾病藥物[1]，在系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、盤狀紅斑狼瘡、類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)、復發性風濕病及干燥綜合征等疾病中具有可靠療效[2]。對于新型冠狀病毒肺炎 (COVID-19) 患者，氯喹和HCQ亦顯示一定療效[3]。研究顯示，HCQ的療效與其血藥濃度正相關，血藥濃度高的患者，SLE疾病活動指數 (SLE activity index，SLEDAI) 一般較低；相反，血藥濃度低的患者，通常會表現出高SLEDAI[4]。其次，HCQ血藥濃度可作為疾病發作的預測指標，血藥濃度較低提示疾病即將進入發作期，HCQ保持在一定血藥濃度水平可防止疾病復發[5]。然而，由于特殊的藥動學過程，服用相同劑量HCQ的SLE患者，不同個體間血藥濃度差異較大[6]。且HCQ半衰期長，表觀分布容積大，一般需長期服藥[7]，大劑量長期應用HCQ可引起胃腸道、眼部等不良反應，其嚴重程度亦與血藥濃度具有相關性[8]。因此，監測患者HCQ血藥濃度，并隨之調整用法用量，對控制疾病發作，提高療效，減少不良反應，實現個體化用藥十分重要。

1 血漿HCQ濃度監測

1.1儀器與試藥

1.1.1儀器 30AD超高效液相色譜儀購于日本島津Shimadzu公司；TRIPLE QUADA-PTM 5500三重四極桿質譜儀購于美國AB公司；EYELA MG-2200金屬浴購于日本Rikakikai公司；XW-80A漩渦振蕩器購于上海醫科大學儀器廠；D-37520臺式離心機購于美國Thermo公司。

1.1.2試藥 硫酸羥氯喹購于上海上藥中西制藥有限公司(批準文號：國藥準字H19990263，批號：C0112021189)，HCQ對照品購于美國Sigma公司(含量≥95%，批號：BCBP6432V)，奎寧對照品(Quinine，QN)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(含量：98%，批號：H1623052)，甲醇和乙腈購于美國Tedia公司(色譜級)。

1.2方法與結果

1.2.1色譜及質譜條件 色譜柱為Poroshell 120 EC-C18(2.1 mm×100 mm，2.7 μm，Agilent Technologies公司)。流動相為0.1%甲酸酸化溶液(A相) 及0.1%甲酸酸化甲醇 (B相)。梯度洗脫條件為0～2 min：75%A/25%B，2.1～4 min：30%A/70%B，4.1～5 min：10%A/90%B，5.1～9.5 min：75%A/25%B，9.5 min：stop。流速為0.25 mL·min-1。進樣量為5 μL。柱溫為35 ℃。質譜條件為三重四級桿質譜聯用儀AB Sciex 5500，以正離子模式使用電噴霧離子源，使用多反應監測(multiple reaction monitoning，MRM) 模式。離子對：HCQ(m/z336.4→247.2)、QN (m/z320.2→247.2)。

1.2.2溶液配制 以甲醇-水(50：50，V/V) 溶解精密稱取的HCQ、QN對照品各10 mg，置于10 mL量瓶中，定容至刻度后搖勻，分別得到1 mg·mL-1的HCQ及QN標準溶液貯備液。以甲醇-水 (50：50，V/V) 為溶劑定量稀釋2種貯備液，依次制成濃度分別為5，50，200，500，1000，2000，4000 ng·mL-1梯度的標準曲線工作液以及濃度為20，250，1000，3000 ng·mL-1質控工作液。以甲醇-水 (50：50，V/V) 稀釋內標QN儲備液，得到500 ng·mL-1的內標工作液。

1.2.3血漿樣本處理 采集患者靜脈血3 mL，給予乙二胺四乙酸抗凝。離心后取血漿樣品100 μL，加入1%甲酸200 μL混合，再加入乙腈1 mL，振蕩渦旋5 min，12000 r·min-1離心10 min(r=8.8 cm)。上清液1 mL于50 ℃氮氣吹干，再加入100 μL 0.1%甲酸-甲醇 (75：25，V/V) 復溶，渦旋振蕩，10000 r·min-1離心5 min(r=8.8 cm)，取上清液進行UPLC-MS/MS分析。

1.2.4方法學驗證

①專屬性考察 分別取空白血漿、空白血漿加HCQ標準溶液(200 ng·mL-1) 和內標溶液、服用HCQ 6個月以上的SLE患者血樣，按“1.2.3”項處理，在“1.2.1”項條件下進行色譜分析。結果如圖1所示，HCQ保留時間：4.02 min，內標 (QN) 保留時間：5.09 min，HCQ和內標QN出峰位置背景干凈，均無雜峰干擾，峰性良好，靈敏度較高，方法專一性較強。

A.空白血漿；B.空白血漿+HCQ和內標(QN)對照品；C.患者血漿樣品；HCQ(m/z 336.4→247.2，tR=4.02 min)、QN(m/z 320.2→247.2，tR=5.09 min)。圖1 血漿HCQ和內標的提取色譜圖 A. blank plasma；B.blank plasma spiked with standard HCQ and QN；C.patient's plasma sample；HCQ(m/z 336.4→247.2，tR=4.02 min)；QN(m/z 320.2→247.2，tR=5.09 min).Fig.1 Extracted ion chromatograms of HCQ and QN in plasma

②標準曲線及定量限。分別加入標準曲線工作液于空白血漿，制備模擬含藥血漿 (HCQ質量濃度：5，50，200，500，1000，2000，4000 ng·mL-1)，按1.2.3項處理，1.2.1項條件分析，以HCQ血藥濃度為橫坐標 (X，ng·mL-1)，HCQ峰面積 (As) / 內標峰面積 (Ai) 為縱坐標 (Y)，得HCQ血藥濃度標準曲線回歸方程Y=1.19×10-2X+1.93×10-2(r2=0.999 8)。HCQ血藥濃度在5～4000 ng·mL-1范圍內線性關系良好，定量下限為5 ng·mL-1。

③精密度和準確度。在空白血漿中加入質控HCQ工作溶液，制備HCQ濃度分別為20，250，1000，3000 ng·mL-1的模擬含藥血漿作為質控樣本(n=5)，計算批內精密度；連續測定3 d計算批間精密度，將峰面積比值代入隨行標準曲線并對比理論HCQ濃度，結果提示HCQ的4個濃度水平的批內、批間精密度相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)均小于10%，該方法精密度良好；準確度在90%～110%之間，準確性亦良好(表1)。

表1 血漿HCQ的精密度及準確度 Tab.1 Precision and accuracy of HCQ in plasma

④回收率。按標準曲線制備方法制備含HCQ濃度分別為20，250，1000，3000 ng·mL-1的模擬含藥血漿(n=5)及隨行標準曲線，按1.2.3項下的方法操作。另取空白血漿，按1.2.3項下方法操作至上清經氮氣吹干后，分別以含內標的20，250，1000，3000 ng·mL-1濃度標準溶液復溶(n=5)。對上述各濃度兩種處理方法所得的HCQ和內標峰面積分別作比較，計算回收率。結果提示，HCQ的4個濃度水平及內標的回收率均在80%以上，符合生物樣本分析要求 (表2)。

表2 血漿中HCQ及內標物的提取回收率 Tab.2 Extraction recovery of HCQ and QN in plasma %

⑤穩定性實驗。制備含有HCQ (20，250，1000，3000 ng·mL-1) 4種濃度的含藥血漿各5份，分別進行室溫放置7 h、進樣器放置8 h、-20 ℃保存3個月、反復凍融4次的穩定性試驗，按“1.2.3”項標準處理后進樣分析。結果顯示，在不同處理條件下，HCQ的穩定性均良好。

2 臨床樣本檢測及分析

2.1研究方法

2.1.1研究對象 檢測53例于2020年1月—2021年2月在安徽醫科大學第一附屬醫院風濕免疫科就診的SLE患者血樣，患者均給予6個月以上的HCQ治療，采血時間為給藥前，血漿HCQ濃度為谷濃度。納入標準：①符合美國風濕病學會 (American College of Rheumatology，ACR) 1997年修訂的SLE診斷和分類標準[9]；②服用HCQ≥6個月；③臨床資料及相關檢查結果完整。排除標準：①并發重大基礎疾病，合并其他自身免疫性疾病、慢性疾病、急性感染；②使用HCQ前有嚴重肝腎功能不全、眼部疾病史以及皮膚病史；③哺乳期或妊娠期；④1年內服用過降血糖藥物及降血脂藥物。

2.2研究結果

2.2.1患者基本信息及檢測結果 53例SLE患者94.34%為女性，平均年齡(39.19±10.98)歲。按DURCAN等[10-12]的研究結論界定血漿HCQ濃度<10 ng·mL-1為“不依從性”血藥濃度；10～500 ng·mL-1為“亞治療性”血藥濃度；>500 ng·mL-1為“治療性”血藥濃度。采取本文建立的UPLC-MS/MS法檢測，結果顯示，本組患者平均血漿谷濃度為(591.10±288.05) ng·mL-1，“亞治療組”(血藥濃度：10～500 ng·mL-1) 和“治療組”(血藥濃度：10～500 ng·mL-1) 的患者分別占比39.62%及60.38%。53例患者的血漿均得到較好分離，質控顯示結果可靠，提示本方法適用于患者HCQ血藥濃度的測定。

本組患者平均給藥劑量(305.66±77.00) mg·d-1；療程(77.62±56.58)個月；最低血藥濃度205.99 ng·mL-1；最高血藥濃度1 936.46 ng·mL-1；中位血藥濃度541.82 ng·mL-1。

2.2.2HCQ劑量和濃度的關系 臨床患者HCQ用藥方式多樣，根據患者實際用藥情況，檢測不同給藥劑量(200，300，400 mg·d-1)治療后血漿HCQ的濃度。結果顯示，每天給藥400 mg的患者血漿HCQ濃度最高，與200 mg·d-1給藥組相比差異有統計學意義(P<0.05)，其他組間差異無統計學意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 血漿HCQ濃度與其給藥劑量的關系 Fig.2 Relationship between plasma concentration of HCQ and its dose

2.2.3血漿HCQ濃度與疾病活動度及不良反應的相關性 分析患者數據信息，結果顯示血漿HCQ濃度高的患者SLEDAI較低，疾病緩解組(SLEDAI≤4)患者血漿HCQ濃度高于疾病活動組(SLEDAI>4)(P<0.05)(圖3A)。發生眼部不良反應的患者血漿HCQ濃度高于未發生眼部不良反應的患者，差異有統計學意義(P<0.05)，患者發生其他不良反應主要有頭暈、皮膚瘙癢和咳嗽，發生情況與血漿HCQ濃度相關性不顯著(圖3B)。

①與SLEDAI=0分組比較，P<0.05；②與SLEDAI=0分組比較，P<0.01。圖3 血漿HCQ濃度與(A)SLEDAI，(B)眼部及其他不良反應的相關性 ①Compared with SLEDAI=0 group，P<0.05；②Compared with SLEDAI=0 group，P<0.01.Fig.3 Relationship of HCQ plasma concentration with SLEDAI (A)，ocular and other adverse reactions (B)

2.2.4不同血漿HCQ濃度患者臨床指標比較 按血漿HCQ濃度10～500 ng·mL-1及>500 ng·mL-1，將患者分為亞治療組及治療組，分析患者炎癥、血常規、肝腎功能、凝血功能、血糖血脂等臨床指標，結果顯示，治療組患者天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)水平較亞治療組低 (P<0.05)，但其血小板計數(PLT)高于亞治療組(P<0.01)，其他臨床指標差異無統計學意義(P>0.05)(圖4)。

圖示：ESR：紅細胞沉降率、CRP：C反應蛋白、C3：補體C3、C4：補體C4、WBC：白細胞、RBC：紅細胞、Hb：血紅蛋白、PLT：血小板、ALB：白蛋白、GLO：血清球蛋白、DBIL：直接膽紅素、IBIL：間接膽紅素、ALT：谷丙轉氨酶、AST：谷草轉氨酶、ALP：堿性磷酸酶、GGT：谷氨酰轉肽酶、CRE：血肌酐、BUN：尿素氮、BG：血糖、TC：總膽固醇、TG：甘油三酯、HDL：高密度脂蛋白、VLDL：極低密度脂蛋白、LDL：低密度脂蛋白、PT-SEC：凝血酶原時間、PT-INR：凝血酶原時間國際比值、APTT：活化部分凝血活酶時間。圖4 患者臨床指標數據比較 Fig.4 Comparison of clinical indicators between patients

3 討論

目前文獻報道的血漿HCQ濃度測定方法多為高效液相色譜-紫外檢測器 (HPLC-UV) 系統[13-15]，受限于檢測器靈敏度，其定量下限在100 ng·mL-1以上。然而，一些患者血漿HCQ濃度較低，傳統紫外檢測器可能無法滿足其定量需求，且該方法檢測時間較長，一般需十幾分鐘至幾十分鐘。本研究建立的UPLC-MS/MS法采用質譜檢測，其定量下限在5 ng·mL-1，檢測時間僅需數分鐘，更加靈敏、快速。本方法采用內標法，與傳統的外標法相比，可減少系統誤差，定量更準確。后續筆者還利用此法對HCQ的3種代謝產物 (去乙基羥氯喹、去乙基氯喹和雙去乙基氯喹) 進行檢測研究，結果良好。本研究收集53例長期服用HCQ的SLE患者血樣，采用該方法測定HCQ濃度，結果準確、快速，方法簡便且重復性較好，與已報道的LC-MS/MS法分析效率相當[16-17]，且經過更多實測病例樣本驗證，結果更加可靠。

報道顯示HCQ的臨床療效與其血藥濃度正相關，血藥濃度高臨床治療效果較好，血藥濃度低會引起療效降低。另外，血漿HCQ濃度可作為疾病發作的一個預測指標，若濃度低，可提示疾病即將進入活動期；在體內達到一定濃度，可防止疾病復發[18]。但服用等劑量HCQ的SLE患者之間，其穩態血藥濃度往往存在較大差異[19]，不同個體間血漿HCQ濃度波動范圍大[20]，且HCQ一般需要長期服用，會引起一些不良反應，需要血藥濃度監測[21]。一項對143例服用HCQ(400 mg·d-1) 6個月以上的SLE患者的研究發現，120例非活動期SLE患者的平均血漿HCQ濃度為(1079±526) ng·mL-1，23例活動期患者的平均血漿HCQ濃度為(694±448) ng·mL-1；當血漿HCQ濃度達到1000 ng·mL-1時，患者復發率較低[22]。本研究53例SLE患者測得HCQ平均血漿谷濃度為(591.10±288.05) ng·mL-1；400 mg·d-1給藥時血漿HCQ濃度較高，其它給藥劑量與血藥濃度的相關性不顯著；血漿HCQ濃度與SLEDAI有負相關趨勢，低血漿HCQ濃度患者提示可能進入疾病活動期(SLEDAI>4)。

HCQ不良反應主要表現在以下3方面：首先，用藥初期出現惡心嘔吐、胃灼燒感等胃腸道癥狀；其次，長期服用可出現頭發損傷和皮疹；在神經系統方面，服用HCQ或見失眠、頭痛頭暈和神經緊張等反應；此外，長期大劑量服用HCQ治療也可造成中毒性疾病、心臟疾病和周圍神經病，但及時停止服藥，這些癥狀一般可以得到改善[23]。值得注意的是，有重癥肌無力等神經肌肉疾病和精神障礙性疾病患者，使用HCQ時需謹慎；葡萄糖-6-磷酸酶體內缺乏的患者服用時要明確是否發生溶血[24]。HCQ最為嚴重的不良反應表現為眼部病變，長期服藥可能對視網膜造成損害，且病變有時間和劑量累積效應。每日最大服藥量<6.5 mg·kg-1，發生視網膜病變風險低，超過此日劑量，將大大增加視網膜病變的風險[25]。一項回顧性調查顯示：2361例服用HCQ的患者在用藥前10年，視網膜病變率<2%，服藥超20年，病變率升至20%[26]。本研究結果發現高血漿HCQ濃度患者眼部不良反應發生較多，與文獻報道一致[27]。其他不良反應表現為頭暈、皮膚瘙癢和咳嗽，應引起重視。因此，監測血漿HCQ濃度來調整劑量，控制疾病發作，提高藥物療效，減少不良反應，實現用藥的個體化十分重要。

血液系統受累是SLE患者常出現的問題，表現為白細胞、血小板減少及貧血。本研究發現，血漿HCQ濃度>500 ng·mL-1治療組患者PLT顯著高于亞治療組，提示維持HCQ在較高的血藥濃度，可能對提高患者PLT，降低SLEDAI有益。目前，HCQ也已被應用于SLE合并血小板減少患者的治療[28]。HCQ作用機制復雜，可能通過靶向NADPH氧化酶等靶點及信號通路，抑制免疫細胞激活，減少IL-6、IFN-α等炎癥因子分泌[29]。筆者前期研究也顯示，HCQ主要通過細胞色素P450(cytochrome P450，CYP)3A4、CYP2C8、CYP3A5在肝代謝，患者血漿HCQ濃度和不良反應的特異性可能分別與CYP2C8 rs10882521和rs10882526位點的基因多態性有關[30]。本研究收集分析53例SLE患者的臨床數據，結果顯示亞治療組患者的AST、ALP水平高于治療組，結合筆者對HCQ體內代謝及代謝產物的研究[30]，提示患者肝內藥物代謝的多樣性可能影響血漿HCQ濃度，造成用藥個體差異，具體機制有待進一步探索。

SLE和RA等自身免疫性疾病患者，常需使用HCQ長期維持治療，用藥后可通過檢測患者血漿HCQ濃度，及時調整劑量或更換藥物，縮短患者達到緩解的時間，預測疾病發作情況，減少患者門診隨訪費用和因不良反應增加的治療費用，提高對疑難雜癥的治療水平，增加就診人次，也能提高床位周轉率。因此，這項研究具有重要的臨床應用意義，并對改善治療成本和提高社會效益起到積極作用。